專利名稱：使用飛行時間型二次離子質量分析法的探針載體的分析方法
技術領域：
本發明涉及使用飛行時間型二次離子質量分析法的探針載體的分析方法、具體講涉及通過飛行時間型二次離子質量分析法，對以矩陣狀固定于探針載體上的探針狀態進行分析的方法，例如使固定了多個核酸探針的探針載體表面上的矩陣成像，或對構成該矩陣的核酸探針進行定量分析的方法。另外，本發明涉及例如使用在基板上以矩陣狀配置了很多核酸探針的所謂核酸芯片的靶核酸檢測、分析方法。
背景技術：
作為探針載體例子的DNA芯片、RNA芯片等核酸芯片已經可以用于基因組解析、或基因表達解析等目的中，而這些解析結果預期可以對癌、遺傳病、生活習慣病、傳染病等診斷、預后予測、治療方針的決定等提供重要的指標。
核酸芯片的制作方法中幾種方法已為人們所知。如果以DNA芯片為例說明的話，有在基板上使用光刻(蝕)法逐個地合成DNA探針的方法(美國專利第5405783公報等)、或將預先合成的DNA或cDNA(互補DNA)供給到基板上進行結合的方法(美國專利第5601980公報、特開平11-187900號公報、Science Vol.270，467，1995等)為代表的的DNA芯片制作法。
一般來說，通過其中的任一個方法都可制作核酸芯片，將該芯片與以檢測為目的的核酸，所謂的含有靶核酸的溶液置于雜交條件后，通過某個手段檢測核酸芯片上核酸探針與該靶核酸有無形成雜交體，達到所期望的目的。
此時，為了保證解析的可靠性、即定量性、再現性，重要的是要知道與存在于各矩陣的核酸探針或與核酸探針形成雜交體的靶核酸或雙方的量，即密度。另外，了解實際以什么樣的矩陣形狀(形狀、大小、狀態)存在(成像)從確保定量性、再現性的觀點考慮也很重要。
另外，就象下面特別敘述的那樣，當在用于芯片制作的基板不存在用來表示矩陣位置的物理地址時，如果通過例如噴墨法用將探針溶液以微小液滴供給的那樣手法制作芯片，由于沒有物理地址，存在著通過檢測手段不知道分析芯片的哪一部分的問題。這樣情況下，需要通過采用的檢測手段本身對矩陣位置顯影。
然而，芯片上的核酸探針或核酸探針與靶核酸的雜交體由于從原理上講是以單分子膜水平存在的，對于這些分析基本上需要極高靈敏度的表面解析技術。
作為這樣高靈敏度的表面解析技術，已知有對核酸探針和/或靶核酸進行同位素標記的方法，但由于手法繁雜、危險，需要特殊的施設、裝置等理由，所以大多不是一般常用的。
作為其他的方法，考慮了對核酸探針和/或靶核酸進行熒光標記的方法，實際一般使用對靶核酸進行熒光標記，即所謂的熒光雜交法，但存在著熒光色素的穩定性、斷開、熒光色素對基板表面的非特異吸附等問題，有時還存在核酸探針和雜交體的量的把握的課題。
其他作為一般的高靈敏度表面分析手段，還有使用FT-IR(傅立葉變換紅外分光)法的ATR法、XPS(X線光電子分光)法等，但無論哪一種方法都不能說是對于核酸芯片上的雜交體的定量分析、或成像用有充分的靈敏度。特別是作為核酸芯片的基板使用一般的玻璃時，例如在FT-IR(ATR)存在起因玻璃的吸收的影響、在XPS中存在過載的影響等，不能說是有效的分析手段。
作為另一個高靈敏度表面分析手段，通過激光共振離子化法(RISResonance Ionization Spectroscopy)的DNA檢測方法已經由美國專利第5821060號公報公布。該方法通過照射相當于由樣品表面放出的注目元素的離子化能的波長的激光束，將當該元素離子化，進行檢測，作為使元素由樣品表面放出的手段，公布了使用激光束的方式、使用離子的方式，但存在著只能進行特定元素的檢測的問題。
另外，作為另一個高靈敏度表面分析手段，有動態的二次離子質量分析法(dynamic-SIMS)，該手法在二次離子生成的過程中，但由于有機化合物分解至小的碎片離子、或粒子，由質譜得到的化學結構信息缺乏，不適用例如與核酸有關物質的那樣有機物的分析。
而作為同樣的二次離子質量分析法的一個手法，人們已知的飛行時間型二次離子質量分析(TOF-SIMS)法是用于研究固體樣品的最表面存在什么樣的原子或分子的分析方法，具有以下所述的特長。即、具有109原子/cm2(相當于最表面1原子層的1/105的量)的極微量成分的檢測能力，可適用于任一種有機物、無機物，可以測定表面存在的所有元素或化合物，可以進行來自存在于樣品表面的物質的二次離子成像。
以下，對該方法的原理進行簡單說明。
在高真空中，如果將高速離子束(一次離子)照射到固體樣品表面，由于濺射現象，表面的構成成分釋放到真空中。此時由于電場作用將發生的帶有正或負電荷的離子(二次離子)聚束到一個方向，在離開一定距離的位置進行檢測。在濺射時，對應于樣品表面的組成帶有各種各樣質量的二次離子產生，由于越輕的離子飛行速度越快，反之，越重的離子飛行速度越慢，通過對從二次離子發生之后直至被檢測的時間(飛行時間)進行測定，可以分析產生的二次離子的質量。
以往的dynamic-SIMS中，如上所述，離子化時由于有機化合物一直分解至小的碎片離子或粒子，由質譜得到的化學結構信息缺乏，而TOF-SIMS，由于一次離子照射量極少，有機化合物以保持其化學結構的狀態被離子化，由質譜可以了解有機化合物的結構。由于只有在固體樣品表面的最外側產生的二次離子釋放到真空中，所以可以獲得樣品最表面(深數程度)的信息。
TOF-SIMS裝置大致分為sector型和reflectrone型的兩種類型。這些分析方法的差別之一是固定被分析樣品的電極夾的電接地方法。在sector型中，在裝置的機構上通過對上述電極夾外加數kV的正或負的電壓，將二次離子導入質量分析計，而在reflectrone型中電極夾被接地，通過對二次離子引出電極外加數kV至數10kV的正或負的電壓，將二次離子導入質量分析計。
在TOF-SIMS法中，多采用正的一次離子，不管一次離子的極性如何，正的二次離子和負的二次離子都要發生。不管一次離子極性如何，在一般的測定條件下，通過一次離子照射發生二次電子，由于該二次電子的發生量比一次離子量多，結果被分析樣品的表面容易帶正電，該帶電電荷如果過量(所謂的過載狀態)就會給測定帶來麻煩。此時，如果考慮裝置構成，使用sector型裝置測定絕緣物的負的二次離子時可以獲得帶最大正電(由于發生的二次電子全部朝著外加上述正電壓的二次離子引出電極)。
為了中和上述帶正電，sector型、reflectrone型的兩種類型往往都裝備帶電中和用的脈沖型電子槍。所謂利用該電子槍的具體的帶電中和方法指的是一次離子(サブ～數nsec脈沖)照射、正或負的二次離子飛行時間計測后，直至照射下一次離子脈沖為止的期間內，使來自上述脈沖型電子槍的電子線向被分析樣品照射一定時間。另外，在上述電子線照射被分析樣品的期間，向sector型中的樣品電極夾外加電壓，以及向reflectrone型中的二次離子引出電極外加電壓都被停止、被接地。
通過該方法，上述的帶正電被抵消(或解除)，往往可以進行絕緣物的分析，由于與上述說明同樣的理由，在使用sector型裝置的絕緣物測定中，測定負的二次離子時由于易帶最大正電，所以帶電中和的界限此時最窄。反之為了避免過載，使用樣品電極夾電接地的reflectrone型的裝置比使用sector型裝置(一般來說)更有利。特別是被分析樣品導電率低時(換而言之，電阻率高，或介電率高)、例如對于玻璃等，reflectrone型更適合于測定。
另外，無論reflectrone型、還是sector型，由于TOF-SIMS法是靈敏度非常高的分析方法，所以過載的影響小，例如可以對金基板上以單分子膜水平形成的寡核苷酸進行分析(Proceeding of the12thInternational Conference on Secondary Ion Mass Spectrometry951，1999)。在該文獻中，記載了固定于基板的DNA以及PNA通過TOF-SIMS法進行的分析結果，結果表明作為通過TOF-SIMS法檢測的碎片離子，對于DNA探針可舉如來自磷酸主鏈的PO2-和PO3-離子，來自堿基(胸腺嘧啶-H)-離子，另外對于PNA探針，仍然是(胸腺嘧啶-H)-離子。
然而，將上述TOF-SIMS法作為檢測手段，通過使用作為一般用的方法的DNA芯片檢測靶DNA，如果優選獲得所期望的基因信息，由于(1)如果用TOF-SIMS法只能檢測表面附近的極薄的層；以及(2)由探針DNA和靶DNA生成的碎片離子種類是同一種類的這二點理由，就會出現不能特異檢測靶DNA的雜交體有無的問題。
