用于治療tweak相關病癥的方法

專利名稱：用于治療tweak相關病癥的方法
技術領域：
本發明涉及用于治療TWEAK相關病癥的方法和試劑，該病癥包括心臟、肝臟、腎臟、肺、脂肪、骨骼肌、神經、骨、軟骨、皮膚、胃腸道、胰腺、生殖器官和結締組織疾病。本發明還涉及用于鑒定治療TWEAK相關病癥的TWEAK的激動劑或拮抗劑的方法。此外，本發明涉及表達編碼TWEAK多肽或其片段、類似物或突變體的外源DNA的轉基因動物，以及用這種動物來鑒定TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。本發明還涉及用于診斷基于TWEAK表達的疾病的方法。本發明還涉及用TWEAK多肽、激動劑或拮抗劑來影響祖細胞的細胞增生和分化的方法。
背景技術：
腫瘤壞死因子家族成員的配體因其結構與TNF-α相似而如此命名，是各種過程如炎癥反應、細胞免疫和凋亡中的重要成分。TNF配體可能作為II型膜結合蛋白通過直接細胞與細胞接觸而局部起作用，或作為具有自分泌、旁分泌或內分泌功能的分泌蛋白而起作用。TNF家族成員通過其C末端的細胞外結構域結合TNT受體(TNF-R)成員。各種TNF家族成員包括TNF、淋巴毒素(LT)、Fas、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX-40、TRAMP、CAR-1、TRAIL、GITR、HVEM、osteoprotegrin、NGF、TRAIN、Kay(BAFF)、APRIL和TWEAK(TNF相關而誘導細胞死亡的能力弱。
該細胞因子受體家族的特定特征在于富含半胱氨酸的細胞外結構域，最早通過兩種不同的TNF受體的分子克隆來顯示。該家族的基因編碼糖蛋白，特征為I型跨膜蛋白具有細胞外配體結合結構域，單一的跨膜結構域和參與激活細胞功能的胞質區域。富含半胱氨酸的配體結合區域具有一個緊密結合的二硫鍵連接的核心結構域，根據特定的家族成員，該核心結構域重復出現多次。絕大部分的受體具有四個結構域，雖然可能少至1個或多達6個。
TNF家族成員在調控免疫系統中起作用，控制細胞存活和分化，以及在急性宿主防御系統如炎癥中起作用。本領域一直在嘗試操作TNF家族成員來產生治療性效果，這可能提供控制疾病的獨特方法。例如，該家族的一些配體能夠直接誘導許多被轉化的細胞的程序性死亡，如LT、TNF、Fas配體和TRAIL。Fas和可能TNF以及CD30受體的活化能夠在未被轉化的具有免疫調控功能的淋巴細胞中誘導細胞死亡。
誘導編程細胞死亡的能力是多個TNF家族成員的重要和被深入研究的特性。Fas介導的凋亡似乎在外周和可能在胸腺中起調控自身反應淋巴細胞的作用。此外，TNF和CD30系統與T細胞和大細胞退行發育的淋巴瘤細胞系的存活相關。這種細胞系對TNF、Fas或LT-β受體信號響應的死亡具有凋亡的特征。
TNF家族的配體抗原根據它們誘導細胞死亡的能力被分成三類。首先，TNF、Fas配體和TRAIL能夠有效地在許多細胞系中誘導細胞死亡，其受體最可能具有極好的規則的死亡結構域。大概DR-3的配體(TRAMP/WSL-1)也屬于這一類。接著是如TWEAK、CD30配體和LTalb2等配體，其引起僅限于少數細胞的較為微弱的死亡信號。在這些系統中進行的研究已經證明，存在分開的較微弱的死亡信號機制。最后，存在不能有效地遞送死亡信號的成員。可能所有類別的配體都對一些細胞類型產生抗增生作用，結果誘導細胞分化，如CD40。
總之，死亡是由位于TNF受體的胞質一側的死亡結構域集聚后引發的。這些死亡結構域協調各種信號傳導成分的組裝，引起caspase級聯活化。一些受體缺乏規則的死亡結構域，如LTb受體和CD30，但是能夠誘導細胞死亡，盡管較為微弱。相反，通過其他路徑如CD40發送信號是維持細胞存活所必需的。還需要進一步鑒定和表征TNF家族成員的功能，從而便于開發用于TNF家族相關疾病的新治療方法。
TWEAK在篩選雜交到促紅細胞生成素探針的RNA中被分離。Chicheportiche等，J.Biol.Chem.27232401-32410(1997)。小鼠和人的肽具有異乎尋常的高度保守性，包括在受體結合結構域中具有93％氨基酸同一性。TWEAK被證實高效地從細胞中分泌，在許多組織中豐富地被表達，包括心臟、大腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、淋巴結、胸腺、闌尾和外周血液淋巴細胞。
一種已知的TWEAK受體是Fn14，生長因子調節的立即早期反應基因，其降低對細胞外基質的細胞附著和減弱血清刺激的生長和遷移(Meighan-Mantha等，J.Biol.Chem.27433166-33176(1999))。Fn14已經被證明會被FGF、小牛血清和氟波醇酯(phorbol ester)處理誘導，并且在心臟、腎臟、肺、皮膚、骨骼肌、卵巢和胰腺組織中，以及在肝細胞癌模型和其他癌細胞系中以相對高的水平被表達，在正常肝臟組織中以較低水平被表達。
TWEAK與許多生物學過程相關。例如，用IFN-γ和TWEAK處理的HT29細胞被證明發生凋亡；盡管TWEAK誘導凋亡的能力是微弱的，并且僅少數細胞類型易感。Chicheportiche等，J.Biol.Chem.27232401-32410(1997)。相反，TWEAK已經被證明在不依賴VEGF的路徑中誘導血管發生和內皮細胞增生。Lynch等，J.Biol.Chem.2748455-8459(1999)。星細胞被TWEAK特異地結合和刺激。TWEAK能夠滲入發炎的大腦中來影響星細胞的行為。暴露于TWEAK的星細胞分泌大量IL-6和IL-8，并上調ICAM-1表達。Saas等，GLIA 32102-107(2000)。
TWEAK還與免疫系統的調節相關。在用IFN-γ刺激時，單核細胞迅速地表達TWEAK，抗TWEAK的抗體部分地抑制它們對人鱗狀細胞癌的細胞的細胞毒性活性。抗TWEAK和抗TRAIL的抗體的結合幾乎完全抑制細胞毒性。Nakayama等，J.Exp.Med.1921373-1379(2000)。相反TWEAK的mRNA在用脂多糖(LPS)處理的小鼠中迅速消失，脂多糖是免疫炎癥反應的誘導物。此外，在小鼠模型的自體免疫溶血性貧血和系統性紅斑狼瘡中，TWEAK的mRNA也減少。這些數據表明，下調TWEAK的表達是急性和慢性炎癥中的重要事件。Chicheportiche等，Biochem.Biophys.Res.Comm.279162-165(2000)。
當前，本領域缺乏對哪些病癥或疾病與TWEAK表達和功能相關的完整了解，包括TWEAK在炎癥和非炎癥病癥中的作用。
發明概述本發明涉及TWEAK對于促進各種病理狀況的嚴重性和進展中的作用，包括多種組織和器官系統的疾病。這種病理狀況包括急性心臟損傷，慢性心力衰竭，非炎癥性充血性心肌病，充血性心力衰竭，肝臟上皮細胞增生，肝細胞死亡，肝臟纖維變性，肝細胞液泡化，其他肝臟損傷，膽管病癥，包括膽管增生，炎癥性腎臟病癥，如多病灶(multifocal)炎癥性、非炎癥性腎臟病癥，如腎小管腎病，腎小管增生，腎小球囊腫，腎小球腎病，Alport綜合癥，腎小管液泡化，腎透明管型(kidney hyaline cast)，腎纖維變性和炎癥性肺病，本發明建立了TWEAK分子與某些心臟、肝臟、腎臟和肺疾病之間的因果關系。在此公開的本發明還建立了TWEAK與肝臟組織、腎小管、皮膚細胞、脂肪細胞、骨骼肌、軟骨和骨的祖細胞，以及結締組織細胞類型，如骨髓中的基質細胞，以及成纖維細胞的行為之間的聯系。
在一個實施方案中，本發明涉及用于治療TWEAK相關病癥的方法，所述病癥即其中TWEAK的受體如FN14被表達的各種疾病，損傷情況或組織的其他病理狀況。這些病癥包括纖維變性，心肌病，和腎臟、肺、肝臟、皮膚、骨骼肌、脂肪代謝(如肥胖)、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經組織(包括神經退行性病變)，軟骨、骨和結締組織的疾病。在優選實施方案中，TWEAK相關病癥實質上是非炎癥性的。在另一個優選實施方案中，本發明涉及通過干擾TWEAK與其分子受體之間的相互作用來治療TWEAK相關病癥的方法。
在另一個實施方案中，本發明涉及TWEAK激動劑或拮抗劑，和包含它們的用于治療TWEAK相關病癥的藥物組合物。這種TWEAK激動劑或拮抗劑(即抑制劑)可能是抗TWEAK抗體或其衍生物；抗TWEAK受體抗體或其衍生物；TWEAK多肽片段；TWEAK多肽類似物；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽片段；TWEAK受體多肽類似物；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；有機化合物；和無機化合物。
在另一個實施方案中，本發明涉及TWEAK激動劑或拮抗劑和用于治療需要組織再生或替換的宿主的藥物組合物。還涉及TWEAK激動劑或拮抗劑在體內或體外調節祖細胞(progenitor)的群體的行為中的用途。該祖細胞可以是肝臟細胞類型、腎小管、心肌細胞、肺細胞類型、皮膚細胞類型、骨骼肌細胞類型、脂肪細胞、胃腸細胞類型、胰腺細胞類型、神經組織細胞類型、軟骨和骨細胞類型、結締組織細胞類型的前體(precursor)細胞，包括骨髓中的基質細胞和成纖維細胞。TWEAK激動劑或拮抗劑以及包含它們的藥物組合物可以被體內施用來促進在疾病或組織損傷狀況下的組織再生和替換，包括但不限于毒素、病毒、化學治療或放射物導致的損害，和遺傳性或退化性異常。在另一個實施方案中，TWEAK激動劑或拮抗劑和它們的藥物組合物可以與用干細胞或祖細胞的細胞治療聯合，用于再生組織和器官系統。在另一個實施方案中，干細胞或祖細胞群體可以在體外用TWEAK激動劑或拮抗劑以及它們的組合物擴增。通過使用TWEAK激動劑或拮抗劑擴增的祖細胞群體可以被移植到需要再生或替換組織的宿主中。
在其他實施方案中，本發明涉及鑒定用作TWEAK相關病癥治療的治療劑的TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。在另一個實施方案中，本發明涉及表達編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉基因動物。本發明的另一個實施方案包括TWEAK作為疾病的分子標志的用途。


附圖1顯示TWEAK在充血性心肌病中的作用。A.FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠表現為右側心房和心室栓塞，并且嚴重擴張。B.顯示正常的心臟作為比較。
附圖2TWEAK在心臟中過度表達導致心臟重塑(cardiac remodeling)。在用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染成年C57BL/6小鼠后第20天，在10X放大倍數下觀察用蘇木精/曙紅染色的心臟的橫截面，與腺病毒-GFP對照構建體比較。
附圖3TWEAK誘導膽管和卵形細胞(oval cell)增生，如與2周齡和7月齡的非轉基因(NTg)同窩小鼠相比，FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠中所顯示。
附圖4在與非轉基因(NTTg)同窩小鼠相比時，在FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠中，對膽管上皮和卵形細胞標記特異的A6 mAb的染色增加，這表明TWEAK誘導膽管和卵形細胞增生。
附圖5在FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠的門脈區中存在大的、卵形細胞，這表明TWEAK誘導卵形細胞增生。
附圖6與非轉基因(NTg)同窩小鼠相比，TWEAK在FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠中引起肝細胞液泡化。
附圖7用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染的小鼠中的血清TWEAK水平。
附圖8TWEAK在肝臟中過度表達導致肝細胞死亡和膽管增生。在用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染成年C57BL/6小鼠后第3和11天，在20X放大倍數下觀察用蘇木精/曙紅染色的肝臟的橫截面，與腺病毒-GFP對照構建體比較。