作為解決這樣問題的手段，有將PNA(肽核酸)結合于固相上做成探針，與靶核酸形成雜交體的方法(J.C.Feldner et alSIMS XIII國際會議；2001年11月11日～16日、奈良)。通過該方法，肽核酸在堿基部分雖然與DNA相同，但由于沒有磷酸主鏈，所以如果來自磷酸主鏈的碎片離子能檢測，那么PNA探針與靶核酸的雜交體形成就可以被確認。
然而由于肽核酸價格高，使用以肽核酸作為探針的芯片獲得基因信息費用高，可以說尚未實用。而以DNA作為探針時，由于PO2-、PO3-離子的離子化效率都比較高，可與所有核苷酸結合，所有檢測本身比較容易，包括以PNA作為探針的情況，核酸探針中隨機含有4種堿基時，如果要檢測堿基的碎片離子，從數目上是不利的，另外由于離子化效率低，檢測本身往往比較困難。因此，期盼以往技術中沒有的、檢測效率高和對可進行定量檢測的碎片離子進行檢測的靶核酸的標記方法。
作為這樣的碎片離子的檢測方法，特開昭61-11665號公報記載了有關向通過電泳法、液相層析法、高速凝膠過濾法進行分子量分離的核酸碎片導入S、Br、I等非金屬元素、或、Ag、Au、Pt、Os、Hg等金屬元素之后，設置利用原子吸光分析法、等離子體發光分析法、或質量分析法對這些元素進行鑒定的手段的核酸堿基檢測裝置，但有關質量分析裝置的具體記載、特別是鹵素原子向核酸的導入方法沒有記載。
另一方面，從另外觀點看芯片上核酸雜交體的量的把握，實際需要對作為核酸探針領域形成的矩陣本身進行分析，作為特開平11-187900號公報中一例記載的DNA芯片的制作方法的將預先合成的DNA探針溶液利用噴墨法吐出到基板表面使其結合時，沒有了解基板上矩陣(結合吐出的DNA的點)的位置的手段，對于這樣的情形，優選通過TOF-SIMS法，對點上的探針或雜交體進行成像，對成像的點的碎片離子進行分析。然而，在上述特開平11-187900號公報中沒有那樣的記載，而在特開昭61-11665號公報中雖然提及上述那樣的質量分析法，但有關通過TOF-SIMS法對芯片上的雜交體成像方法和靶核酸的量的分析完全沒有記載。
即，期盼以往技術中沒有的、進一步改善的檢測效率和對可定量檢測的碎片離子可進行檢測的探針和/或靶物質的檢測方法。
發明內容
本發明目的在于提供可以更正確地進行固定于探針載體的探針狀態的分析、例如配置位置的成像或其量的分析的探針載體分析方法。
本發明的另一個目的在于提供可以正確地進行使樣品與探針載體反應的測定用樣品中形成的探針與靶物質的結合體，更具體講，核酸探針與靶核酸的雜交體形成的、例如配置位置的成像或其量的分析的測定用樣品的分析方法。
本發明的方法只要是作為可識別對方形成復合體的物質，無論那一方都可固定于載體，對任一方或雙方導入離子化效率高的標記、例如鹵素原子作為標記，都可以適用。作為所述的物質的例子，可舉抗原、抗體、酶等蛋白質、與酶特異結合的底物、或相互互補的核酸等。
本發明人等利用上述TOF-SIMS，對在電阻率比較高的載體上的面積比較大的部分的核酸探針與靶核酸的雜交體的成像和量的把握時的課題進行研究的結果，完成以下的發明。
即本發明涉及的對探針和/或可與該探針特異結合的靶物質進行檢測的方法，其特征是具有準備表面配置了上述探針和/或與該探針特異結合的上述靶物質的基板的工序；以及通過飛行時間型二次離子質量分析法(TOF-SIMS)對上述基板表面進行測定的工序，對上述探針或上述靶物質用可生成經該探針或該靶物質的碎片化不被生成的碎片離子的標記物質進行標記。
本發明能夠提供可以對固定在探針載體上的探針和/或該探針與靶物質的結合體(核酸時，核酸探針與靶物質的雜交體)的有無形成，以探針或雜交體被固定在載體的狀態，進行其配置位置的成像或其量的分析的方法。
本發明涉及的分析方法還具有以下各個構成。
本發明涉及的測定用樣品的分析方法，是在對使樣品與在載體上固定探針的多個區域各自獨立配置成矩陣狀的探針載體反應得到的分析用樣品進行分析的方法中，其特征在于，將與上述探針可特異結合的樣品中靶物質用鹵素原子標記，通過飛行時間型二次離子質量分析法(TOF-SIMS)測定該鹵素原子，檢測上述探針與上述靶物質的結合體有無形成。
通過上述構成，可以提供對使樣品與固定了探針的探針載體反應的測定用樣品中形成的探針與靶物質的結合體(核酸的情況，核酸探針與靶物質的雜交體)有無形成，可以以探針或雜交體被固定在載體上的狀態正確進行例如其配置位置的成像或其量的分析的測定用樣品的分析方法。
另外，本發明涉及的探針載體的分析方法，是利用飛行時間型二次離子質量分析法對在探針固定區域中很多探針以矩陣狀配置在載體上的探針載體進行分析的方法，其特征在于，是用鹵素原子標記上述探針，檢測該鹵素原子的碎片離子，分析上述探針的狀態。
通過本發明的上述構成，可以更正確地進行固定于探針載體的探針狀態、例如配置位置的成像及其量的分析。
即通過上述構成，利用飛行時間型二次離子質量分析法，通過對探針載體上鹵素標記核酸探針的鹵素原子進行分析，在進行核酸探針的成像的同時可以進行量的把握。
另外，本發明涉及的核酸芯片上的核酸分析方法，作為多個核酸探針以矩陣狀配置在基板上的核酸芯片的分析方法，是在包括使上述核酸探針與該靶核酸雜交，構成雜交體，于該狀態下同時對上述核酸探針和上述靶核酸進行分析的工序的分析方法中，其特征在于，對上述核酸探針和上述靶核酸分別用既定數的不同物質預先進行標記，通過利用飛行時間型二次離子質量分析法對各個標記物質進行分析，對被標記的上述核酸探針和被標記的上述靶核酸進行分析。
此時，上述標記物質只要不是構成核酸探針的物質，也不是構成靶核酸的物質就可以。具體來說，作為上述標記物質，最好選擇可以發生與來自構成核酸探針的物質的二次離子、以及來自構成靶核酸的物質的二次離子有明顯區別的二次離子的物質。
通過具有上述構成的分析方法，利用飛行時間型二次離子質量分析法，對于在核酸芯片上形成雜交體的探針核酸和靶核酸，通過分別用另外的標記物質、例如鹵素原子預先進行標記，形成雜交體后，借助起因于標記的各個標記物質的二次離子的測定，可以在對探針核酸和靶核酸一個一個地進行成像的同時進行量的分析。
圖1A和1B是表示實施例2中成像的結果的圖，圖1A表示使用序列編號1、79Br-離子的結果，圖1B表示使用序列編號1、81Br-離子的結果。
圖2A和2B是用于說明成像用一次離子照射中的照射方法的圖，圖2A表示照射點的連續形式照射，圖2B表示非連續形式照射，圖2B中的各個編號表示照射點的照射順序。
圖3是表示實施例2中成像結果的圖，圖3A表示使用序列編號1、79Br-離子的結果，圖3B表示使用序列編號1、81Br-離子的結果，圖3C表示使用序列編號2、79Br-離子的結果，圖3D表示使用序列編號2、81Br-離子的結果；圖3E表示使用序列編號3、79Br-離子的結果；而圖3F表示使用序列編號4、81Br-離子的結果。
圖4A、4B和4C表示實施例2中成像結果的圖，圖4A表示利用F-離子、圖4B表示利用79Br-離子、圖4C表示利用81Br-離子的成像。
圖5表示根據實施例2的定量分析結果，將進行雜交后的核酸探針的標記F-離子、靶DNA的標記79Br-離子以及81Br-離子的各測定量相對于對點在核酸芯片上的核酸探針溶液中核酸探針濃度作圖后的曲線。
圖6表示根據實施例3的定量分析結果，將進行雜交后的核酸探針的標記F-離子、靶DNA的標記79Br-離子以及81Br-離子的各測定量相對于對與核酸芯片上核酸探針雜交的檢體溶液中靶DNA濃度作圖后的曲線。
具體實施例方式
在本發明中，可以使用可生成經探針或靶物質的碎片化不被生成的碎片離子的標記物質標記的探針和/或靶物質對探針載體上固定的探針或與該探針特異結合的靶物質的狀態、例如配置位置或其量進行分析。
具體來說，可以利用飛行時間型二次離子質量分析法(TOF-SIMS)對來自離子化效率高的物質、最好是來自鹵素原子的離子碎片進行檢測。
即，當利用TOF-SIMS法進行探針載體的成像和分析時，探針載體上的探針和/或靶物質最好是用既定數的鹵素原子標記，通過TOF-SIMS法對鹵素原子的碎片離子進行檢測、分析。