附圖9在CCl4引起肝臟損傷后，TWEAK受體Fn14在小鼠中被誘導。在正常小鼠肝臟和CCl4損傷的肝臟中原位雜交Fn14 mRNA，表明如果在正常的成年肝臟中有任何可檢測的表達，也是微弱的，而在損傷后顯著地誘導Fn14表達。蘇木精/曙紅(H & E)染色的切片展示相應的正常健康的肝臟和CCl4損傷的肝臟組織。
附圖10在膽管結扎的小鼠模型中，膽管上皮細胞中Fn14表達被上調，用于原位雜交的直接抗Fn14的反義mRNA探針的染色增加表明了這一點。蘇木精/曙紅(H&E)染色的切片展示在明視野顯微鏡下的相應切片。
附圖11在2周齡、8周齡和7月齡時，與非轉基因(NTg)小鼠的腎臟比較的FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠腎臟的橫截面。這些結果表明在8周齡和7月齡的TWEAK Tg小鼠腎臟中腎小管嗜堿性，腎小球中的儲尿腔(urinaryspace)擴張，即腎小球囊腫，在7月齡具有近端嗜堿性腎小管。
附圖12具有H&E染色的FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠的腎臟的橫截面。A.表示鄰近的近端腎小管上皮嗜堿性的腎小球腎病。B.節段性腎小球膜的細胞過多(segmental mesangial hypercellularity)、腎小囊上皮肥大、和腎小囊增厚。
附圖13來自兩只FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠腎臟的連續切片，用H&E(上面)和擴增的細胞核抗原(PCNA)(下面)染色。嗜堿性腎小管對應于表達PCNA的腎小管，即增生的腎小管。
附圖14FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠腎臟的連續切片，用H&E、得自T.Purpureas的凝集素(近端腎小管的標記)和得自A.Hypogaea的凝集素(遠端腎小管的標記)標記。結果表明嗜堿性腎小管不表達任何上皮標記。
附圖15TWEAK在腎臟中過度表達導致腎小管增生和腎小球腎病。在用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染成年C57BL/6小鼠后第11天，在20X和40X放大倍數下觀察用蘇木精/曙紅染色的腎臟的橫截面，與腺病毒-GFP對照構建體比較。
附圖16TWEAK mRNA在整個成年野生型小鼠腎臟中廣泛的表達。在5X倍數下觀察蘇木精染色的腎臟的橫截面，或在用正義或反義TWEAK探針原位雜交后，在暗視野顯微鏡下觀察。
附圖17Fn14 mRNA在野生型小鼠腎臟的外層髓質的近端腎小管中被表達。在5X倍數下觀察蘇木精染色的腎臟的橫截面，或在用正義或反義Fn14探針原位雜交后，在暗視野顯微鏡下觀察。
附圖18TWEAK在腎臟纖維變性中的作用，得到Alports腎臟中的Fn14mRNA上調的支持。Fn14 mRNA水平上升的倍數以兩只分別具有導致Alports疾病的突變的小鼠在4，5，6和7周齡與野生型動物比較來表示。mRNA水平通過與含有對應于一部分Fn14基因的核苷酸序列的基因芯片雜交來確定。在第4和7周，給出兩只小鼠中每只小鼠的重復結果(分別用小鼠1重復和小鼠2重復柱來表示)。在第7周，Fn14 mRNA在疾病被抑制的兩種情況下降低，即sTGF R-Fc處理和在VLA-1敲除的小鼠中(在附圖18中或者用sTGFβR-Fc處理的兩只單個小鼠(″sTGFbR處理″)或者兩只單個的Alport/VLA-1KO小鼠(″Alport/VLA-1KO″)表示。
附圖19在一種腎臟纖維變性小鼠模型，單側輸尿管阻塞(UUO)中用TWEAK拮抗劑處理顯著地降低腎臟纖維變性。三色-馬森(Trichrome-Masson)染色的石蠟腎臟切片上的藍色染色區域(纖維變性區域)的結構改變的量化表明，膠原質含量在AB.G11(抗TWEAK單克隆Ab)處理的腎臟樣本中下降到與在sTGF-βR-Ig陽性對照樣本中觀察的水平相似的水平。相反，同種型對照倉鼠抗體(HA4/8)處理的腎臟沒有顯示出腎臟纖維變性降低，與載體(PBS)處理的腎臟類似。
附圖20TWEAK轉基因在肺中引起肉芽腫性和淋巴組織細胞炎癥。A.用H&E染色的來自FL-TWEAK轉基因(Tg)小鼠肺的橫截面。B.用H&E染色的來自sTWEAK(Tg)小鼠肺的橫截面。
附圖21TWEAK mRNA在成年野生型小鼠的內襯于肺的支氣管和肺泡的細胞中被表達。在10X放大倍數下用蘇木精染色觀察肺的橫截面，或者在用正義或反義TWEAK探針原位雜交后在暗視野顯微鏡下觀察。
附圖22Fn14 mRNA在成年野生型小鼠的支氣管和肺泡中被表達。在10X放大倍數下用蘇木精染色觀察肺的橫截面，或者在用正義或反義Fn14探針原位雜交后在暗視野顯微鏡下觀察。
附圖23TWEAK在體外對3T3-L1細胞脂肪細胞分化的抑制作用。3T3-L1細胞被采用標準方法誘導來進行分化。在第0天，細胞不被處理、用對照試劑(重組的可溶性人CD40L-FLAG 100ng/ml)或100ng/ml各種形式的TWEAK(重組可溶性人TWEAK-FLAG、重組可溶性人TWEAK、Fc-人TWEAK)處理，以及地塞米松和胰島素，并且每天補充。在一個試驗組中，阻斷性抗TWEAK mAb AB.G11還與Fc-hTWEAK同時被加入。在第7天用Oil-red O染色細胞。
附圖24TWEAK在體外對肌細胞生成的抑制作用。C2Cl2成肌細胞在DMEM基礎生長培養液中生長到接近匯合，在第0天被轉移到含有2％馬血清的低血清分化培養液中來引發分化。細胞不被處理或在第0天用Fc-hTWEAK(100ng/ml)處理。使用相差顯微鏡來檢測肌管形成，在分化的第6天拍攝照片。在另一個試驗組中，Fn14-Fc或中和性抗TNF抗體與Fc-hTWEAK同時被加入，從而證明Fc-hTWEAK的抑制作用是TWEAK特異的，不是通過TNF調節。
附圖25TWEAK能夠結合到人間充質干細胞上。人間充質干細胞(hMSCs)用重組的的Fc-TWEAK蛋白培養，接著用PE-偶聯的山羊抗人Fc或山羊抗小鼠Fc第二抗體培養。Fc-TWEAK結合hMSCs的能力采用熒光激活細胞分選儀(FACS)分析測定。背景染色通過單獨用第二抗體染色(僅用第二抗體)來提供。
發明詳述除非本文特別指出，所用的與本發明有關的科技術語具有與本領域技術人員通常所理解相同的含義。此外，除非上下文另有規定，單數術語包括復數形式，而復數術語包括單數形式。一般地，本文所描述的細胞和組織培養物、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、病毒和蛋白質和核酸化學和雜交所用的相關命名和技術是本領域那些公知和常用的。除非特別指出，本發明的方法和技術通常按照本領域熟知的常規方法進行，這些方法被描述在本說明書全文中所引用和討論的各種概括或特定參考文獻中。參見，如Sambrook等Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow和Lane AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約(1990)，在此引入作為參考。酶促反應和純化技術按照生產商的說明進行，如本領域常規技術或本文所描述。與分析化學、合成有機化學、和醫學和藥物化學相關的所用命名，和實驗室操作和技術，是本領域熟知和通常使用的。標準技術被用于化學合成、化學分析、藥物制備、配制和呈遞，以及治療患者。
為了本文所描述的發明被更加充分地理解，給出如下的詳細描述。在本說明書中使用如下術語“抗體”是指完整的免疫球蛋白，或指其抗原結合部分，該部分可與完整抗體競爭而與抗原特異性結合。抗原結合部分可以通過重組DNA技術或通過酶促或化學裂解完整抗體來制備。抗原結合部分包括，例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗和含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，該部分免疫球蛋白足以賦予該多肽特異性結合抗原的能力。Fab片段是單價片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成；F(ab′)2片段是雙價片段，其包含在鉸鏈區通過二硫鍵連接的兩個Fab片段；Fd片段由VH和CH1結構域組成；Fv片段由VL和抗體的一個臂的VH結構域組成；和dAb片段(Ward等，Nature 341544-546，1989)由VH結構域組成。單鏈抗體(scFv)是其中VL和VH區域通過合成接頭配對來形成單價分子的抗體，這使得它們可以作為單一的蛋白鏈被制備(Bird等，Science 242423-426(1988)和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883，(1988))。雙抗(diabody)是二價的，雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單一多肽鏈上被表達，但是采用一個極短的接頭使得在同一條鏈上的兩個結構域不能配對，從而迫使該結構域與另一條鏈的互補結構域配對，產生兩個抗原結合位點(參見，如Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)，和Poljak等，Structure 21121-1123(1994))。一個或多個CDRs被共價地或非共價地結合到分子上來使之成為一種免疫粘附素。免疫粘附素可納入CDR(s)作為較大的多肽鏈的部分，可以共價地將CDR(s)連接到另一個多肽鏈上，或者可以非共價地納入CDR(s)。CDR使得免疫粘附素特異性地結合到特定的目標抗原上。
抗體可以具有一個或多個結合位點。如果存在一個以上結合位點，該結合位點可以與另一個相同或不同。例如，天然的免疫球蛋白具有兩個相同的結合位點，單鏈抗體或Fab片段具有一個結合位點，而“雙特異性”或“雙功能”抗體具有兩個不同結合位點。
“抗體譜(antibody repertoire)”是指動物或人中的每種不同的抗體種類的總和。抗體譜的多樣性來自，例如，免疫球蛋白基因重組、免疫球蛋白基因結合多樣性、末端脫氧轉移酶活性和體細胞超變(somatic hypermutation)。
“嵌合抗體”是從其原始形式被改變來包含來自另一個蛋白質的氨基酸序列的抗體。嵌合抗體保留至少一部分原始抗體氨基酸序列，通常是包含抗原結合區域(Fab)的那部分。嵌合抗體的例子包括但是不限于，雙特異性抗體和與其他非免疫球蛋白序列的融合。
“順式調控元件”通常是指在特定條件下或在特定細胞中調控基因序列的可誘導的或組成型表達。表達控制序列調控的細胞過程的例子包括但是不限于，基因轉錄、蛋白質翻譯、信使RNA剪接、免疫球蛋白同種型轉換、蛋白質糖基化、蛋白質裂解、蛋白質分泌、細胞內蛋白質定位和細胞外蛋白質自歸巢(homing)。
“細胞因子”一般是指免疫系統的信號分子。細胞因子包括但是不限于白細胞介素(IL)、轉化生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴毒素(LT)、干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞CSF、粒細胞CSF和遷移抑制因子。
“胚胎干細胞(ES)”是指多潛能(pluripotent)或多能(multipotent)細胞，當被注射到胚泡中時，其能夠形成許多或所有出生前、出生后或成年動物的組織。從胚泡注射得到的動物通常被稱作“嵌合”動物，由于其體細胞和/或生殖細胞通常來源于胚泡供體和被注射的ES細胞。ES細胞的重要特性在于其能夠形成動物的生殖細胞系，產生被傳遞到嵌合動物后代的任何期望的可遺傳的特征。無限增生的ES細胞是生產具有靶向內源基因序列破壞的動物或者生成具有外源基因的動物(轉基因)的有力工具。
“表達控制序列”是指在特定條件下或在特定細胞中組成型表達或可誘導表達基因序列的序列。表達控制序列調控的細胞過程的例子包括但是不限于，基因轉錄、蛋白質翻譯、信使RNA剪接、免疫球蛋白同種型轉換、蛋白質糖基化、蛋白質裂解、蛋白質分泌、細胞內蛋白質定位和細胞外蛋白質自歸巢。
“融合蛋白”是指包含兩種或多種蛋白質的氨基酸序列的嵌合蛋白。典型地，融合蛋白產生自本領域熟知的體外重組技術。但是，融合蛋白可以從體內交換或其他重組事件中產生。
“人免疫球蛋白分子”是指由人免疫球蛋白基因序列編碼的免疫球蛋白。免疫球蛋白基因序列可以在任何細胞或動物，人或非人類中被表達。
“人源化抗體”是衍生自非人類的物種的抗體，其中重鏈和輕鏈的框架區和恒定區中特定的氨基酸被突變，以在人中避免或消除免疫反應。可選擇地，人源化抗體可以通過將來自人抗體的恒定區融合到非人類物種的可變區上來制備。如何制備人源化抗體的實例可以在美國專利6,054,297、5,886,152和5,877,293中發現。
“炎癥”或“炎癥性疾病”是指由細胞和組織反應組成的基礎病理過程，在對損傷，異常刺激或生物學試劑響應時在血管和鄰近組織中發生。同樣地，“非炎癥性病癥”或“非炎癥性疾病”是指實質上是非炎癥的任何病癥或疾病，如本文所公開的。
“分離的蛋白質”或“分離的多肽”一般是指蛋白質或多肽，從其起源或來源來講(1)不是天然地結合在天然狀態下與其相伴的相關成分上，(2)不含有來自同一物種的其他蛋白，(3)由來自不同物種的細胞表達，(4)在天然條件下不存在。因此，嵌合地合成，在無細胞的生物系統中(如兔網狀細胞溶解產物)合成，或者在不同于其天然來源的細胞系統中合成的多肽可以從其天然相關的成分中“分離”。還可以采用本領域熟知的純化技術，通過分離以使蛋白基本上不含有天然相關的成分。
“模擬物”或“肽模擬物”是非肽的類似物，其通常被用于制藥工業作為具有與模板肽類似的性質的藥物。Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber和Freidinger，TINS 392(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.301229(1987)，在此引入作為參考。模擬物通常借助計算機分子建模來開發。結構上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可以被用于產生等價的治療性或預防性作用。一般地，模擬物在結構上類似于范例多肽(即，具有期望的生物化學性質或藥學活性的多肽)，例如TWEAK，但是具有一種或多種肽鍵可選擇地通過本領域熟知的方法被一種鍵替換，該鍵選自--CH2NH--，--CH2S--，--CH2-CH2--，--CH＝CH--(順式和反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--，和-CH2SO--。用相同類型的D-氨基酸系統性地取代共有序列的一種或多種氨基酸(例如用D-賴氨酸取代L-賴氨酸)也可以被用于生產更加穩定的肽。此外，包含共有序列或實質上相同的共有序列變體的限定的肽可以通過本領域已知的方法來生產(Rizo和Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61387(1992)，在此引入作為參考)；例如，通過增加能夠形成分子間二硫鍵的內在半胱氨酸殘基，二硫鍵使肽環化。
“肽類似物”是指來自野生型多肽但是氨基酸序列不同的多肽。氨基酸序列改變的多肽可以是突變蛋白，融合蛋白和模擬物。多肽類似物還指與野生型多肽相比具有非氨基酸差別的多肽。這些差別可以是化學的和生物化學的，并且包括但是不限于特別在本文中公開的修飾類型。
“多肽片段”是指氨基末端和/或羧基末端被缺失但是剩下的氨基酸序列與天然序列的相應部分相同的多肽。片段典型為長至少5，6，8或10個氨基酸，優選至少14個氨基酸，更加優選長至少20個氨基酸，通常至少長50個氨基酸，和甚至更加優選長至少70個氨基酸。
“祖細胞”是指能夠產生一種或多種細胞系的細胞。包括干細胞、全能細胞、多潛細胞、多能細胞、雙能細胞(bipotent cell)，胚胎細胞或成體細胞(adultcell)。還包括組織特異性細胞，包括但是不限于，定向于能夠進行終末分化的特定細胞系的細胞，來自于組織定居細胞(tissue resident cell)的細胞，和定向于特定組織的循環細胞。
“機體”是人或非人類機體。機體的例子是患者。
“TWEAK相關病癥”是指由異常TWEAK功能或調控產生的任何病癥。該術語還指不是直接從異常TWEAK功能或調控產生的任何病癥，而是產生自一些其他的機制，其中破壞、升高或另外改變TWEAK的活性對該病癥具有可檢測的結果。TWEAK相關病癥可以是炎癥性的或實質上非炎癥性的，并且包括但是不限于本文特別公開的病癥和疾病。
“載體”是指使目標DNA序列在其天然細胞之外被克隆、繁殖、重組、突變和表達的DNA分子。通常地，載體具有使基因序列在特定條件下或在特定細胞中可誘導地或組成型地表達的表達控制序列。載體的例子包括但是不限于質粒，酵母人工染色體(YACs)，病毒，EB病毒，(EBV)來源的附加體，噬菌體、粘粒和噬菌粒。
“異種動物”是指攜帶人免疫球蛋白基因座實質部分的動物。經常地，異種動物攜帶同源靶向內源免疫球蛋白基因座，使得它們不能表達其內源免疫球蛋白基因。實例包括XenoMouseTM細胞系的小鼠(Abgenix，Inc.，Fremont，加利福尼亞)，其能夠體內重排轉基因的人免疫球蛋白基因，超變人可變基因，免疫球蛋白基因的表達，和免疫球蛋白同種型轉換。異種動物能夠利用人免疫球蛋白基因序列發動對抗原攻擊的有效體液應答。在異種動物中產生的抗體完全是人的，并且可從動物本身或其后代中，從提取自動物或其后代的培養細胞中和從異種B淋巴細胞系或其后代中產生的雜交瘤中分離得到。而且，被重排的編碼免疫球蛋白的人基因序列可以通過常規的重組技術分離得到，該免疫球蛋白產生來抵抗特定抗原攻擊。
“異種抗體”是指通過外源免疫球蛋白基因座編碼的抗體。例如，在XenoMouseTM系的小鼠中，人抗體基因座編碼異種抗體。
“異種單克隆抗體”是指在來自異種動物的克隆的、無限增生的細胞中如雜交瘤中產生的同源抗體群。例如從XenoMouse系小鼠中制備的雜交瘤產生異種抗體。
對疾病的理解和治療根本上朝向于確定闡明疾病的分子機制或生物化學路徑。因此，醫生和科研人員能夠制備治療劑和配制藥物組合物，它們特異性地靶向這些分子機制或生物化學路徑。
一些困擾人的最復雜且使人虛弱的疾病包括那些心臟、肝臟、腎臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪代謝、胃腸道、神經系統、胰腺、生殖器官、軟骨、骨、結締組織系統和祖細胞或干細胞的疾病。本發明的優點在于提供對這些疾病的了解的重要進展。更加特別地，本發明提供表達外源TWEAK蛋白的轉基因動物，并首次證明TWEAK蛋白的表達與某些心臟、肝臟、腎臟和肺的病理狀況之間的相關關系。本發明還提供用于治療或預防這種病理狀況的方法，以及用于鑒定用于這些方法中的TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。可以按照本發明的方法治療的病理狀況包括急性的心臟損傷、慢性心力衰竭、非炎癥性充血性心肌病、充血性心力衰竭、肝臟上皮細胞增生、肝細胞死亡、肝臟纖維變性、肝細胞液泡化、肝臟損傷、膽管病癥，包括膽管增生、炎癥性腎臟病癥，如腎臟多病灶炎癥，非炎癥性腎臟病癥，如腎小管腎病，腎小管增生，腎小球囊腫、腎肥大、腎小囊增厚、腎小球腎病、Alport綜合癥、腎小管液泡化、腎透明管型、腎臟纖維變性和炎癥性肺病癥。本發明還提供用于檢測TWEAK結構或功能，作為疾病的分子標記的方法，包括TWEAK蛋白或其功能，TWEAK抗體和TWEAK核酸。
本文所描述的TWEAK相關病癥采用TWEAK激動劑或拮抗劑處理，TWEAK激動劑或拮抗劑能夠改變TWEAK活性或者破壞膜結合或全長形式的TWEAK多肽與其分子受體之間的相互作用。可選擇地，治療劑和治療方法破壞膜結合或全長形式的TWEAK多肽與另一種TWEAK多肽之間的相互作用。這種干涉可能發生在細胞表面、細胞內、細胞外或體外結合到固相上或在溶液中。在另一種選擇中，治療劑和治療方法破壞膜結合或全長形式的TWEAK多肽與TWEAK相互作用的配偶體之間的相互作用。這種相互作用的配偶體可以是蛋白質、核酸、糖、脂肪、脂肪酸和類固醇。
在一個本發明的優選實施方案中，TWEAK相關的病癥實質上是非炎癥的。
在另一個優選實施方案中，TWEAK相關的病癥是纖維變性、心肌病、腎臟疾病、肺部疾病或肝臟疾病。
在另一個優選實施方案中，TWEAK相關的病癥是骨骼肌疾病、脂肪組織疾病、胃腸道疾病、胰腺疾病、生殖器官疾病、神經組織疾病、細胞死亡、皮膚疾病、軟骨疾病、骨病或結締組織疾病、在另一個實施方案中，TWEAK激動劑或拮抗劑可以被用于在體內通過影響祖細胞來治療患需要組織替換或再生的病癥、疾病或損傷的機體(如灼傷的或被放射的患者)。TWEAK激動劑或拮抗劑還可以被用于與祖細胞或組織移植治療結合來體內治療機體。TWEAK激動劑或拮抗劑還可以被用于體內擴增細胞群或體外擴增祖細胞群，用于隨后被移植到機體中，伴隨或不伴隨其他治療。用于體內細胞治療或體外擴增隨后用于移植的祖細胞群體可以是胚胎或成體來源的。成體(adult)來源的祖細胞可以是多能的或組織限制性的(Lagasse等，Immunity 14425-436(2001)；Jackson等J.Clin.Invest.1071355-402(2001)；Anversa和Nadal-Ginard，Nature 415240-243(2002)；Gussoni等，Nature 401390-394(1999)；Brazelton等，Science2901672-1674(2000)；Peterson等，Science 2841168-1170(1999)；Lagasse等，Nature Medicine 61229-1234(2000))。
心臟病在工業國家中是勞動力喪失和死亡的重要原因。在美國，心臟病約占全部死亡率的40％，每年引起約750,000人死亡。心臟功能中最基礎的是心肌，主要由分支和吻合的紋狀肌細胞(心肌細胞)組成。心肌細胞比介于其中的間質細胞大得多，占心肌體積的90％以上。正常的心肌中炎癥性細胞極少并且膠原質也很少。
心肌病很普遍，但是在不同心臟病癥中位于第二位。心肌病的例子包括炎癥性紊亂(如心肌病)，而非炎癥性心臟病癥如充血性心肌病、系統性代謝紊亂、肌肉營養失調和心肌細胞的遺傳異常。
心肌病的主要類型包括充血性的、肥大性的和限制性的心肌病。本發明的目的在于提供用于治療充血性心肌病的方法，充血性心肌病通常實質上是非炎癥性的。在非炎癥性充血性心肌病的情況下，其約占心肌病的臨床病例的90％，心臟表現為進行性的心臟肥大、擴張和收縮(心臟收縮)障礙。充血性心肌病可能發生在任何年齡段，但是最普遍發生在年齡在20-60歲的人中。通常通過非侵入性的心臟成像來診斷，特別是通過二維心回波描記術診斷。充血性心肌病的組織病理學的特征在于心肌細胞退行性變伴隨輕度到中度的肥大，不存在炎癥細胞和間質纖維變性。
臨床的充血性心肌病出現緩慢的漸進的充血性心力衰竭，但是患者可能迅速從代償狀態滑落到失代償狀態，通常需要進行心臟移植。50％的患者在兩年之內死亡，75％在五年之內死亡。死亡的原因典型的是漸進的心力衰竭或心率失常，但是可能出現由于心臟內血栓脫落而引起的栓塞。
表現為充血性心肌病的心臟被擴大、松弛，為正常心臟的2-3倍重。所有的腔室都擴張，壁變薄，纖維變性，并且典型地為壁孔血栓癥。在少數充血性的心肌病中，由于左心室擴張導致二尖瓣或三尖瓣回流。心肌細胞過度增生，核擴大。一些充血性心肌病的病因包括心肌炎、濫用酒精或其他毒素、懷孕(圍產期心肌病)、缺血、冠心病、高血壓和遺傳影響。
特發性充血性心肌病(IDC)是一種未知病因的疾病，其特征在于一側或兩側心室擴張、心臟收縮功能障礙，并且逐步發展為充血性心力衰竭。應當指出，術語“IDC”被本領域的技術人員與術語“充血性心肌病”交換使用，表明IDC實際上是充血性心肌病的一種廣義分類，不是濫用酒精、毒素損傷或心肌病的結果。
在顯微鏡下，IDC的特征為心肌細胞增生、核過大和間質的和血管周圍的纖維變性。與心肌病不同，壞死和細胞浸潤通常不顯著出現在IDC患者中，這表明其病因是非炎癥性。與該病因學一致的是抗炎癥藥物如強的松在治療IDC中通常是無效的。
本發明的一個目的在于提供一種治療或預防與TWEAK活性相關的充血性心肌病的方法。由于充血性心肌病(如IDC)的病因在很大程度上是未知的，還沒有開發出特定的治療方法。通常采用物理的、飲食的和藥理學的干涉(如β-腎上腺素受體拮抗劑、鈣離子拮抗劑和抗凝血劑)治療患者的心力衰竭來控制該疾病的癥狀。此外，當可能時，進行心臟移植。