上述探針和/或上述靶物質，其特征是用可生成經該探針和/或靶物質的碎片化不被生成的碎片離子的標記物質標記的。
具體來說，可以采用以下構成。
① 當利用TOF-SIMS法進行雜交體的成像和分析時，靶物質最好是用既定數的鹵素原子標記，通過TOF-SIMS法對鹵素原子的碎片離子進行檢測、分析。
② 通過用飛行時間型二次離子質量分析法(TOF-SIMS)檢測來自標記在探針的鹵素原子的離子碎片進行固定于載體上的探針狀態、例如配置位置或其量的分析。即，當利用TOF-SIMS法進行探針載體的成像和分析時，探針載體上的探針最好是用既定數的鹵素原子標記，通過TOF-SIMS法對鹵素原子的碎片離子進行檢測、分析。
③ 當使用TOF-SIMS法進行上述雜交體形成時的成像和定量分析時，對探針核酸和靶核酸分別用既定數的不同物質進行標記，對該不同物質的碎片離子通過TOF-SIMS法進行檢測、分析。此時利用的標記物質如果與構成探針核酸、靶核酸的物質、核酸等構成要素不同，可以明確將來自標記物質的二次離子和起因于核酸的碎片離子區別開最好。另外，通過將探針核酸、靶核酸各個的標記物質數做成既定數，可從量上把握各個核酸。
作為本發明中的標記物質的例子，沒有限定，如可舉氟、氯、溴、碘等鹵素原子。
由于鹵素原子離子化效率比較高，所有如果利用其碎片離子，預期在檢測靈敏度提高的同時，通過降低一次離子強度，過載影響也可以相應地部分排除，與下面敘述的方法并用可以在電阻率高的基板上進行大面積的成像。
本發明中使用的標記物質在TOF-SIMS分析中，最好是與探針和靶物質含有的碎片相比離子化效率高的物質。另外，對探針和靶物質雙方進行標記時，可以用各個不同的標記物質進行標記。
另外，通過用既定數的鹵素原子進行標記，特別應用于核酸時，可以解決只檢測上述的核酸固有碎片離子時的問題，而且可以進行更高的定量分析。
還有，通過用既定數的鹵素原子進行標記，可以解決只檢測上述的核酸固有碎片離子時的問題，而且可以進行更高的定量分析。
用鹵素原子進行的標記數沒有特別限定，對于標記的位置、標記方法也適用，而且只要是不妨礙后續的探針和靶物質的結合體的形成(對于核酸，雜交體的形成(雜交))，可以使用任一方法。
實際上，對一個核苷酸標記一個位置是現實的，其意思可以說是在用鹵素原子進行標記時，標記的既定數優選為從1直至上述探針核酸和靶核酸的核苷酸數的任一個數，例如、核酸是合成寡核苷酸時，考慮到標記的人工、花費、鹵素原子的離子化效率的高低等，以1～5個更好。
另外，利用象PCR法那樣地酶催化延伸反應，想要導入標記時，對于標記為熒光色素那樣比較大的分子，由于立體障礙，標記的導入數存在上限。另外標記是鹵素原子時，不會引起顯著的立體障礙，例如作為延伸反應使用的核酸堿基單元，如果使用鹵素修飾體，在延伸產物中，也可以對一類堿基(例如腺嘌呤)全部進行標記。因此，標記選擇鹵素原子時，在定量把握標記數的同時，從靈敏度、標記導入方法方面看也是優選的。
使用TOF-SIMS法時，氟、氯、溴、和碘各原子的各個二次離子可以高靈敏度檢測，就象下面敘述的方法，由于可將上述4種鹵素原子導入靶核酸，所以這些鹵素原子適合用于本發明。
固定于載體上的探針識別特定靶物質，可與該物質形成結合體，對于核酸，核酸探針通過含有的互補序列可與靶核酸特異結合。固定于載體上的探針可以與特定靶物質特異結合，本發明方法從原理上講不僅核酸也可以應用于可用鹵素原子標記的物質、例如抗原、抗體、酶等蛋白質、或與酶特異結合的底物等。
在本發明中，對于核酸探針向載體的固定可以利用眾所周知的方法，作為固定在載體上的探針的一個例子，如在由含有可與靶核酸雜交的堿基序列的寡核苷酸等構成的核酸探針一部分根據需要通過含有借助于銜接物與載體的結合部，在與載體的結合部中含有與載體表面連接的構造的探針。另外，這樣構成情況中的與載體的結合部在核酸探針分子內的位置只要是在不損傷所期望的雜交反應的范圍內，就沒有特別限定。
本發明中的探針載體是在所定間隔，以矩陣狀等配置固定了探針的獨立區域、例如多個點狀點的載體，所以該形態中包括探針陣列、微芯片、核酸芯片等。
另外，探針具有可與載體表面結合的結構，優選探針向載體上的固定通過這個可結合的結構進行。此時，探針含有的可與載體表面結合的結構優選是通過導入氨基、巰基、羧基、羥基、酸鹵化物(鹵甲酰基；-COX)、鹵化物(-X)、氮丙啶、馬來酰亞胺基、琥珀酰亞胺基、異硫氰酸基、磺酰氯基(-SO2Cl)、醛基(甲酰基；-CHO)、肼以及碘乙酰胺等有機官能基中的至少1種的處理形成。
另外，根據探針側與載體結合需要的結構，對載體表面實施必要的處理、例如通過實施在載體表面形成巰基用的馬來酰亞胺基、氨基用的環氧基、醛基或N-羥基琥珀酰亞胺基等，可以通過共價鍵固定探針。
另外，如果考慮到其穩定性，優選探針通過共價鍵與基板表面結合。
作為探針和靶物質的組合，可舉如從核酸探針和靶核酸的組合、抗原、抗體、酶等蛋白質、與酶特異結合的底物等選擇的可形成結合體的組合。
對本發明中使用的核酸探針沒有特別限定，只要是可識別靶核酸，無論什么樣的都可以，優選是DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互補DNA)、cRNA(互補RNA)、(來自cDNA的)PCR擴增產物中的一個，最好是將由他們中的至少1種構成的核酸探針固定于載體上。
作為本發明使用的靶核酸，如果考慮到后述的用鹵素原子的標記方法，優選是DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互補DNA)、cRNA(互補RNA)、(來自cDNA的)PCR擴增產物中的一個，可以將含有由他們中的至少1種構成的靶核酸的樣品作為分析對象。作為靶核酸無論是合成核酸，還是來自動物、人、植物、微生物等的天然核酸都可以。
本發明中作為測定用樣品(與樣品反應后進行必要處理的探針載體以下作為代表主要用“核酸芯片”說明)的成像方法，將一次離子對著核酸芯片表面具有特定面積的部分，以具有對該面積相對小的面積的點通過脈沖方式依次照射，利用對由于該脈沖照射發生的二次離子按照一次一次的脈沖照射從飛行時間上進行質量分析的方法，但此時，作為排除過載的影響的方法，按照非連續的形式進行一次離子的脈沖照射，將得到的各個質量分析結果按照一次脈沖非連續照射的形式再構成后進行圖像化是極其有效、優選的方式。
以往，當利用TOF-SIMS法進行核酸芯片的成像和核酸芯片上的核酸的量的分析時，考慮到點的大小、或檢測的效率等，成像區域的面積優選例如300μM×300μM以上，作為用于DNA芯片制作的基板，使用經常使用的玻璃等電阻率比較高的基板，為了獲得必要的析象清晰度將一次離子束直徑定為5μM，使得象電視機的顯象機那樣在一定的方向使離子束對300μM×300μM的范圍進行依次掃描(光柵掃描)，得到圖像，但過載影響大，不能獲得良好的圖像。
因此，在本發明中，作為核酸芯片的成像方法，使用對于該核酸芯片表面具有的特定面積的部分，以具有比該面積相對小的面積的點通過脈沖方式依次照射一次離子，對于每一個脈沖照射都對通過該脈沖照射發生的二次離子通過飛行時間進行質量分析的方法，此時，作為排除過載的影響的方法，按照非連續的形式進行一次離子的脈沖照射，按照一次脈沖照射的形式對得到的各個質量分析結果進行再構成、圖像化是極其有效而且優選的方式。
此時作為非連續的形式的例子，可舉如隨機的圖形或基于特定程序的非連續的形式。
如果用簡單模型對這樣的連續形式和非連續形式進行說明的話，如下所述。
圖2A表示照射中的連續形式的例子，圖2B表示非連續形式例子。此時，例如如果將矩形的區域以5×5個的點，作為照射一次離子脈沖的話，就象圖2A表示的那樣，從一個點到鄰接的點依次照射所有的點的形式是連續的形式，另外就象圖2B表示的那樣，照射一個點，下一個點轉向至少不鄰接的點，依次照射全部的點的形式是非連續的形式。
非連續的形式也可以隨機形成，此時對鄰接的點進行連續照射的可能性也存在，也可以形成預先按照特定程序的非連續形式。作為優選的圖形如上所述，可以適當采用對鄰接的點不連續進行照射，或對鄰接的行、列存在的點不連續進行照射等規則。
作為鹵素原子，可舉如氟、氯、溴、以及碘原子，利用TOF-SIMS法可以檢測氟、氯、溴、以及碘原子的各碎片離子。這4種鹵素原子例如可以通過以下說明的方法導入到核酸探針。