本領域的技術人員不能確定任何可以被用于診斷IDC的免疫學的、組織化學的、形態學的、超結構的或微生物學的標記。但是，流行病學證據表明易感IDC是有遺傳基礎的。在20％的IDC患者中，一度(first-degree)相關也顯示IDC跡象，表明頻繁的家族傳播。本領域的技術人員已經認識到需要確定亞臨床和臨床心臟病患者中的IDC的分子遺傳標記。
迄今，與充血性心肌病相關的基因的列表包括心肌鈣蛋白T、d-肌聚糖(d-sarcoglycan)、心臟b肌球蛋白重鏈、心肌動蛋白、a-原肌球蛋白、核纖層蛋白A/C、肌間線蛋白、心斯里蘭卡肉桂咸受體(cardiac ryanodine recaptor)、橋粒斑蛋白、斑珠蛋白、肌營養不良蛋白和tafazzin。還需要尋找引起充血性心肌病的其他遺傳因子和設計靶向這些因子的治療劑。本發明首次證明了TWEAK和充血性心肌病之間的因果聯系。因此，本發明的目的在于提供一種在患者中鑒定充血性心肌病的方法，通過檢測TWEAK蛋白表達、TWEAK蛋白功能、TWEAK mRNA表達的變化或染色體改變。用于檢測疾病的分子標記的方法和試劑在本領域是熟知的，包括免疫學或免疫組織化學分析，酶或其他蛋白功能分析，和標準的雜交分析，如northern印跡、Southern印跡、單核苷酸多態性(SNP)分析，和熒光原位雜交(FISH)分析。
應當指出，非炎癥性充血性心肌病的特征在于漸進的心臟肥大、擴張和收縮障礙。相反，Chagas病是心肌病的一種罕見形式，是一種炎癥性的心臟病，在慢性Trypanosoma cruzi感染后，在人類和試驗動物中產生。Chagas病在美國中部和南部流行，對Chagas病的研究已經在Chagas病患者的血清中鑒定出抗自身的抗體。Joshua Wynne和Eugene Braunwald，Heart Disease，ATextbook of Cardiovascular Medicine，2，Ch.41，1442-1444(第五版1997)。本文公開的方法被用于治療更加常見的、與TWEAK活性相關的非炎癥型的充血性心肌病。
一個成年人的腎臟每天處理超過1,700L血液，產生大約1L尿液。腎臟在廢物排泄、代謝，水、鹽和pH平衡中起作用，以及對內分泌系統起作用。腎臟疾病更可能導致發病而不是死亡，美國每年死亡約35,000人。相反，每年有數百萬人遭受非致死性腎臟疾病，如感染、腎結石和尿路堵塞。
典型地，腎小球腎病由于免疫紊亂引起，而腎小管和腎間質紊亂通常由毒素或感染劑引起。部分腎臟疾病包括急性腎病綜合癥、無病癥的血尿癥或蛋白尿癥、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、腎小管缺陷、尿路感染、腎結石、尿路阻塞和腎臟纖維變性。
包括腎小管損傷的腎臟損傷通常也包括間質組織損傷。腎小管疾病可以是炎癥性的或實質上非炎癥性的，包括局部缺血或中毒性的腎小管損傷。部分腎小管疾病的列表包括急性腎小管壞死和急性腎衰竭；腎小管的炎癥反應和間質組織炎癥反應(腎小管間質組織腎炎)；腎小管增生；腎小管間質組織纖維變性(由腎小管上皮細胞與間質組織成纖維細胞、單核細胞、腎小球超濾液、細胞因子和化學因子成分引起的疤痕疾病)；和常染色體顯性的多囊性腎臟疾病(ADPKD)(一種由PKD1或PKD2基因突變引起的遺傳紊亂，特征為來自腎小管和集合管的大、充滿液體的囊腫)。
腎小球疾病是最令人恐懼的腎臟疾病。例如，慢性腎小球腎炎是人的慢性腎衰竭的最常見原因。在所謂的次級腎小球疾病中，腎小球可能通過免疫紊亂受損，免疫紊亂如系統性紅斑狼瘡(SLE)，以及血管疾病，如高血壓和結節性多動脈炎。此外，代謝疾病，如糖尿病(即糖尿病腎病)和遺傳性病癥，如Fabry病，影響腎小球。最主要的腎小球疾病包括主要的腎小球腎炎和腎小球腎病。
遺傳性腎炎包括主要與腎小球損傷相關的家族性腎臟疾病。Alports綜合癥是一種腎炎形式，伴隨著神經性耳聾和各種眼病，包括晶狀體脫落、晚期白內障和角膜營養失調。這些疾病由于其顯性X連鎖基因型，在男性中更加普遍。但是由于常染色體其中之一的顯性和隱性基因型，某些女性也患有此病。Alport腎臟的腎小球表現為節段性的增生或硬化。有時由于中性脂肪和粘多糖沉積，上皮細胞具有泡沫狀外觀。腎小球和腎小管基底膜表現為不規則的增厚或變薄，伴隨致密板的斷裂和疊片。
由于腎臟疾病具有極其重要的臨床意義，本領域技術人員認識到需要了解其生理的和遺傳的病因。本領域技術人員還意識到需要開發用于治療慢性和急性腎臟疾病的新治療試劑。本發明首次證明了TWEAK和腎臟疾病之間的因果關系。
因此，在一個實施方案中，本發明提供用于治療腎臟疾病的方法。在一個更加優選的實施方案中，腎臟疾病可以是Alport綜合癥。在本發明的其他更加優選實施方案中，目標腎臟疾病的特征為多病灶的炎癥、腎小管腎病、腎小管增生、囊腫、腎小球腎病、腎小管液泡化、纖維變性或透明管型。
肺部疾病曾經并仍然是人類普遍罹患的疾病。主要的呼吸系統感染，如支氣管炎，支氣管肺炎和其他類型肺炎，通常必須由醫生治療。肺部疾病可能會因為環境因素如吸煙、空氣污染和其他吸入物惡化。慢性支氣管炎、肺氣腫、肺纖維變性和惡性腫瘤也是非常常見的。其次還涉及許多晚期疾病，在最嚴重的患者中存在肺水腫、肺腫漲不全，或支氣管肺炎。
哮喘是慢性復發的炎癥性疾病，表現為超反應氣道。該綜合癥典型地表現為陣發性、可逆的支氣管狹窄。哮喘由氣管支氣管樹對各種刺激反應增加引起，通常與IgE對外部變應原反應相關。
有兩種主要類型的哮喘。第一種類型為外源性哮喘，由暴露于外源性抗原引起的I型超敏性反應起始。外源性哮喘病癥的列表包括特異反應性(過敏性)哮喘、職業性哮喘和過敏性支氣管肺曲霉病。第二種類型是內在哮喘，由非免疫性機制產生，被許多因素觸發，例如攝取阿司匹林、肺部感染、應激、受冷、吸入刺激物和鍛煉。
本領域技術人員認識到需要更加清楚了解肺部疾病，包括非炎癥性和炎癥性的疾病，如哮喘。更為深入的了解將方便開發用于治療肺部疾病的改進的藥物制劑。本發明首次證明TWEAK與肺部疾病之間的因果關系，以及用于治療這些疾病的方法。在本發明的更加優選的實施方案中，肺部疾病的特征為炎癥，包括肉芽腫性和/或淋巴組織細胞性炎癥。
肝臟是消化和代謝平衡的主要調節器，包括食入的氨基酸、糖、脂肪和維生素的加工處理，以及血清蛋白的合成、解毒和將內源性廢物和污染性生物異源物排泄到膽汁中。因此，肝臟疾病通常是非常嚴重的，有時威脅生命安全。
肝臟容易受到許多類型的疾病的攻擊，包括代謝性、毒性的、微生物的、循環的和腫瘤性轉化侵害。毒素或免疫紊亂可能引起肝細胞腫漲，外觀上變得水腫，具有不規則的叢生細胞質和大片清澈的空間。此外，滯留的膽汁物質可能引起肝臟細胞變為泡沫狀和腫漲。物質如鐵、銅和脂肪小滴(脂肪變性)的沉積物可在肝細胞內集聚。在酒精性肝病和懷孕的急性脂肪肝的情況下，出現沒有轉移核的微滴(稱作微泡脂肪變性)。
肝細胞壞死從嚴重的肝臟損傷產生，表現為，其中，局部缺血性凝結物壞死。通常，毒性的或免疫學相關的病癥中的細胞死亡表現為聚集的肝細胞和收縮、固縮、強烈的嗜曙紅性的含有核片段的“聚集體”(Councilmanbodies)(由凋亡產生)。可選擇地，肝細胞可能滲透性腫漲和破裂(細胞溶解壞死)。
肝炎由對肝臟的某些損傷引起，與急性或慢性炎癥細胞的流入相關。肝細胞壞死可能在炎癥開始之前，或者反之亦然。纖維變性，是肝臟損傷的一種不可逆轉的結果，通常由炎癥或非炎癥性機制產生，例如直接毒性侵害。膠原的特征性沉積影響血流和肝細胞灌注。伴隨連續纖維變性，肝臟被細分為具有周圍疤痕組織的再生肝細胞結節(硬化)。
卵形細胞(oval cell)因其外形為小的、增生性的上皮細胞，具有卵圓形細胞核和稀疏的嗜堿性細胞質而得名。卵形細胞通常定居在連接肝內導管的末端膽管中，所述肝內導管位于具有肝細胞索的肝門三聯中。這些細胞來源于定居的肝臟祖細胞，或來自循環或定向于肝臟的骨髓祖細胞。這些導管性祖細胞具有分化為膽汁導管上皮細胞和肝細胞的潛能。本發明證明在小鼠中TWEAK轉基因的表達能夠擴增導管祖細胞群體。
由于肝臟疾病引起的高水平發病率和死亡率，本領域認識到必須闡明這種疾病的分子和遺傳基礎。確定因果關系因素便于發現用于治療慢性和急性肝臟疾病的治療試劑。本發明證明了TWEAK與肝臟疾病之間的因果關系，并且有力地提供用于治療這些疾病的方法。在更加優選的實施方案中，肝臟疾病是上皮增生、肝細胞液泡化、導致纖維變性的膽管損傷、肝細胞死亡或肝臟損傷。
骨骼肌系統對于體態和運動是非常重要的。停止使用會使骨骼肌萎縮，這可能亞于去除神經或血液供應和暴露于藥物如糖腎上腺皮質激素的病癥。在遺傳或退化性病癥中骨骼肌也可能萎縮。這些病癥或疾病可以是炎癥性的或實質上非炎癥性的。肌肉營養失調組成了大量的遺傳性肌病，在不是神經疾病時表現為萎縮和丟失肌纖維；該病中包括的一種常見形式是Duchenne肌肉營養失調。先天性肌肉疾病還可能發生在糖原儲存疾病的情況下，如酸性麥芽糖酶缺乏癥，在肌無力、運動差、心臟擴大，并且通常早年死于心力衰竭的嬰兒中發生。導致肌肉萎縮的先天性疾病還包括但是不限于線粒體肌病、脂肪肌病、中心管肌病和橫紋肌溶解。肌病病癥還在成年人中產生，最為常見的是酒精性肌病。骨骼肌萎縮還可以作為神經性疾病的一部分，包括但是不限于肌萎縮性側索硬化(ALS)。此外，骨骼肌萎縮還被稱為惡病質，是最末期的癌癥患者中存在的重要病理狀況，并且通常直接導致患者死亡。在炎癥或自體免疫中發生的骨骼肌疾病包括多肌炎，炎癥性肌病，和腎上腺糖皮質激素誘導的萎縮。本發明建立了TWEAK與成肌細胞分化為肌管的能力之間的聯系。因此，本發明的目的在于提供通過采用體內或體外方法促進骨骼肌再生來治療骨骼肌疾病的方法。
在肥胖病癥中發生脂肪細胞聚積，這些病癥包括與代謝紊亂相關的肥胖癥如II型糖尿病。脂肪細胞內生到器官中，稱作脂肪浸潤，發生在各種條件下，是肌肉營養失調的病理構成。本發明已經證明了TWEAK與前脂肪細胞分化為脂肪細胞的能力之間的聯系。因此，本發明的目的在于提供通過用TWEAK激動劑或拮抗劑或它們的藥物組合物調節脂肪細胞分化來治療與脂肪細胞沉積或脂肪細胞缺乏相關的疾病的方法。
按照本發明的治療TWEAK相關病癥的方法采用TWEAK激動劑或拮抗劑或包含它們的藥物組合物。本發明的治療TWEAK相關病癥的TWEAK激動劑或拮抗劑在本文被描述，并且是本領域已知的。這些試劑包括那些公開在如PCT國際公開WO 98/05783，WO 98/35061，WO 99/19490，WO 00/42073和WO 01/45730中，全部在此引入作為參考。用于本發明的方法中的TWEAK拮抗劑包括抗TWEAK的抗體，如人的、非人類的、人源化的或異種的抗體，如本文所描述，并且是單克隆的、多克隆的或合成的。而且，抗體可以是全長的，其片段，或者包含抗原識別序列的融合蛋白。
用于本發明的方法的TWEAK拮抗劑還包括抗TWEAK受體的抗體。在此，TWEAK受體可以是FN14或者被TWEAK結合的TNF-R家族的其他成員。抗TWEAK受體的抗體可以人的、非人類的、人源化的或異種的抗體，如本文所描述，并且是單克隆的、多克隆的或合成的。而且，抗體可以是全長的，其片段，或者包含抗原識別序列的融合蛋白。
用TWEAK或TWEAK受體抗原免疫動物可以通過本領域知曉的任何方法進行。參見如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，紐約ColdSpring Harbor Press，1990。用于免疫非人動物的方法在本領域是已知的，參見如Harlow和Lane以及美國專利5,994,619，動物如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬等。在一個優選實施方案中，抗原與或不與佐劑一起被施用，來刺激免疫反應。這種佐劑包括，其中，完全或不完全的Freund佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復合物)。
被選擇用于免疫的抗原可以是如下任何之一TWEAK多肽TWEAK多肽片段；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽；TWEAK受體片段；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；表達TWEAK多肽、片段、突變蛋白或其融合蛋白的細胞；表達TWEAK受體多肽、片段、突變蛋白或其融合蛋白的細胞。通過免疫在動物中產生的免疫球蛋白從各種組織或動物的體液中收集，包括血清、乳汁、腹水、脾臟、胸腺、外周血液細胞、胎兒肝臟、骨髓、腹膜和任何其他具有高免疫球蛋白濃度的組織或體液。此外，可以制備和分離雜交瘤，其將單克隆抗體分泌到培養液中。
在本發明的優選實施方案中，抗體是多克隆抗體、單克隆抗體或人源化抗體。在更加優選的實施方案中，人源化抗體包含人抗體恒定區和/或構架區。在另一個優選實施方案中，抗體是異種抗體。在更加優選的實施方案中，異種抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
異種抗體是一種物種的完整抗體，其在一個完全不同的物種中被表達。例如，如果小鼠表達用于制備完整的人抗體所需的DNA，那么生成的抗體是異種的(即在小鼠中制備的人抗體)。靶向滅活(敲除)技術提供破壞動物正常表達內源免疫球蛋白基因的可能。轉基因動物技術提供了制備生產異種免疫球蛋白的非人類動物的機會。這種異種動物可以與上述免疫球蛋白敲除的動物交配，生成僅生產異種免疫球蛋白而不是內源免疫球蛋白的動物。
異種免疫球蛋白基因的表達使得可以產生極度多樣化的人抗體譜，包括單克隆抗體。這是因為(1)外源免疫球蛋白基因保留其順式調控元件，并且經受宿主動物的正常的變化(V)、多樣(D)和連接(J)重組事件；(2)外源免疫球蛋白基因以與內源免疫球蛋白基因座相似的方式被表達；和(3)生成的抗體顯然支持正常的B淋巴細胞的發育和體液反應。
外源免疫球蛋白基因可以被導入到動物中，作為完整的免疫球蛋白基因座，免疫球蛋白基因座的一部分，或作為“微小的基因座(minilocus)”，其中比較完整的外源Ig基因座通過包含來自該Ig基因座的少量單個基因來模擬。此外，轉基因動物可以被加工來表達編碼改進的抗體的轉基因，如單鏈抗體或嵌合抗體。
用于本發明的方法的TWEAK激動劑或拮抗劑還可以是如本文所描述的TWEAK多肽或其片段、類似物、突變蛋白或模擬物。類似物區別于天然的TWEAK氨基酸序列，或以不涉及該序列的形式存在，或兩者。在優選實施方案中，TWEAK多肽類似物是突變蛋白。制備突變蛋白的方法在分子生物學領域是熟知的，包括通過隨機突變、定點突變、缺失和截斷來改變DNA分子。用于突變DNA的技術在本領域是熟知的，并且包括聚合酶鏈式反應(PCR)突變、飽和(即化學的或放射的)突變、DNA化學合成、丙氨酸掃描突變、寡核苷酸介導的突變(體外與DNA模板雜交隨后通過酶催化延長)、表達盒(重組的)突變，和組合突變(將隨機降解的序列導入TWEAK DNA中)。
TWEAK多肽結合到TWEAK受體上，結合到其他TWEAK多肽上，或結合到其他TWEAK作用的配偶體上。TWEAK片段可以是膜結合的，并且可以在藥物組合物中被傳遞，該組合物中包含脂質體或其他細胞的或擬細胞的傳遞系統。TWEAK片段還可以是可溶性的TWEAK多肽，其含有去除跨膜結構域的截斷或內部缺失。此外，用于本發明的方法的TWEAK多肽可能不產生TWEAK反應，或者導致改變的TWEAK反應。這種TWEAK多肽的例子是TWEAK蛋白類似物，包括缺失或截斷的突變體、含有一個或多個氨基酸取代的肽、TWEAK模擬物，以及非氨基酸序列改進的TWEAK多肽。
用于本發明的方法的TWEAK激動劑或拮抗劑還可以是如本文描述的TWEAK受體多肽，或其片段、類似物、突變蛋白或模擬物。TWEAK受體多肽可以被TWEAK多肽結合，或結合到其他TWEAK受體多肽，或結合到其他TWEAK受體作用配偶體上。TWEAK受體片段可以是膜結合的，并且可以在藥物組合物中被呈遞，該組合物包含脂質體或其他細胞的或擬細胞的呈遞系統。TWEAK受體片段還可以是可溶性的TWEAK受體多肽，其含有去除跨膜結構域的截斷或內部缺失。此外，用于本發明的方法的TWEAK受體多肽可能不產生TWEAK反應，或者產生改變的TWEAK反應。這種TWEAK受體多肽的例子是TWEAK受體蛋白類似物，包括缺失或截斷的突變體、含有一個或多個氨基酸取代的肽、TWEAK受體模擬物，以及非氨基酸序列改進的TWEAK受體多肽。
此外，用于本發明的方法中的TWEAK激動劑或拮抗劑可以是有機或無機的化合物。有機化合物可以是小的有機化合物，如在本領域熟知的化學文庫中發現的化合物。其他有機化合物包括但是不限于核酸、多肽、糖、脂質和脂肪酸、類固醇，或者它們的衍生物。無機化合物可以是基于硅石(silica)的或其他礦物質和鹽的。有機或無機的化合物可以結合到如本文描述的TWEAK多肽、TWEAK受體多肽或其他與TWEAK相互作用的配偶體上。
對TWEAK或TWEAK受體的非序列修飾可以從體內或體外化學衍生該多肽中產生，包括但是不限于，乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化、氧化態或糖基化的改變。此外，化學衍生可以包括偶聯到有機多聚物上，如聚乙二醇(PEG)或醫學領域已知的其他多聚物上。因此，TWEAK多肽類似物可以從非氨基酸序列修飾中產生。
TWEAK或TWEAK多肽可以作為融合蛋白被表達。融合蛋白在本領域是熟知的。本領域技術人員可以從大量不同融合配偶體成分中選擇，包括那些來自原核生物和真核生物的。
按照本發明，任何個體包括人和動物可以以藥學上可接受的方式用藥學上有效量的TWEAK激動劑或拮抗劑或包含這種試劑的組合物處理一段時間，足以在被施用一段時間的個體中治療TWEAK相關病癥。可選擇地，個體可以接受預防有效量的TWEAK激動劑或拮抗劑或者含有這種試劑的組合物，足以在被施用一段時間的個體中預防TWEAK相關病癥。可以用于本發明的方法的TWEAK激動劑或拮抗劑可以通過本文公開的方法被配制在藥物組合物中，并且可以通過胃腸外路徑、注射、經粘膜、口服、吸入、眼部、直腸、長效埋植、體表、緩釋或支架包被(stent coating)的方法。TWEAK激動劑或拮抗劑可以是各種用于施用的常規方式。包括例如固體、半固體的和液體的劑量形式，例如液體溶液和懸浮液、漿液、凝膠、面霜、香膏、乳劑、洗液、粉末、噴霧劑、泡沫、貼劑、油膏、藥膏和滴劑。
此外，TWEAK激動劑或拮抗劑可以通過基因治療路徑來呈遞。簡而言之，編碼蛋白或表達反義分子的核酸分子可以采用任何本領域知曉的適合將核酸分子呈遞到靶向組織或器官的載體呈遞給機體。典型的載體包括脂質體、質粒和病毒載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
TWEAK激動劑或拮抗劑或包含它們的組合物的最有效的施用模式和劑量方案將取決于期望的效果、先前的治療方法，如果有的話，個體健康狀況、病癥本身的狀況、對TWEAK激動劑或拮抗劑的反應以及治療醫生的判斷。TWEAK激動劑或拮抗劑，或者包含它們的組合物可以以醫藥或獸醫制備物可接受的任何劑量形式一次或在一系列治療中被施用。
提供單一劑量時，TWEAK激動劑或拮抗劑，或者包含它們的組合物的量將依賴于特定的施用模式，特定TWEAK激動劑或拮抗劑，或組合物，劑量水平和劑量頻率。典型的制備物將含有在約0.01％和約99％之間的，優選在約1％和約50％之間的TWEAK激動劑或拮抗劑或者它們的組合物(w/w)。
治療的或預防的有效量的TWEAK激動劑或拮抗劑的示例性的、非限定的范圍在約0.005-10.00mg/kg體重之間，更加優選在約0.05-1.0mg/kg體重之間。
TWEAK激動劑或拮抗劑，或者包含它們的組合物可以被單獨施用，或者作為制藥的或獸醫的制備物的一部分，或者作為預防性制備物的一部分，含有或不含佐劑。它們通過胃腸外或口服路徑被施用。例如，可以通過口腔、肺、鼻腔、耳朵、肛門、真皮、眼部、靜脈內、肌肉內、動脈內、腹腔內、粘膜、舌下、皮下、經皮、體表或顱骨內路徑施用，或者被施用到口腔內。在醫藥或獸醫上應用，TWEAK激動劑或拮抗劑可以被局部施用到任何上皮表面。這種表面包括口腔、眼部、耳朵、肛門和鼻腔表面。藥物組合物可以通過常規的混合、溶解、制粒、制備糖衣、粉碎、乳化、裝入膠囊、包載或凍干方法來制備。
用于按照本發明的用途的藥物組合物可以以常規的方式被配制，采用一種或多種生理上可接受的載體，包括賦形劑和輔劑，其方便將活性化合物加工到可以被藥學上使用的制備物中。合適的制劑將取決于特定的施用路徑。
對于經粘膜的施用，在制劑中使用適合透過屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領域通常是已知的。對于眼部施用，使用在適當的鹽水溶液中的懸浮液，這在本領域是已知的。
對于口服使用，TWEAK激動劑或拮抗劑很容易通過將活性試劑與常規的藥學上可接受的載體結合來配制。TWEAK激動劑或拮抗劑可以被配制成藥片、藥丸、脂質體、顆粒、球體、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、果汁、糖漿、懸浮液等，給被處理的患者口服攝取。
TWEAK激動劑或拮抗劑或包含它們的組合物，還可以包含任何用于醫藥品或獸醫制備物的常規載體或佐劑。這些載體或佐劑包括如Freund佐劑、離子交換物、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、緩沖物質，如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物性脂肪酸的不完全甘油酯混合物、水、鹽或電解質，例如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、鎂、三硅酸鹽、纖維素物質和聚乙二醇。用于體表或凝膠形式的佐劑可以包括，例如，羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鹽、聚氧乙烯-聚氧丙烯-阻斷的聚合體、聚乙二醇和木臘酒精(wood wax alcohol)。
用于口服使用的藥物組合物可以作為固體賦形劑獲得，可選擇地碾磨生成的混合物，并加工顆粒混合物，如果需要在加入合適的輔劑后進行，來獲得片劑或糖衣丸的核心。合適的賦形劑包括填充物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制備物如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入分解劑，如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或褐藻酸或其鹽，如藻酸鈉。
糖衣丸核心用合適的包被提供。為此，采用濃縮的糖溶液，其可選擇地含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol膠、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液(lacquer solution)、和合適的有機溶劑和溶劑混合物。染料或色素可以被加入到片劑或糖衣丸包被中來用于辨認或者用于表征不同的活性化合物劑量的組合。
可以口服使用的藥物組合物包括由明膠制備的推入式(push-fit)膠囊，以及由明膠和可塑劑制備的軟的密封膠囊，可塑劑如甘油和山梨醇。推入式的膠囊可以含有活性成分，其與填充物如乳糖、粘合劑如淀粉，和/或滑潤劑如滑石粉或硬酯酸鎂，以及可選擇地，穩定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物可以被溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪性油、液體石蠟、或者液體聚乙二醇。此外，可以加入穩定劑。用于口服施用的所有組合物應當為適合這種施用的劑量。
對于口腔施用，組合物采用以常規方式配制的片劑或錠劑形式。
對于通過吸入施用，TWEAK激動劑或拮抗劑通常以從加壓包裝或噴霧器中產生的氣霧噴霧的方式方便遞送，使用合適的推進劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在為加壓的氣霧劑時，劑量單位可以通過提供用于呈遞測定量的閥門來決定。用于吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒如明膠的，可以配制成含有化合物和合適的粉末基質如乳糖或淀粉的粉末狀混合物。
TWEAK激動劑或拮抗劑可以被配制來用于通過注射的胃腸外施用，如通過大藥丸注射，或連續灌注。該試劑可以被配制在水溶液中，水溶性懸浮液中，油性懸浮液中，或者乳狀液中，并且可能含有配制試劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。用于注射的劑型可以單位劑量的形式呈遞，如在安瓿中或在多劑量容器中，加入防腐劑。