也可以通過一個一個的鹵素原子對探針載體各矩陣的核酸探針進行標記。
另外，對于靶物質是否存在還不清楚的樣品，用鹵素原子對樣品進行標記處理，使它與探針反應，當樣品中存在探針可以識別的靶物質時，由于這些結合體可以形成，利用對該結合體標記的鹵素原子可以進行檢測。
利用TOF-SIMS法可以檢測氟、氯、溴、以及碘各原子的碎片離子，還有，由于利用下面敘述的方法也可以將上述4種鹵素原子導入靶核酸，在本發明中可以有效利用這些鹵素原子。
對于鹵素原子向靶核酸的導入方法也沒有特別限定，作為人們了解的方法的例子，如使鹵素原子與靶核酸的核苷酸堿基結合的方法，在本發明應用該方法也很合適。此時，鹵素原子在該靶核酸與核酸探針形成雜交體時，優選結合在不妨礙該靶核酸的雜交體形成的位置。這樣的位置是嘧啶堿基的5位、嘌呤堿基的8位。但是靶核酸所有的核苷酸堿基的鹵素原子不一定都要結合在這個位置。
對于鹵素原子向核酸探針的導入方法也沒有特別限定，作為人們了解的方法的例子，如使鹵素原子與核酸探針的核苷酸堿基結合的方法，在本發明應用該方法也很合適。此時，鹵素原子在該核酸探針與靶核酸形成雜交體時，優選結合在不妨礙該核酸探針的雜交體形成的位置。這樣的位置是嘧啶堿基的5位、嘌呤堿基的8位。但是核酸探針所有的核苷酸堿基的鹵素原子不一定都要結合在這個位置。
作為鹵素原子向核酸探針或靶核酸的導入的更具體方法的例子，上述核酸為合成DNA時，在用DNA自動合成儀合成DNA時，可以使用含有結合了鹵素原子的合成單元、即可舉使用具有以下結構式的2’-脫氧核苷-3’-亞膦酰胺的方法 (各式中、X表示鹵素原子、DMTO表示二甲氧基三苯甲基、iPr表示異丙基、CNEt表示2-氰乙基)。
另外，當上述核酸為合成RNA時，用RNA自動合成儀合成RNA時，可以使用結合了鹵素原子的合成單元、即核苷-3’-亞膦酰胺，作為所述的合成單元的例子，可舉如具有以下結構式的化合物。
(式中、X為鹵素原子(F、Cl、Br、或I)、DMTO為二甲氧基三苯甲基、iPr為異丙醇、CNEt為2-氰乙基、ME為甲基、TBDMS表示t-丁基二甲氧基硅烷基)。
另外，上述核酸是合成PNA時，在用PNA自動合成儀合成PNA時，使用結合了鹵素原子的合成單元、即核酸堿基結合肽類似物合適。
另外，作為上述核酸是cDNA時的鹵素原子導入法的例子，如通過逆轉錄酶對cDNA進行延伸合成時，可以使用結合了鹵素原子的2’-脫氧核苷-5’-三磷酸。
作為上述核酸是由基因組DNA誘導的DNA時的鹵素原子導入法的例子，如通過DNA聚合酶對該DNA進行延伸合成時，利用結合了鹵素原子的2’-脫氧核苷-5’-三磷酸的方法，上述核酸是cRNA時，鹵素原子向該cRNA的導入通過RNA聚合酶對該cRNA進行延伸合成時可以使用結合了鹵素原子的核苷-5’-三磷酸。
在上述各延伸反應也可以使用PCR反應、或RT-PCR(逆轉錄PCR)反應。此時象上述那樣通過延伸反應的核苷酸單體可以導入標記，另外在上述反應使用的引物的合成時也可以導入標記。
本發明中使用的核酸芯片的核酸探針或靶核酸種類沒有特別限定，可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互補DNA)、cRNA(互補RNA)、寡脫氧核苷酸、寡核糖核苷酸等。
作為本發明分析方法中可利用的標記物質的其他例子，如Au、Ag、Cu、Ni、Co、Cr、Al、Ta、Pt、Pd、Zn、Sn、Ru、Rh等金屬、或他們的絡合物，絡合物中包括有機(金屬)絡合物。有機金屬絡合物向核酸的導入法方法，例如可以采用Science，Vol.262，1025，1993記載的方法。
以下舉實施例，對本發明進行具體說明。這些實施例雖然是本發明的最好的實施方式的例子，但本發明并不限定于這樣的實施例。
(核酸探針芯片的制作)根據特開平11-187900號公報所述方法制作核酸探針芯片。
(1)基板清洗將25.4μm×25.4μm×1μm的合成石英基板放入槽中，于用純水稀釋到10％的超聲波清洗用洗劑(ブランソンGPIII)浸泡過夜。然后，于洗劑中進行20分鐘超聲波清洗，然后通過水洗除去洗劑。用純水涮后，于加有純水的容器中再進行20分鐘超聲波處理。然后將基板于預先加熱到80℃的1N氫氧化鈉水溶液浸泡10分鐘。進行流水水洗、純水清洗、提供該下面工序。
(2)表面處理將結合了氨基的硅烷偶聯劑、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷 KBM603(信越化學工業)的1重量％水溶液于室溫下攪拌2小時，對上述硅烷化合物分子內的甲氧基進行水解。然后將上述(1)得到的基板在室溫下于該溶液浸漬1小時后，用純水清洗，用氮氣吹基板的兩面，使其干燥。然后將基板在加熱到120℃的烘箱中烘烤1小時后，最終將氨基導入基板表面。
然后按照終濃度0.3mg/ml將N-馬來酰亞胺己酰氧琥珀酰亞胺(同仁化學研究所以下EMCS)2.7mg溶解于二甲基亞砜(DMSO)/乙醇的1∶1溶液。將進行了硅烷偶聯劑處理的石英基板在該EMCS溶液中于室溫下浸漬2小時，使經硅烷偶聯劑處理基板表面帶有的氨基與EMCS溶液的琥珀酰亞胺基反應。通過該階段在基板表面應當存在來自EMCS的馬來酰亞胺基。將從EMCS溶液取出的基板依次用DMSO和乙醇的混合溶劑以及乙醇進行清洗后、吹氮氣使其干燥。
(3)探針DNA的合成委托DNA合成業者(ベツクス)合成下記序列編號1的單鏈核酸(dT的40聚體)。另外在序列編號1的單鏈DNA 5’末端在合成時通過使用巰基修飾物(グレンリサ一チ公司)導入巰基(SH)基。脫保護、DNA的回收按照常規方法進行，另外在純化中使用HPLC。從合成一直到純化的一系列工序全部委托合成業者進行。
序列編號15′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′(4)利用熱噴墨打印機吐出DNA和向基板結合將上述序列編號1的各單鏈DNA按照8μM的濃度分別溶解于含有甘油7.5重量％、尿素7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％以及乙炔醇(商品名アセチレノ一ルEH；川研フアインケミカル公司制1重量％的溶液。將使用作為熱噴墨法一種的泡沫噴墨法的泡沫噴墨打印機BJF-850(佳能公司制)用的打印機頭BC-50(佳能公司制)改造成可吐出數100μl溶液，將該頭搭載到已經改造成可向上述石英基板上吐出的吐出繪圖機。將上述DNA溶液100μl注入到改造池部，將EMCS處理基板裝配到吐出繪圖機上，對板進行點印。點印時的吐出量為4pl/一滴，點印范圍為基板中央部10mm×10mm的范圍，以200dpi即127μM的間距吐出。在該條件下點印的點的直徑為約50μM。
點印結束后，將基板于加濕盒內靜置30分鐘，使玻璃板表面的馬來酰亞胺基與核酸探針末端的巰基反應。然后用純水清洗基板，保存在含有1M的NACl的50mM磷酸緩沖液(pH＝7.0、以下稱為溶液A)中。
(雜交以及通過TOF-SIMS進行的成像和分析)
(1)模型靶核酸的合成序列編號25′ A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3′ 首先合成對5’末端側的5個腺嘌呤堿基用溴原子實施了修飾的模型標記核酸(下記序列編號2、dA的40聚體)(ベツクス)。然后該5’末端側的5個溴修飾堿基用如下所示構造的8-溴-3’-脫氧腺苷亞膦酰胺在自動合成儀進行合成時導入。脫保護、DNA的回收按照常規方法進行，另外在純化中使用了HPLC。由合成到純化的一系列工序都委托合成業者進行。另外，序列中的A(Br)表示溴修飾脫氧腺苷。另外，已知作為修飾位置的腺嘌呤的8位是不妨礙雜交的位置。
(2)封閉和雜交將實施例1制作的芯片于室溫下在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的溶液A中浸漬3小時，對芯片表面進行封閉(以核酸等非特異的吸附為目的)后，在按照50nM濃度溶解了上述序列編號2的模型靶核酸的溶液A中浸漬，于45℃下雜交15小時。然后，用純水(室溫)淋洗后，吹氮氣干燥，在TOF-SIMS分析前保存在真空干燥器中。