典型的水溶液制劑包括生理相容的緩沖液，如Hanks溶液、Ringer溶液或者生理鹽水緩沖液。典型的油性懸浮液可以包括親脂性溶劑或賦形劑，包括脂肪酸如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如乙基油酸酯或甘油三酯，或脂質體。水溶液注射懸浮液可以還有提高懸浮液粘度的物質，如羥甲基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖。可選擇地，懸浮液還可以含有合適的穩定劑或提高化合物溶解性的試劑，以制備高濃度的溶液。可選擇地，在使用前，TWEAK激動劑或拮抗劑可以粉末的形式來與合適的賦形劑配制，例如滅菌的無致熱原水。
TWEAK激動劑或拮抗劑還可以配制成直腸組合物，如栓劑或滯留灌腸劑，如含有常規的栓劑基質如可可油或其他甘油酯。
除了所描述的劑型，TWEAK激動劑或拮抗劑還可以配制成存儲制備物。這種長效制劑可以通過植入(例如皮下地或肌肉內地)或者通過肌肉內注射施用。因此，例如，該化合物可以與合適的聚合的或疏水的物質(例如作為可接受的油中的乳劑)或者離子交換樹脂一起配制，或者配制成難溶(sparinglysoluble)的衍生物，作為難溶的鹽。
TWEAK激動劑或拮抗劑的藥學上載體是疏水性的，是包含苯甲醇、非極性表面活性劑、易溶于水的有機聚合物和水相的共溶劑系統。共溶劑系統可以是VPD共溶劑系統。VPD是具有3％w/v苯甲醇、8％w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80和65％w/v聚乙二醇300的溶液，加入無水乙醇到總體積。VPD共溶劑系統(VPD∶5W)由VPD與5％葡聚糖水溶液以1∶1稀釋組成。這種共溶劑系統對疏水性化合物的溶解性高，并且其本身在系統施用時產生的毒性低。自然地，共溶劑系統的組成可以極大地改變而不破壞其溶解性和毒性特性。此外，對共溶劑成分的確定也是變化的例如，其他的低毒性非極性表面活性劑可以被用來替代聚山梨醇酯80；聚乙二醇的含量多少也是可以變化的；其他生物相容的聚合物可以替換聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以用于替代葡聚糖。
可選擇地，可以采用其他用于疏水性藥物組合物的呈遞系統。脂質體和乳劑是用于疏水性藥物的呈遞賦形劑或載體的例子。某些有機溶劑，如二甲基亞砜也可以被使用，雖然它們具有較大的毒性。
此外，TWEAK激動劑或拮抗劑可以采用緩釋系統來呈遞，如含有治療劑的固體疏水性聚合物的半透性基質。各種緩釋物質是可以獲得的，并且是本領域技術人員熟知的。根據其化學性質，緩釋膠囊可以釋放化合物數周到超過100天。
根據TWEAK激動劑或拮抗劑的化學性質和生物穩定性，還可以采用其他用于蛋白質穩定的策略。
藥物組合物還可以包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的例子包括但是不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚乙二醇。
TWEAK激動劑或拮抗劑作為具有藥學上相容的平衡離子的鹽被提供。藥學上相容的鹽可以用許多酸加工形成，包括但是不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽傾向于更容易溶解在水或其他質子溶劑中，是相應的無堿基形式。
TWEAK激動劑或拮抗劑還可以被配制成用于包被支架的藥物組合物，來治療與TWEAK相關的心臟病癥。
本發明還涉及用于鑒定TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。這種TWEAK激動劑或拮抗劑可用于治療TWEAK相關病癥，即疾病，損傷狀況或組織的其他病理狀況，其中TWEAK受體如FN14被表達。這些病癥包括纖維變性和心臟(如心肌病)、腎臟、肺部、肝臟、皮膚、骨骼肌、脂肪代謝(如肥胖癥)、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經組織(包括神經退行性病變)、軟骨、骨和結締組織的疾病。這種TWEAK激動劑或拮抗劑還可以用于按照本發明通過體內或體外調節祖細胞的行為來促進組織替換。
用于鑒定TWEAK拮抗劑的方法的一個實施例包括步驟1)將表達編碼TWEAK多肽或其片段、類似物、突變蛋白或模擬物的外源DNA轉基因試驗動物暴露于候選的TWEAK拮抗劑的化合物；2)將來自轉基因試驗動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織與來自表達外源DNA但是不暴露于該化合物的參比動物的相同器官或組織相比較；和3)確定該化合物是否影響纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織。在另一個實施方案中，轉基因試驗動物是哺乳動物或非哺乳動物，如本文所述。
本文公開的轉基因動物表達編碼TWEAK多肽的外源DNA，其中該表達導致TWEAK相關病癥。在該實施例中，產生表達截斷的、可溶性形式或全長的、膜結合形式的外源TWEAK蛋白的轉基因小鼠。表達外源TWEAK蛋白的小鼠具有表型，該表型包括非炎癥性充血性心肌病，充血性心力衰竭，肝臟上皮細胞增生，肝細胞液泡化，肝臟損傷和炎癥性腎臟病癥，如多病灶炎癥，非炎癥性腎臟病癥，如腎小管腎病、囊腫、腎小球腎病、腎小管增生、腎臟纖維變性和炎癥性肺病。此外，用表達外源TWEAK蛋白的各種病毒載體感染的野生型小鼠表現為腎小管增生、肝細胞死亡、肝臟纖維變性和肝臟損傷等。
有了這些動物，本領域技術人員便擁有用于發現藥物的有力工具。特別地，表達外源TWEAK蛋白的動物可作為實現發現用于預防或治療本文公開的TWEAK相關病癥的TWEAK激動劑或拮抗劑的方法的模型系統。
在優選實施方案中，用于動物模型系統的單位是哺乳動物或非哺乳動物。在更加優選的實施方案中，哺乳動物是小鼠、大鼠、倉鼠、兔、狗、貓、奶牛、豬、山羊、馬、綿羊、豚鼠和靈長類。在更加優選的實施方案中，非哺乳動物的動物是鳥、魚、兩棲類、昆蟲和無脊椎動物。
編碼TWEAK多肽的外源DNA在轉基因動物中通過表達控制序列被表達，表達控制序列在動物中控制外源DNA的表達。控制轉錄的表達控制序列包括，如啟動子、增強子、轉錄終止位點、基因座控制區、RNA聚合酶持續合成信號和染色質重塑元件。控制轉錄后事件的表達控制序列包括剪接供體和受體位點和改變被轉錄的RNA的半衰期的序列，如指導poly(A)的添加序列或RNA結合蛋白的結合位點。控制翻譯的表達控制序列包括核糖體結合位點，指引多肽靶向表達到或在特定細胞區室中的序列，和改進翻譯速率和效率的5’和3’非翻譯區中的序列。
在轉基因動物中TWEAK表達的優選表達控制序列包括指導高水平蛋白表達的病毒元件，如來自反轉錄病毒LTR的、巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)的、猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(如腺病毒晚期啟動子(AdMLP))的、多瘤病毒的啟動子和/或增強子，以及強大的哺乳動物啟動子如天然的免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子。在一個實施方案中，編碼TWEAK多肽的DNA由α抗胰蛋白酶(AAT)啟動子起始。對病毒表達控制元件及其序列的進一步描述，參見如美國專利5,168,062；4,510,245和4,968,615。
外源DNA還可以在轉基因動物中從組織特異性表達控制元件包括啟動子中被表達。組織特異性表達控制元件在本領域是已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性例子包括肝臟特異性白蛋白啟動子(Pinkert等，GenesDev.1268-277(1987))、淋巴特異性啟動子(如Calame和Eaton，Adv.Immunol.43235-275(1988)；Winoto和Baltimore，EMBO J.8729-733(1989)；Banerji等，Cell 33729-740(1983)；以及Queen和Baltimore，Cell 33741-748(1983))、神經細胞特異性啟動子(如Byrne和Ruddle Proc.Natl.Acad.Sci.USA865473-5477(1989))、胰腺特異性啟動子(如Edlund等，Science 230912-916(1985))、乳腺特異性啟動子(如美國專利4,873,316和歐洲專利申請264,166)，和發育調節啟動子(如Kessel和Gruss，Science 249374-379(1990)；Campes和Tilghman，Genes Dev.3537-546(1989))。組織特異性啟動子的其他非限制性例子包括心臟組織啟動子α肌漿球蛋白重鏈啟動子(MHC)、皮膚組織啟動子角蛋白-14(K14)、肺組織啟動子表面活性蛋白C(SPC)，以及腎臟組織啟動子Ksp鈣粘著蛋白和腎臟雄激素調控蛋白(KAP)。外源DNA還可以從可誘導的真核啟動子中被表達，如金屬硫蛋白(MT)啟動子，或本領域已知的其他可誘導的真核啟動子。
在本發明的一個實施方案中，在本發明的轉基因動物中被表達的TWEAK多肽可以是全長的TWEAK多肽。在另一個實施方案中，在轉基因動物中表達的多肽是TWEAK多肽片段。在優選實施方案中，TWEAK多肽片段是可溶性TWEAK多肽。
在另一個實施方案中，本發明涉及在組織中表達編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉基因動物，該組織選自心臟；血液、血管；肺；肝臟；腎臟；腦；胎盤；骨骼肌；胰腺；脾；淋巴；胸腺；闌尾；外周血液淋巴細胞；胃腸道；神經元；皮膚；脂肪細胞；軟骨；骨；結締組織。在一個實施方案中，TWEAK DNA由組成型啟動子啟動表達。在另一個實施方案中，該DNA由誘導型啟動子啟動表達。在另一個實施方案中，DNA由組織特異性啟動子啟動表達。
本發明還涉及鑒定TWEAK激動劑化合物的方法，該化合物作為治療劑來治療TWEAK相關病癥或用于按照本發明通過體內或體外調節祖細胞行為來促進組織替換。激動劑候選化合物可以被施用給正常的動物中，并且評價它們對器官系統的作用。然后，來自被處理的動物的纖維變性的、心臟、肝臟、腎臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織與未處理的動物的相同組織比較；從而確定該化合物是否已經在任何所述組織中產生生物學作用。
本發明還涉及用于調控TWEAK的基因的鑒定方法，這種基因可能作為治療靶點來治療TWEAK相關病癥。例如，可以在TWEAK轉基因動物的各種組織中確定RNA模式，并且與正常動物比較，從而確定藥物靶點。
本發明的另一個目的是提供影響祖先干細胞增生或分化的方法，包括產生肌肉細胞、軟骨、骨或結締組織細胞類型的間質干細胞類型，例如基質細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和真皮細胞。本發明的還有一個目的是提供影響卵形細胞的增生或分化能力的方法，卵形細胞產生膽汁上皮細胞或肝細胞和腎臟祖細胞，其產生小管的上皮。
實施例為了更好地理解本發明，給出如下的實施例。這些實施例僅僅是用于闡述目的，而無論如何不被解釋為限定本發明的保護范圍。
實施例1制備TWEAK轉基因小鼠為了鑒定TWEAK活性的靶向器官和TWEAK體內信號的生物學結果，構建兩種小鼠TWEAK表達構建體，并采用標準的轉基因技術用于在正常(C57B1/6xDBA/2)F1和(C57B1/6xSJL/J)F2小鼠中過度表達TWEAK。R.S.Williams和P.D.Wagner，J.Applied Physiology 881119-1126(2000)。所用的TWEAK表達構建體如下(1)來自SEQ ID NO1的氨基酸101-249的TWEAK cDNA編碼可溶性形式的鼠TWEAK(命名為sTWEAK)，位于小鼠IgG信號序列的下游，被插入到CH269表達載體(載體PCDEP4衍生物(Invitrogen)，含有SV40 poly A附加序列)，位于人α抗胰蛋白酶(AAT)啟動子和β-球蛋白內含子的下游，位于人生長激素(hGH)polyA序列的上游；和(2)編碼全長的、跨膜形式的蛋白質(命名為FL-TWEAK)的cDNA，對應于SEQ ID NO1的氨基酸1-249，被插入到pBlueScript表達載體上(如Desplat-Jego等，J.Neuroimmunology 133116-123(2002)所描述)，含有SV40poly A添加位點。然后FL-TWEAK序列加上poly A添加位點被分離，并克隆到另一個載體上；然后，含有ApoE增強子-人AAT啟動子調控區域的片段被插入到上游來構建表達載體CA300。已經證明AAT啟動子主要在肝臟中引導轉錄，而在其他組織中水平較低，包括腎臟。P.Koopman等，GenesDev.316-25(1989)。
對于sTWEAK轉基因構建體，采用對應于SEQ ID NO2的核苷酸468-488(5′引物)和核苷酸693-713的互補鏈序列(3′引物)的探針通過尾(tail)DNA PCR確定23種獨立的轉基因建立者(founder)。此外，TWEAK的血清ELISA顯示這23只建立者動物中的10只在其血清中具有可檢測的TWEAK，范圍在0.06-3.0mg/ml。剩下的13只建立者不具有可檢測的血清TWEAK，即＜10ng/ml。10只PCR+中的9只，血清TWEAK+的建立者在約4-5月齡時開始發病。表現為體重下降，弓背，毛皮蓬亂和眼鏡凸出。這些建立者中的5只意外地死亡，具有發病病癥的剩下的4只被處死。相反，13只PCR+而血清陰性的建立者中僅1只發病或死亡。此外，4只PCR陰性的同窩仔畜中沒有一只發病/死亡。
對于FL-TWEAK轉基因構建體，通過尾DNA PCR和Northern印跡分析肝臟組織中的TWEAK mRNA的表達來確定兩只獨立的轉基因建立者。此外，檢測TWEAK的血清ELISA顯示這兩只建立者動物在其血清中都沒有可檢測水平的TWEAK，即少于10ng/ml。FL-TWEAK Tg建立者小鼠都沒有顯示臨床可觀察到的表型。
實施例2用傳遞編碼aTWEAK的外源DNA的腺病毒載體感染的小鼠中TWEAK的過度表達為了體內確定過度表達TWEAK的生物學作用，采用如在Tao等，Molecular Therapy 328-35(2001)中描述的標準腺病毒技術用復制缺陷的腺病毒載體感染8-10周齡的C57BL/6雌性成年小鼠，該腺病毒具有驅動小鼠TWEAK(“Adeno-TWEAK”)或水母綠色熒光蛋白(“GFP”)的巨細胞病毒(CMV)啟動子。包含GFP的腺病毒載體(“Adeno-GFP”)用作陰性對照。為了確定小鼠是否成功地用Adeno-TWEAK構建體感染，血清中的TWEAK蛋白質水平被測定，并且采用標準ELISA檢測在不同時間點監控。
在成年小鼠中系統地過度表達小鼠sTWEAK至少在三種主要器官肝臟、腎臟和心臟中導致組織變化。參見表1。這些表達腺病毒構建體的小鼠的表型與表1中來自實施例1的TWEAK Tg小鼠的表型比較。這些觀察值將在如下實施例中被更加詳細地討論。
表1在成年小鼠中TWEAK過度表達導致組織重塑

實施例3sTWEAK和FL-TWEAK導致充血性心肌病來自實施例1的4只存活的PCR+血清TWEAK+的建立者被處死，并檢測大體的形態異常。參見，表2。尸檢時肉眼觀察的結果表明心臟擴大，與正常動物的心臟相比擴大約2-3倍。由于擴大的心臟表型出現在多個獨立的sTWEAK轉基因建立者中，這極不可能是由于個別的插入事件。而且，對sTWEAK轉基因小鼠的血清化學的分析表明心臟特異性肌酸激酶升高。
表2sTWEAK轉基因小鼠

擴大的心臟的表型還在來自一個FL-TWEAK轉基因小鼠品系的個別小鼠中觀察到，該品系通過連續與C57BL/6品系回交建立。參見，表3。FL-TWEAK陰性的同窩小鼠不表現心臟異常。
表3FL-TWEAK轉基因小鼠

總之，這些數據有力地表明，擴大的心臟表型是TWEAK依賴的。
對來自sTWEAK轉基因小鼠和FL-TWEAK轉基因小鼠的心臟的組織病理學分析具有相似的結果。低倍顯微鏡觀察FL-TWEAK轉基因心臟(″Tg″)與來自轉基因陰性(″NTg″)的同窩小鼠的正常心臟比較，結果顯示在附圖l中。所示的FL-TWEAK轉基因心臟還代表了來自sTWEAK轉基因小鼠的TWEAK轉基因心臟(PCR+，血清TWEAK+)。轉基因心臟顯示充血性心肌病，表現為心室和心房擴張。與這種缺陷一致，在許多這些動物中觀察到心房和心室血栓癥(附圖1)。對肺和肝臟的分析表明在一些動物中的血管充血。
高倍顯微鏡觀察結果顯示了心臟中的其他組織病理學發現，包括心肌細胞增生和核過大。特別地，在TWEAK轉基因小鼠中對心室的組織病理學分析表明沒有炎癥跡象。因此，觀察到的TWEAK相關心肌病實質上是非炎癥性的。
對從sTWEAK轉基因小鼠(3只建立者和1只后代小鼠)的末端采血的血清化學分析表明，肌酸激酶(CK)水平異常高，特別在心臟中(即MB型的CK)，證明高水平的心臟應激/損傷。
8-10周齡的感染Adeno-TWEAK的C57BL/6雌性小鼠(參見實施例2)表現為充血性心肌病，與用陰性對照Adeno-GFP病毒感染的小鼠相比，其在感染3周后明顯。在TWEAK感染的小鼠中，心臟表現為腔室擴張，如組織病理學所示(附圖2)。
總之，TWEAK被證明在心肌病中起重要作用，包括充血性心肌病和充血性心力衰竭(CHF)。
實施例4TWEAK引起肝臟上皮細胞增生、肝細胞液泡化、肝細胞死亡膽管增生、肝臟纖維變性和肝臟損傷TWEAK在肝臟上皮增生和肝細胞液泡化中的作用在TWEAK和FL-TWEAK轉基因小鼠以及用含有表達sTWEAK多肽的DNA的腺病毒感染的野生型小鼠的損傷中被顯示。
與NTg小鼠相比，來自實施例1的TWEAK Tg小鼠的肝臟在2周齡時表現出大量的膽管和卵形細胞增生。參見，附圖3、如表4所示，甚至在血清TWEAK水平＜10ng/ml時，兩只FL-TWEAK轉基因小鼠建立者的肝臟表現出輕微的膽管和卵形細胞增生。FL-TWEAK轉基因小鼠回交C57BL/6背景顯示出大量的膽管和卵形細胞增生(表4)。
表4FL-TWEAK轉基因小鼠

類似地，TWEAK血清水平在0.2和3.0μg/ml之間的sTWEAK轉基因建立者表現出顯著的膽管和卵形細胞增生(表5)。
表5sTWEAK轉基因小鼠

這些膽汁和卵形的導管增生通過用A6 mAb免疫組織化學(IHC)染色FL-TWEAK Tg肝臟切片來證實，這些切片取自實施例1的Tg小鼠，A6 mAb將膽管上皮細胞和卵形細胞與肝細胞區別開(Engelhardt等，Differentiation 4529-37(1990))。附圖4表明，A6陽性細胞增加，其與門區相關，并且與NTg小鼠相比，其延伸到FL-TWEAK Tg的肝實質。較高的放大倍數的來自FL-TWEAK Tg的小鼠的蘇木精和曙紅染色切片表明，在門區鄰近膽管的卵形細胞顯著增加(附圖5)。擴增細胞核抗原(PCNA)的免疫組織化學證實，早在2周齡時，與NTg小鼠相比，TWEAK Tg小鼠中膽管和卵形細胞的擴增頻率升高。在較晚的時間點上，即在8周齡到7月齡之間，也觀察到TWEAKTg小鼠中肝細胞的擴增頻率與NTg小鼠相比升高了(未顯示)。此外，與NTg同窩小鼠相比，FL-TWEAK和sTWEAK都在來自實施例1的7月齡Tg小鼠中誘導肝細胞液泡化(附圖6)。
使用如實施例2的Adeno-TWEAK病毒的過度表達sTWEAK的8-10周齡的C57BL/6和BALB/c SCID小鼠顯示相當高的血清TWEAK水平。參見，附圖7，其展示呈遞不同劑量的腺病毒對測定的血清TWEAK水平的影響。小鼠用1011腺病毒顆粒/只小鼠靜脈內感染(用“B”線表示)、用1010腺病毒顆粒/只小鼠靜脈內感染(用“J”線表示)，或者用1011腺病毒顆粒/只小鼠肌肉內感染(用“H”線表示)。Adeno-sTWEAK感染的小鼠表現為肝臟損傷，在第3天和第7天在C57BL/6小鼠背景中觀察到血清黃疸，在第3天和第4天在BALB/c SCID小鼠背景中觀察到血清黃疸。一些BALB/c SCID小鼠在第4天死亡。
此外，如實施例2所述的Adeno-sTWEAK感染的小鼠還發生肝細胞死亡，早在施用后的2-3天就出現，這通過在第3天與對照GFP感染的肝臟(Adeno-GFP)相比，在TWEAK-感染的肝臟(Adeno-sTWEAK)中存在高水平的天門冬氨酸轉氨酶(″AST″)和丙氨酸轉氨酶(″ALT″)的肝臟酶標記得到證實(參見，表6和附圖8)。在感染后7天，在Adeno-GFP處理的小鼠中兩種肝臟酶也升高，這是可預期的，由于單獨由腺病毒載體引起炎癥。肝細胞死亡也出現在TWEAK感染的肝臟中，這通過組織形態學證實，表現為集聚的肝細胞和收縮、固縮、強烈的嗜曙紅的含有核碎片的“聚集體”(附圖8)。Adeno-sTWEAK處理的小鼠還產生強烈的增生性膽管反應，在感染后的7天達到峰值，在第11天還很明顯(附圖8)。在TWEAK感染的肝臟中，還觀察到增生性的結構，其表達特異于膽管上皮和卵形細胞的A6標記，這通過亮視野顯微鏡確定。
表6Ad-TWEAK和Ad-GFP動物中的肝臟酶數值Adeno-GFP Adeno-sTWEAK

Fn14被證明是細胞的TWEAK受體，在暴露于肝臟毒素如半乳糖胺(GalN)和四氯化碳(CCl4)后被誘導。附圖9表明，采用Fn14的放射性標記探針和暗視野顯微鏡通過原位雜交(ISH)，在正常成年小鼠肝臟中是檢測不到Fn14。但是，在CCl4損傷后，Fn14被高度誘導。類似結果在GalN損傷后得到(未顯示)。
如實施例2所述的Adeno-TWEAK感染的C57BL/6小鼠也表現出在肝細胞和某些增生性結構中Fn14的上調，如在與Adeno-GFP對照肝臟相比的Adeno-sTWEAK肝臟中觀察到的(數據未顯示)。
Fn14的作用進一步在膽管模型中被證實，在該模型中，10周齡的C57BL/6中的肝臟損傷通過結扎膽管造成，如Liu等，Hepatology 281260-1268(1999)；Olynyc等，Am.J.Pathol.152347-352(1998)所描述。在第0天通過手術結扎膽管，并5只10周齡的C57BL/6小鼠在手術后第4和第8天被無痛處死。然后制備肝臟的石蠟切片，并且使用放射性標記的鼠TWEAK和包含完整的FN14基因的FN14反義探針通過原位雜交檢測TWEAK和Fn14的表達。如附圖10所示，在第4天，Fn14在膽管的上皮細胞中強烈地表達，而不在肝細胞中表達。第8天，膽管上皮細胞中Fn14的表達顯著下降，但是在一些小鼠中仍然以低水平被檢測到(數據未顯示)。但是，TWEAK的表達沒有改變，并且在這種膽管結扎的模型中檢測不到。這些結果表明，在對某些肝臟損傷反應時Fn14表達在膽管上皮細胞中被上調，因此在肝臟纖維變性中起重要作用。
總之，這些觀察結果表明，TWEAK是肝臟上皮細胞增生、肝細胞液泡化、肝臟損傷、肝細胞死亡、膽管增生和肝臟纖維變性的重要因素。
實施例5FL-TWEAK和sTWEAK引起腎臟疾病來自實施例1的FL-TWEAK轉基因小鼠表現為顯著的腎臟疾病，包括輕微的多病灶炎癥、腎小管腎病、囊腫、腎小球腎病、腎小管嗜堿性、腎小管擴張、腎小管液泡化和透明管型。
如實施例2中所描述的10周齡的Adeno-TWEAK感染的C57BL/6小鼠與陰性對照Adeno-GFP感染的小鼠相比，表現為腎小球腎病和腎小管增生。此外，TWEAK在Alports綜合癥中的作用通過在Alports疾病的小鼠模型中的Fn14表達升高來證明。而且，TWEAK在腎臟纖維變性中的作用是通過TWEAK拮抗劑處理在由單側尿路阻塞引起的腎臟纖維變性的小鼠模型中證明。
皮層間質的擴大典型地是由于水腫或急性或慢性炎癥細胞和纖維性組織的浸潤。來自實施例1的FL-TWEAK轉基因小鼠表現為腎小管腎病和輕微的、多病灶的間質炎癥。更加特別地，比較非轉基因小鼠和FL-TWEAK轉基因小鼠的腎臟橫截面表明，在8周齡時具有顯著腎小管嗜堿性(附圖11，中間組)。
腎小球腎病表現為白細胞浸潤，即嗜中性粒細胞和單核細胞都浸潤，內皮細胞、上皮細胞和腎小球膜細胞增生。實施例1所述的FL-TWEAK轉基因小鼠具有顯著的腎小球腎病，表現為腎小球膜細胞的細胞過多和腎小囊上皮肥大和輕微的腎小囊增厚，鄰近的腎小管上皮嗜堿性(附圖12)。此外，與正常小鼠腎小球的形態學狀況相比(附圖11，上面右組)，FL-TWEAK轉基因小鼠表現為儲尿腔(urinary space)擴張，導致形成輕微腎小球周圍纖維變性的腎小球囊腫(附圖11，下面右組)。