(3)利用TOF-SIMS進行分析使用ION TOF社生產的TOF-SIMS IV對已雜交的DNA芯片進行成像和分析。
以下給出了裝置條件。
(一次離子)
一次離子25kV Ga+、隨機掃描方式一次離子的脈沖頻率2.5kHz(400μsec/發射)一次離子脈沖幅度1ns一次離子束直徑5μm(二次離子)對一次離子的照射圖形再構成的圖像二次離子檢測方式陰性測定領域300μm×300μm二次離子圖像的像素數128×128累計次數256(4)結果圖1A和1B示出了通過TOF-SIMS IV型裝置根據上述條件，對上述(2)中進行雜交的DNA芯片進行分析，由得到的數據對溴離子進行成像的結果。圖1A、1B分別是來自79Br-離子、81Br-離子的結果。
表1
表1表示由圖1A和1B得到的各1個點的計數的數。由圖1A和1B、以及表1可知在DNA芯片上形成的核酸探針和雜交體通過溴標記靶DNA的點的標記物質溴進行成像和量的把握。
(來自基因組的溴標記靶DNA的成像和分析)(1)來自基因組的靶DNA檢測用核酸芯片的制作在Nature Biotechnology Vol.18，438，2000中記載了用于檢測人口腔扁平上皮癌的二個細胞系、HSC4和HSC5的基因組DNA的外顯子7的變異的寡核苷酸芯片的制作以及使用該芯片，檢測由上述外顯子誘導的熒光標記DNA。
在本實施例中根據上述方法，制作寡核苷酸芯片，將標記由熒光換成溴合成DNA，再使用該DNA進行雜交。
以下就具體的步驟進行敘述。
(DNA探針的合成和芯片制作)序列編號35′HS-(CH2)6-O-PO2-O-GATGGGCCTCCGGTTCAT 3′與實施例1同樣合成含有與上述HSC4的外顯子7的堿基序列一部分(含有編號No.248的部分)互補的堿基序列，在5’末端帶有用于與基板結合的巰基的上述尾序列編號3的DNA，再使用該DNA，與實施例1同樣制作DNA芯片。
(2)來自基因組的溴標記DNA的合成序列編號4E7S5′-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT-3′(exon 7，sense)序列編號5E7A5′-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3′(exon 7，anti-sense) 5-氟-2′-脫氧尿苷三磷酸(Br-dUTP)首先，使用上述序列編號4、5的PCR引物(HSC4、HSC5都委托ベツクス合成)，通過PCR反應合成來自HSC4基因組的外顯子7部分。即，對于含有20ng基因組DNA和各0.4μM的有義引物、反義引物的50μl PCR混合物按照94℃(30秒)、60℃(45秒)的循環反復進行40次循環，進行PCR擴增。得到的擴增產物鏈長被設計為171核苷酸。
然后以擴增產物的一部分作為模板，使用0.2μM有義引物(上述序列編號4)和10μM量的上面給出其構造的一種溴標記核苷酸5-溴-2′-脫氧尿苷三磷酸(Sigma Aldrich Japan)，和其他三種核酸堿基進行SSPCR(單鏈PCR)。PCR循環為96℃(30秒)、50℃(30秒)、60℃(4分)、進行25次循環。另外，得到的溴標記單鏈DNA通過凝膠過濾進行純化。
(3)封閉和雜交將上述(1)制作的芯片用與實施例1同樣方法封閉后，用純水淋洗，用于以下雜交。將實施了封閉的芯片浸漬于含有按照10nM濃度溶解的來自上述(2)合成的基因組的DNA的20％甲酰胺的6×SSPE(0.9M-NaCl、60mM-NaH2PO4、6mM-EDTA)中，于80℃加熱10分鐘，然后于45℃下雜交15小時，然后用2×SSPE于55℃下進行清洗操作。接下來用純水(室溫)輕輕淋洗，吹氮氣干燥后、在TOF-SIMS分析前一直保存在真空干燥器中。
(4)通過TOF-SIMS進行成像和分析在與實施例2同樣的條件下雜交后DNA芯片用TOF-SIMS進行成像和分析。
表2只示出了得到的數值數據。
表2
由表2可知在由基因組誘導的實施了溴標記DNA的DNA芯片上的雜交通過TOF-SIMS可進行量的把握。
另外，通過與本實施例大致同樣的方法，由mRNA誘導的cDNA被鹵素原子標記以及通過TOF-SIMS進行成像和分析也是可能的。
(探針結合狀態的分析)首先用與實施例1同樣的操作進行(1)基板清洗和(2)表面處理。
(3)核酸探針DNA的合成委托DNA合成業者(ベツクス)合成下記序列編號6～8的各單鏈核酸。下記序列中、堿基T表示通常的2’-脫氧胸苷，另外UBr是5-溴-2′-脫氧尿苷，在合成時用以下所示亞膦酰胺體(グレンリサ一チ公司)導入。
另外，3’末端的U(Br)使用下面所示U(Br)結合CPG柱(グレンリサ一チ)導入。導入溴的尿嘧啶的5位不妨礙雜交。
而對于這些DNA的5’末端在合成時通過使用巰基修飾物(グレンリサ一チ公司)導入巰基(SH)。另外，脫保護、DNA的回收按照常規方法進行，在純化中使用HPLC。由合成直至純化的一系列工序都委托合成業者進行。
序列編號65′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTU(Br)3′
序列編號75′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTU(Br)U(Br)U(Br)3′序列編號85′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTU(Br)U(Br)U(Br)U(Br)U(Br)3′(4)利用熱噴墨打印機吐出DNA和向基板結合將上述序列編號6～8的各單鏈DNA按照8μM的濃度分別溶解于含有甘油7.5重量％、尿素7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％以及乙炔醇(商品名アセチレノ一ルEH；川研フアインケミカル公司制)1重量％的溶液。
用實施例1使用的吐出繪圖機，將有關各個DNA的上述各DNA溶液100μl注入到改造池部，將3枚EMCS處理基板裝配到吐出繪圖機上，將3種DNA溶液點印到各1枚基板上。點印時的吐出量為4pl/一滴，點印范圍為基板中央部10mm×10mm的范圍，以200dpi即127mm的間距吐出。在該條件下點印的點的直徑為約50μm。
點印結束后，將基板于加濕盒內靜置30分鐘，使玻璃板表面的馬來酰亞胺基與核酸探針末端的巰基反應。然后用純水清洗基板，保存在純水中。DNA結合基板(DNA芯片)在用TOF-SIMS進行分析之前，吹氮氣干燥，再于真空干燥器中進行干燥。
(通過TOF-SIMS進行成像和分析)(1)用ION TOF公司生產的TOF-SIMS IV對實施例4制作的DNA芯片進行成像和分析。以下一并給出了裝置條件。
(一次離子)一次離子25kV Ga+、隨機掃描方式一次離子的脈沖頻率2.5kHz(400μsec/發射)一次離子脈沖幅度1ns一次離子束直徑5μm(二次離子)對于一次離子的照射圖形再構成的像
序列編號4E7S5′-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT-3′(exon 7，sense)序列編號5E7A5′-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3′(exon 7，anti-sense) 5-溴-2’-脫氧尿苷三磷酸(Br-dUTP)首先，即在實施例3中使用上述序列編號4、5的PCR引物(HSC4、HSC5都委托ベツクス合成)，通過PCR反應合成來自HSC4基因組的外顯子7部分。
即，對于含有20ng基因組DNA和各0.4μM的有義引物、反義引物的50μl PCR混合物按照94℃(30秒)、60℃(45秒)的循環反復進行40次循環，進行PCR擴增。得到的擴增產物鏈長被設計為171核苷酸。
然后以擴增產物的一部分作為模板，使用0.2μM有義引物(上述序列編號4)和10μM量的上面給出其構造的一種溴標記核苷酸5-溴-2’-脫氧尿苷三磷酸(Sigma Aldrich Japan)，和其他三種核酸堿基進行ssPCR(單鏈PCR)。PCR循環為96℃(30秒)、50℃(30秒)、60℃(4分)、進行25次循環。另外得到的溴標記單鏈DNA通過凝膠過濾進行純化。而由有義引物延伸的鏈取代胸腺嘧啶堿基都變成了溴標記的尿苷。
② DNA芯片的制作取代EMCS處理的基板，將涂布了聚賴氨酸的載玻片(SigmaAldrich Japan)作為基板，通過與實施例4同樣的方法，用泡沫噴墨法吐出上述溴標記單鏈DNA制作DNA芯片。將吐出了DNA溶液的基板于保濕容器中放置2小時后，用純水清洗，然后用氮氣吹純水，進行干燥，再于100℃下加熱1小時，進行干燥后，在用TOF-SIMS進行分析之前保存在真空干燥器中。
③ 利用TOF-SIMS進行成像和分析在于實施例4和同樣的條件下，對②的DNA芯片用TOF-SIMS進行成像和分析。
表4只示出了得到的數值。
表4
由表4可知由從基因組誘導的實施了溴標記的DNA核酸探針構成的DNA芯片通過TOF-SIMS可進行量的把握。
利用與本實施例大致同樣的方法可以對由mRNA誘導的cDNA用鹵素原子進行標記和通過TOF-SIMS進行成像、以及定量分析。
(核酸探針陣列的制作)首先，按照與實施例1同樣的步驟，進行(1)基板清洗和(2)表面處理。
(3)探針DNA的合成委托DNA合成業者(ベツクス)，合成40堿基長的下記序列編號9的單鏈核酸(對于dT的35聚體，在其3’末端側連接5個5-氟-3’-脫氧尿苷U(F))。另外，在序列編號9的單鏈DNA的5’末端在合成時用巰基修飾物(グレンリサ一チ)導入巰基(SH)。DNA合成后，脫保護、DNA的回收按照常規方法進行，另外，在純化中使用了HPLC。從合成一直到純化的一系列工序全部委托合成業者進行。
另外，上述3’末端側的U(F)的導入用下面結構表示的亞膦酰胺(グレンリサ一チ)進行。
另外已知取代胸腺嘧啶導入的這個U(F)的氟取代位置5位對雜交沒有影響，因此，可進行與dT的40聚體同樣的雜交反應。
序列編號95’HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTU(F)U(F)U(F)U(F)U(F)T 3’(4)通過熱噴墨打印機吐出DNA和向基板結合將上述(3)所述的序列編號9的單鏈DNA分別按照終濃度10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、和0.625μM溶解于含有甘油7.5重量％、尿素7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％、以及乙炔醇(商品名アセチレノ一ルEH；川研フアインケミカル公司制)1重量％的溶液中。
用實施例1使用的吐出繪圖機，將上述DNA溶液數100μl注入到改造池部，將EMCS處理基板裝配到吐出繪圖機上，對EMCS處理表面進行點印。點印時的吐出量為4pl/一滴，點印范圍為基板中央部10mm×10mm的范圍，以200dpi、即127μm的間距吐出。在該條件下點印的點的直徑約50μm。
點印結束后、將基板于加濕盒內靜置30分鐘，使基板表面的馬來酰亞胺基與核酸探針5’末端的巰基(-SH)反應，使DNA探針固定。然后用純水清洗基板，保存在含有1M的NaCl的50mM磷酸緩沖液(pH＝7.0；上述溶液A)中。DNA結合基板(DNA芯片)在用TOF-SIMS進行分析之前，吹氮氣干燥，再于真空干燥器中進行干燥。
(雜交反應以及通過TOF-SIMS法進行成像和定量的分析)
(1)模型靶核酸的合成首先委托合成業者(ベツクス)合成對5’末端側的5個腺嘌呤堿基用溴原子實施了修飾的模型標記核酸(下記序列編號10、dA的40聚體)。然后該5’末端側的5個溴修飾堿基用如下所示構造的8-溴-3’-脫氧腺苷亞膦酰胺(グレンリサ一チ)，在自動合成儀進行合成時導入。脫保護、DNA的回收按照常規方法進行，另外，在純化中使用了HPLC。由合成到純化的一系列工序都委托合成業者進行。另外，序列中的A(Br)表示溴修飾脫氧腺苷。另外，已知作為修飾位置的腺嘌呤的8位是不妨礙雜交的位置。
序列編號105’ A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’ (2)封閉和雜交將實施例7制作的DNA芯片于室溫下在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的溶液A中浸漬3小時，對芯片表面進行封閉(以核酸等非特異的吸附為目的)，用溶液A淋洗。然后，在按照50nM濃度溶解了上述序列編號10的模型靶核酸的溶液A中浸漬，于45℃下雜交15小時。然后，用純水(室溫)淋洗后，吹氮氣干燥，在TOF-SIMS分析前保存在真空干燥器中。
(3)通過TOF-SIMS進行分析使用ION TOF公司生產TOF-SIMS IV型裝置對進行了雜交的DNA芯片進行成像和分析。
以下一并給出了測定中使用的裝置、條件。
(一次離子)一次離子25kV Ga+、隨機掃描方式一次離子的脈沖頻率2.5kHz(400μsecc/發射)一次離子脈沖幅度1ns一次離子束直徑5μm(二次離子)有關一次離子的照射圖形再構成的成像二次離子檢測方式陰性測定領域300μm×300μm二次離子圖像的像素數128×128累計次數256(4)結果用TOF-SIMS IV型裝置于上述條件下對在上述(2)進行了雜交的核酸探針濃度5μM的DNA溶液制作的DNA芯片進行分析，根據得到的數據對于來自探針DNA的氟離子和來自靶DNA的溴離子分別進行二維成像的結果如圖4A～4C所示。圖4A是對氟(F-)離子的成像圖像，圖4B和4C分別是對79Br-離子、81Br-離子的成像圖像。
圖5是就實施例7所述的通過不同的核酸探針濃度的DNA溶液制作的5種DNA芯片，雜交后分別就各芯片上的一個點，用TOF-SIMS測定檢測的氟離子、79Br-離子和81Br-離子的計數的數對使用的核酸探針濃度作的圖。
通過本發明的分析方法由圖4A～4C判定通過利用分別對核酸芯片上的核酸探針、以及與核酸探針形成雜交體的靶核酸進行修飾的修飾原子，在雜交體形成后可以同時而且分別成像。雖然沒有給出圖示，但通過對圖像累加，含有核酸探針和靶核酸兩方的雜交體本身也可成像。另外，來自各核酸分子的來自磷酸主鏈的碎片、來自核酸堿基的碎片等也可一并觀察到。
另外，圖5表明對于各個點，有關被固定的探針核酸量、以及靶核酸量可以同時且一個一個地進行定量是有把握。
(利用靶DNA濃度存在差別的檢體進行雜交的成像和定量分析)對于用實施例7所述的探針核酸濃度10μM的DNA溶液制作DNA芯片，在分別含有500nM、50nM、5nM、1nM、和0.2nM各個濃度的實施例8所述溴修飾靶DNA的條件下，分別進行雜交，利用TOF-SIMS法進行成像和定量分析。
圖6表示根據定量分析結果，將通過TOF-SIMS測定檢測的氟離子、79Br-離子、和81Br-離子的計數的數對靶DNA濃度作圖的結果。由圖6可知DNA芯片上的探針濃度(氟離子的計數的數)對于各基板大致一定，另外根據使用的靶核酸濃度，雜交體的量發生變化由溴離子的計數的數定量是有把握。
(對來自基因組的靶DNA雜交后的成像以及定量分析模型系)(1)來自基因組的靶DNA檢測用核酸芯片的制作根據實施例3說明的Nature Biotechnology Vol.18，438，2000所述熒光標記DNA檢測方法，制作實施了氟標記的寡核苷酸芯片，另外合成實施了溴標記的模型靶寡核苷酸，使兩者雜交。
以下按照具體的步驟進行敘述。
(1)氟標記DNA探針的合成和DNA芯片的制作作為氟標記核酸探針，利用與實施例7所述同樣的合成法制作含有與上述HSC4的外顯子7含有的堿基序列的一部分(含有編號No.248的部分)互補的堿基序列，而且在5’末端導入了用于與基板結合的巰基，另外取代胸腺嘧啶，結合共計5個氟標記脫氧尿苷的下記序列編號11的DNA。再用該序列編號11的DNA，通過與實施例7同樣的步驟制作DNA芯片。在芯片制作時使用的溶液中探針DNA濃度為10μM。
序列編號115’HS-(CH2)6-O-PO2-O-GAU(F)GGGCCU(F)CCGGU(F)U(F)CAU(F)G3’(2)來自基因組的溴標記模型靶DNA的合成和雜交作為溴標記模型靶DNA通過與實施例8所述同樣的合成法制作含有與上述序列編號11的DNA堿基序列互補的序列，取代腺苷結合了共計5個溴修飾脫氧腺苷的下記序列編號12的標記模型DNA。將該溴標記模型靶DNA和上述(1)所述DNA芯片同樣置于與實施例8同樣的雜交條件(靶DNA濃度50nM)下。然后，利用TOF-SIMS法進行分析。
序列編號123’CTA(Br)CCCGGA(Br)GGCCA(Br)A(Br)GTA(Br)C 5’(3)利用TOF-SIMS法進行成像和定量分析在與實施例8同樣的條件下，進行封閉和雜交，雜交后的DNA芯片通過TOF-SIMS進行成像和定量分析。
表5給出了由定量分析結果得到的氟離子、79Br-離子以及81Br-離子的計數的數。
表5
表5示出了在與實施例8和實施例9的同樣雜交、分析條件下的分析結果大致同樣的結果，通過本發明的分析方法，與實際的探針DNA和靶DNA同樣，通過對混合了4種堿基的堿基序列組也分別實施鹵素標記，確認也可以對探針DNA和靶DNA一個一個地進行檢測、分析。
(來自基因組的靶DNA雜交后的成像和定量分析)在本實施例就使用實施例10制作的來自基因組的靶DNA的分析用DNA芯片的實際進行來自基因組的靶DNA的成像和定量分析，舉例說明。
(1)來自基因組的溴標記靶DNA的制備序列編號4E7S5’-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT-3’(exon 7，sense)序列編號5E7A5’-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3’(exon 7，anti-sense) 5-溴-2’-脫氧尿苷三磷酸(Br-dUTP)首先，使用上述序列編號4、5的PCR引物(HSC4、HSC5都委托ベツクス合成)，通過PCR反應合成來自HSC4基因組的外顯子7部分。即、對于含有20ng的基因組DNA和各0.4μM的有義引物、反義引物的50μl的PCR混合物按照94℃(30秒)、60℃(45秒)的循環反復進行40次循環，進行PCR擴增。得到的擴增產物鏈長被設計為171核苷酸。
然后以擴增產物的一部分作為模板，使用0.2μM有義引物(上述序列編號12)和10μM量的上面給出其構造的一種溴標記核苷酸5-溴-2’-脫氧尿苷三磷酸(Sigma Aldrich Japan)，和其他三種核酸堿基進行ssPCR(單鏈PCR)。PCR循環為96℃(30秒)、50℃(30秒)、60℃(4分)、進行25次循環。另外，得到的溴標記單鏈DNA通過凝膠過濾進行純化。而由有義引物延伸的鏈取代胸腺嘧啶堿基都變成了溴標記的尿苷。
(2)封閉和雜交將實施例10制作的DNA芯片用與實施例7同樣的方法進行封閉后，用純水淋洗，用于以下雜交。
將實施了封閉的DNA芯片浸漬于按照10nM濃度溶解了(2)中合成的來自基因組的溴標記單鏈DNA的含有20％甲酰胺的6×SSPE(0.9M-NaCl、60mM-NaH2PO4、6mM-EDTA)中，于80℃下加熱10分鐘，然后于45℃下雜交15小時。然后，用2×SSPE于55℃下進行清洗操作。然后，用純水(室溫)輕輕淋洗，對進行了雜交的DNA芯片吹氮氣干燥后，在用TOF-SIMS法進行分析之前保存在真空干燥器中。
(3)利用TOF-SIMS法進行成像和定量分析在與實施例8同樣的條件下，對雜交后DNA芯片用TOF-SIMS進行成像和定量分析。
表6給出了由定量分析結果得到的氟離子、79Br-離子、81Br-離子的計數的數。
表6
表6表明通過應用本發明分析方法，在備有氟標記探針的DNA芯片上進行由基因組誘導，實施溴標記的靶DNA雜交后，利用TOF-SIMS法對固定于DNA芯片上的探針DNA和靶DNA雙方可一個一個地進行檢測、分析。
另外，通過與本實施例大致同樣的步驟對由mRNA誘導的cDNA也通過進行實施用鹵素原子的標記的核酸探針的制作以及芯片化、和進行實施其他鹵素標記的靶DNA的PCR制備，雜交后對于核酸探針和靶DNA也可以通過TOF-SIMS法進行個別的成像和分析。
序列表<110> Tadashi，OKAMOTOHiromitsu，TAKASEHiroyuki，HASHIMOTO<120> 使用飛行時間型二次離子質量分析法的探針載體的分析方法<130> CFO17354WOCN<150> JP 2002-190010<151> 2002-06-28<150> JP 2002-191391<151> 2002-06-28<150> JP 2002-191414<151> 2002-06-28<160> 11<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 用于雜交試驗的探針序列<400> 1tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40<210> 2<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 靶的序列
<220>
<221> modified_base<222> (1)..(5)<223> 溴化的腺嘌呤<400> 2aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40<210> 3<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針的序列<400> 3gatgggcctc cggttcat 18<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 靶的序列<400> 4actggcctca tcttgggcct 20<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 靶的序列<400> 5tgtgcagggt ggcaagtggc 20
<210> 6<211> 39<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針的序列<220>
<221> modified_base<222> (39)..(39)<223> 溴化的尿嘧啶<400> 6tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttu 39<210> 7<211> 41<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針的序列<220>
<221> modified_base<222> (39)..(41)<223> 溴化的尿嘧啶<400> 7tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttuu u41<210> 8<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針的序列
<220>
<221> modified_base<222> (36)..(40)<223> 溴化的尿嘧啶<400> 8tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttuuuuu 40<210> 9<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針的序列<220>
<221> modified_base<222> (35)..(39)<223> 氟化的尿嘧啶<400> 9tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttuuuuut 40<210> 10<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> Sequence for Target Substance<220>
<221> modified_base<222> (1)..(5)<223> 溴化的腺嘌呤<400> 10
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40<210> 11<211> 19<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針的序列<220>
<221> modified_base<222> (3)..(3)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (9)..(9)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (14)..(14)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (15)..(15)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (18)..(18)<223> 氟化的尿嘧啶<400> 11gaugggccuc cgguucaug 19
權利要求
1.檢測方法，是用于對配置在基板上的探針和/或可與該探針特異結合的靶物質進行檢測的檢測方法，其特征是具有準備表面配置了所述探針和/或與該探針特異結合的所述靶物質的基板的工序；以及利用飛行時間型二次離子質量分析法測定所述基板表面的工序，對所述探針或所述靶物質通過可生成由該探針和/或該靶物質的碎片化不能生成的碎片離子的標記物質進行標記。
2.分析用樣品的分析方法，在使樣品與在載體上固定探針的多數區域各自獨立配置成矩陣狀的探針載體反應，對由該反應得到的分析用樣品(載體)進行分析的方法中，其特征是用鹵素原子對可與所述探針特異結合的、樣品中的靶物質進行標記，通過利用飛行時間型二次離子質量分析法測定該鹵素原子來檢測由所述反應得到的所述探針與所述靶物質有無形成結合體。
3.探針載體的分析方法，是利用飛行時間型二次離子質量分析法對固定了探針的多數區域在載體上配置成矩陣狀的探針載體進行分析的方法，其特征是用鹵素原子標記所述探針，檢測該鹵素原子的碎片離子來分析所述探針的狀態。
4.權利要求2或3所述的分析方法，其中，所述探針和/或所述靶物質是核酸。
5.核酸芯片上的核酸的分析方法，是多個核酸探針以矩陣狀配置在基板上的核酸芯片的分析方法，在具有使所述核酸探針與樣品中靶核酸雜交，構成雜交體，在該狀態下同時對所述核酸探針和所述靶核酸進行分析的工序的方法中，其特征是對所述核酸探針和所述靶核酸分別用既定數的不同的標記物質預先進行標記，通過利用飛行時間型二次離子質量分析法分析所述各個標記物質，進行被標記的所述核酸探針和被標記的所述靶核酸的分析。
6.權利要求5所述的方法，其特征是作為所述標記物質選擇使用可以發生可明確區別為來自構成所述核酸探針的物質和來自構成所述靶核酸的物質的二次離子的二次離子的物質。
7.權利要求1～6中任一項所述的分析方法，其中，利用所述飛行時間型二次離子質量分析法進行的分析是量的分析。
8.權利要求6所述的分析方法，其中，所述標記物質是鹵素原子，所述核酸探針和靶物質核酸分別用各自規定數的不同鹵素原子標記。
9.權利要求1～8中任一項所述的分析方法，其中，將一次離子做成具有與所述載體或核酸芯片的分析對象區域的面積相比相對小的面積的點，對該分析對象區域全體依次進行脈沖照射，對通過該脈沖照射發生的二次離子按照在分別的每一個脈沖照射時的飛行時間進行質量分析而圖像化。
10.權利要求9所述的分析方法，其中，按照非連續的形式進行一次離子的脈沖照射，根據一次離子脈沖照射的非連續的形式對得到的各個質量分析結果進行再構成而圖像化。
11.權利要求10所述的分析方法，其中，所述非連續的形式是隨機的形式。
12.權利要求11所述的分析方法，其中，所述非連續的形式是特定的程序化的形式。
13.權利要求2～4和8～12中任一項所述的分析方法，其中所述鹵素原子是氟、氯、溴和碘原子中的任一種。
14.權利要求8所述的分析方法，其中，對所述核酸探針和靶核酸進行標記的鹵素原子的既定數是分別從1開始至構成所述核酸探針和靶核酸的核苷酸數的任一個數。
15.權利要求14所述的分析方法，其中，所述鹵素原子的既定數是1～5個。
16.權利要求4和8～15中任一項所述的分析方法，其中，所述鹵素原子結合在所述核酸探針和/或靶核酸的核苷酸的堿基上。
17.權利要求16所述的分析方法，其中，所述鹵素原子在所述核酸探針與所述靶核酸形成雜交體時，結合在不妨礙與所述靶核酸的該雜交體形成的位置。
18.權利要求17所述的分析方法，其中，所述鹵素原子結合在嘧啶堿基的5位或嘌呤堿基的8位。
19.權利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是合成DNA，所述鹵素原子向該合成DNA中的導入在用DNA自動合成儀合成該合成DNA時，使用作為結合所述鹵素原子的合成單元的2’-脫氧核苷-3’-亞膦酰胺進行。
20.權利要求18所述的分析方法，其中，結合了所述鹵素原子的合成單元是用以下結構式表示 (各式中、X表示鹵素原子、DMTO表示二甲氧基三苯甲基、iPr表示異丙基、CNEt表示2-氰乙基)。
21.權利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是合成RNA，所述鹵素原子向該RNA中的導入是在用RNA自動合成儀合成該RNA時，使用作為結合了所述鹵素原子的合成單元的核苷-3’-亞膦酰胺進行的。
22.權利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是合成PNA，所述鹵素原子向該PNA中的導入是在用PNA自動合成儀合成該PNA時，使用作為結合了所述鹵素原子的合成單元的核苷-3’-亞膦酰胺進行的。
23.權利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是cDNA，所述鹵素原子向該cDNA的導入是在使用逆轉錄酶延伸合成該cDNA時，使用結合了所述鹵素原子的2’-脫氧核苷-5’-三磷酸進行的。
24.權利要求14所述的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是由基因組DNA誘導的DNA，鹵素原子向該DNA中的導入是在通過DNA聚合酶延伸合成該DNA時，使用結合了所述鹵素原子的2’-脫氧核苷-5’-三磷酸進行的。
25.權利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是cRNA，所述鹵素原子向該cRNA中的導入是在通過RNA聚合酶延伸合成該cRNA時，使用結合了所述鹵素原子的核苷-5’-三磷酸進行的。
26.權利要求14記載的分析方法，其中，所述核酸探針和/或靶核酸是由cDNA誘導的DNA，鹵素原子向該DNA中的導入是在通過DNA聚合酶延伸合成該DNA時，使用結合了所述鹵素原子的2’-脫氧核苷-5’-三磷酸進行的。
27.權利要求9所述的方法，其中，對所述核酸探針和所述靶核酸分別進行標記的所述各標記物質中的至少一個物質是金屬或金屬化合物。
28.權利要求22所述的方法，其中，所述金屬或金屬化合物中的金屬元素選自Au、Ag、Cu、Ni、Co、Cr、Al、Ta、Pt、Pd、Zn、Sn、Ru、和Rh。
29.權利要求22所述的方法，其中，所述金屬化合物是有機金屬絡合物。
30.權利要求29所述的方法，其中，所述有機金屬絡合物是含有選自Au、Ag、Cu、Ni、Co、Cr、Al、Ta、Pt、Pd、Zn、Sn、Ru、和Rh的金屬元素的絡合物。
全文摘要
本發明提供可以正確進行配置在載體上的探針狀態或該探針與靶核酸有無形成雜交體的分析、例如配置位置的成像或其量的分析的測定用樣品的分析方法。對使樣品與探針載體反應的在測定用樣品中形成的核酸探針的狀態或該探針與靶核酸有無形成雜交體在通過可生成由該探針和/或靶物質的碎片化不能生成的碎片離子的標記物質進行標記的狀態下，通過利用飛行時間型二次離子質量分析法進行測定檢測。
文檔編號G01N23/225GK1672040SQ0381810
公開日2005年9月21日 申請日期2003年6月26日 優先權日2002年6月28日
發明者岡本尚志, 高瀨博光, 橋本浩行 申請人:佳能株式會社