在FL-TWEAK Tg小鼠中觀察到的腎小管嗜堿性指示在這些腎小管細胞的胞質中的RNA增多，即轉錄活性升高，表明它們是增生性細胞。增生性細胞核抗原(PCNA)染色證實，一些腎小管細胞在實施例1所述TWEAK-Tg小鼠的腎臟中增生，這對應于嗜堿性的腎小管(附圖13)。為了確定嗜堿性腎小管是近端腎小管還是遠端腎小管，三個連續的來自TWEAK Tg小鼠的組織切片被染色(1)用蘇木精和曙紅(H&E)來定位嗜堿性腎小管，(2)使用特異于近端腎小管的凝集素(來自T.Purpureas的凝集素)和(3)使用特異于遠端腎小管的凝集素。附圖14表明，實施例1所述的TWEAK Tg小鼠中的嗜堿性(增生的)腎小管都不表達近端或遠端腎小管上皮標記。
在TWEAK Tg小鼠中存在缺乏至少某些上皮標記的增生性腎小管與具有腎臟損傷的模型一致，在該模型中，來自近端腎小管的S3部分的細胞具有祖細胞特性，即，它們開始增生和表達指示去分化的間質細胞標記。這些細胞后來的分化可能在組織修復中通過再生新的腎小管起作用(Witzgall等，J-Clin.Invest.932175-2188(1994))。可選擇地，居住在S3區的已經存在的祖細胞群體可能發生增生和分化。
在TWEAK Tg轉基因小鼠中存在缺乏某些上皮標記的增生細胞還與腎臟發育模型一致，在腎臟發育模型中，上皮腎小管從進行分化的間質祖細胞形成，從而得到上皮標記和腎小管特定的特征。
類似地，如實施例2所述，用Adeno-sTWEAK病毒感染10周齡的C57BL/6小鼠，在感染后11天引起腎小球腎病和腎小管上皮嗜堿性以及偶爾的腎小球囊增厚和增生(附圖15)。這與在陰性對照Adeno-GFP感染的小鼠中觀察到的正常組織學相反。此外，指示上皮細胞增生的嗜堿性在第3天很明顯，而約在給藥后1周達到峰值。
與TWEAK在腎臟疾病中的作用一致，TWEAK mRNA被證明在成年C57BL/6小鼠腎臟中被廣泛地表達(附圖16)，并且Fn14 mRNA被證明在內皮層/或外髓質的近端小管中表達(附圖17)，這通過使用放射標記的TWEAK和Fn14反義探針原位雜交(ISH)表示，通過暗視野顯微鏡顯示。此外，Fn14mRNA被證明在Alport綜合癥的小鼠模型中被誘導。這在附圖18中以在兩只單獨的Alport小鼠的Fn14 mRNA相對于野生型動物的倍數增加表示，作為4-7周齡的Alport小鼠的疾病進展。
TWEAK在Alport疾病小鼠模型中的作用直接通過用TWEAK拮抗劑、鼠Fn14-Fc融合蛋白處理來檢測。兩個5只Alport敲除(KO)的小鼠按照Cosgrove等，Genes Dev.10(23)2981-2992(1996)制備，用對照IgG2a(muP1.17)或muFN14-Fc融合蛋白(由Biogen制備(Cambridge))處理。所用的對照IgG2a是鼠骨髓瘤蛋白P1.17，從雜交瘤中制備并通過標準mAb純化方法純化。muFN14-Fc是鼠Fn14細胞外結構域和鼠IgG2a的Fc區域的融合蛋白。該融合蛋白在人293胚胎腎臟細胞或在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中制備，通過標準mAb純化方法純化。第一次處理在三周齡時進行，以100mg蛋白的劑量通過腹膜內(IP)路徑施用。在隨后4周內持續用相同劑量處理，每周兩次。小鼠在第7周結束時處死(7周齡)。收集腎臟，包埋在石蠟中并冷凍。腎臟纖維變性和炎癥的嚴重程度通過得自H&E染色的石蠟切片的腎小球外形評分，用平滑肌肌動蛋白染色激活肌成纖維細胞，并用CD11b染色冷凍切片激活單核細胞。平滑肌肌動蛋白和CD11b染色切片分別被用于量化陽性染色區域來評價纖維變性和炎癥的嚴重程度，通過MetaMorph計算程序。分析結果表明在FN14-Fc處理的小鼠中的腎小球的健康狀況顯著地提高(在對照Ig處理組中有59％腎小球患病，相對于Fn14-Fc處理組中僅39％患病，P值＝0.03)。腎小球疾病表現為出現新月體和/或腎小球纖維變性。此外，通過α平滑肌肌動蛋白染色檢測，被處理的小鼠的腎臟皮質區中的纖維變性顯著降低，p值＝0.04。在FN14-Fc處理小鼠中，單核細胞浸潤也大體上趨向降低。這些結果清楚地表明，FN14-Fc處理Alports小鼠降低腎臟皮質區的纖維變性，并改進腎小球的一般形態。
TWEAK的作用還在單側尿路阻塞誘導的腎臟纖維變性的小鼠模型中用TWEAK拮抗劑、倉鼠抗TWEAK單克隆抗體處理來檢測。在腎臟纖維化漸進的小鼠模型中，輸尿管被結扎，導致單側尿路阻塞(UUO)。(Klahr等，Am JKidney Dis 18689-699(1991)；Moriyama等，Kidney Int 54(1)110-119(1998)。由于暢通的腎臟可以相對地維持正常腎臟功能，UUO在小鼠中引起漸進的腎硬化，而不是近期腎衰竭。而被阻塞的腎臟迅速完全纖維變性，未被阻塞的腎臟發生適應性的肥大。
TWEAK拮抗劑處理對UUO誘導的纖維變性的影響通過外形量化。四組8只8-10周齡的無病毒抗原的C57BL/6雄性小鼠(Jackson Laboratories，BarHarbor ME)被使用。這些小鼠被分成如下四組僅PBS(VEH)、對照倉鼠抗匙孔血藍蛋白(KLH)抗體(HA4/8；購自BD Biosciences(San Jose))，倉鼠抗小鼠TWEAK抗體(AB.G11；由Biogen制備(Cambridge))、可溶性小鼠TGF-β受體Ig(TGF-βR，陽性對照；由Biogen制備(Cambridge))和未被操作的(UNOP)。
為了誘導腎臟纖維變性，第0天，左側輸尿管被無菌分離，并如Hammad等，Kidney Int 58242-250(2000)所描述在手術側結扎腎臟。如下組PBS、HA4/8和AB.G11(抗TWEAK mAb)在手術后第2、6和9天額外被處理，而sTGF-βR-Ig組在第1，3，6和8天被處理。在手術后第10天，去除左側被結扎的腎臟，從腎盂的中間對半切開，準備用于石蠟切片。
石蠟處理的腎臟切片用特異于膠原的三色-馬森(Trichrome-Masson)染色劑染色。使用Metamorph程序，三色-馬森玻片上的藍色染色區域被測定來量化膠原含量，以評價被手術的腎臟中纖維變性的程度(附圖19)。
令人驚奇地，來自抗TWEAK單克隆(AB.G11)抗體處理的動物的腎臟切片證明，與PBS處理的動物相比膠原含量下降42％，而與對照(HA4/8)抗體處理的動物相比膠原含量下降30％。相反，來自可溶性TGF-β受體Ig處理(TGF-βR)的動物的腎臟，與PBS處理的動物相比膠原含量僅下降33％，而與對照(HA4/8)抗體處理的動物相比膠原含量下降19％。這些結果清楚地表明用TWEAK拮抗劑如抗TWEAK單克隆抗體處理，腎臟纖維變性的降低顯著地大于可溶性TGF-β受體Ig(TGF-βR)。
總之，本文給出的結果表明，TWEAK在炎癥性腎臟病癥如多病灶炎癥和在非炎癥性腎臟病癥如腎小管腎病、囊腫、腎小球腎病、Alports綜合征、腎小管嗜堿性、腎小管擴張、腎小管液泡化、透明管型、腎小管增生和腎臟纖維變性中發揮極其重要的作用。
實施例6TWEAK引起肺部炎癥在來自實施例1所述的FL-TWEAK轉基因和對照小鼠的肺的橫截面中，顯著的肉芽腫性和淋巴組織細胞性炎癥出現在FL-TWEAK和sTWEAK Tg小鼠中(附圖20)。此外，內源TWEAK表達顯示在里襯正常小鼠的支氣管和肺泡的肺細胞中，這通過采用放射標記TWEAK反義探針原位雜交(ISH)證明和通過暗視野顯微鏡(ISH)顯示(附圖21)。
與TWEAK在肺部疾病中作用一致，通過采用放射標記Fn14反義探針ISH證明并通過暗視野顯微鏡顯示，Fn14 mRNA在成年C57BL/6小鼠肺部被廣泛地表達(附圖22)總之，這些數據表明在介導炎癥性肺部病癥中TWEAK是重要的因素，所述病癥包括肉芽腫性和淋巴組織細胞性炎癥。
實施例7TWEAK抑制脂肪生成和肌肉生成TWEAK對細胞分化的影響通過使用兩種本領域已知的脂肪生成和肌肉生成的體外模型來研究(Green和Meuth，Cell 3127-133(1974)；Yaffe和Saxel，Nature 270725-727(1977))。
對于脂肪生成，3T3-L1細胞首先在Dulbecco′s Modified Eagles Media(DMEM)生長液中生長到匯合，然后按照本領域已知的方法誘導進行脂肪生成。Green和Kehinde，Cell 519-27(1976)。簡而言之，細胞在第0天用基于DMEM的MDI培養液刺激兩天，該培養液含有地塞米松、胰島素和IBMX，接著用僅含胰島素的基于DMEM的培養液再刺激兩天。在第5天，細胞在常規的生長培養液中培養，在第7天通過Oil-Red染色來評價脂肪生成。
對于肌肉生成，在第0天，C2Cl2細胞在基于DMEM的生長培養液中生長到接近匯合，轉換到含有2％馬血清的低血清分化培養液中來起始分化(Yaffe和Saxel，Nature 270725-727(1977))。用相差顯微鏡檢測肌管形成，在分化的第6天拍攝照片。
為了檢測TWEAK對這兩種分化路徑的作用，各種形式的重組TWEAK(TWEAK-FLAG、TWEAK或Fc-TWEAK)以100ng/ml最終濃度在第0天被加入，并且每天補充。TWEAK抑制這兩個系統中的脂肪生成和肌肉生成(附圖23和24)。TWEAK抑制作用的特異性用倉鼠抗TWEAK單克隆抗體AB.G11或hFn14-Fc作為中和劑來證實。
這些結果表明TWEAK在細胞分化中起重要作用。因此，本發明提供采用本文公開的TWEAK多肽、肽、激動劑或拮抗劑影響本文公開的祖細胞的細胞分化的方法。
實施例8TWEAK結合人間質干細胞人間質干細胞(hMSCs)(Cambrex Corp.，East Rutherford，NJ)被培養在MSCGM培養液中(Cambrex)，并通過用含有5mM EDTA的PBS培養來收獲，用于熒光激活細胞分選(FACS)分析。
細胞在冰上在含有PBS以及1％FBS和100ng/mL Fc-TWEAK的FACS緩沖液培育1h。在用FACS緩沖液洗滌兩次后，然后細胞用以1∶200稀釋的藻紅蛋白-偶聯的山羊抗人Fc或山羊抗小鼠Fc第二抗體(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)培育(附圖25)。通過單獨用第二抗體染色來測定背景染色，用虛線表示。
如附圖25所示，TWEAK結合到人間質細胞上，這通過與單獨第二抗體比較，Fc-TWEAK的染色模式發生改變來證明。因此，TWEAK能夠結合間質細胞(能夠分化成肌肉細胞以及軟骨、骨、結締組織細胞類型如基質細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和真皮細胞的祖細胞類型)表明，在正常和疾病模型中，TWEAK在這些細胞類型的分化中起重要作用。
實施例9Fn14在神經干細胞中被表達在C57BL/6和129/Sve背景混合物中檢測胚胎期第13.5天小鼠的大腦中的Fn14的表達。這些腦組織用Fn14反義探針進行原位雜交。在胚胎腔的下腹側區域可以檢測到陽性信號，與神經干細胞的位置相關(數據未顯示)。這些結果表明，Fn14在神經細胞分化中起重要作用。
實施例10鑒定用于治療TWEAK相關病癥的治療劑的方法為了確定作為按照本發明用于治療TWEAK相關病癥的治療劑的TWEAK拮抗劑化合物，獲得一種試驗動物，如小鼠，其表達編碼TWEAK多肽或其片段、類似物、突變蛋白和模擬物的外源DNA。然后該動物被暴露于候選化合物中，該化合物可能作為TWEAK相關病癥的治療劑。然后來自試驗動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織與來自表達外源DNA但是不被暴露于該化合物的參比動物的相同組織比較；和確定該化合物是否影響纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織的任何TWEAK相關病癥。
為了鑒定用于按照本發明治療TWEAK相關病癥的治療劑的TWEAK激動劑化合物，一種表達或不表達編碼TWEAK多肽或其片段、類似物、突變蛋白和模擬物的外源DNA的動物被暴露于候選的化合物，該化合物可能作為TWEAK相關病癥的治療劑。然后來自試驗動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟或肺組織與未被暴露于該化合物的參比動物的相同組織比較；和確定該化合物是否如本文所述由于體內TWEAK的信號已在所述組織中誘導了任何生物學變化。
在本說明書中引用的所有出版物和專利申請在此引入作為參考，如同各個出版物和專利申請被特別地和單獨地指出來引入作為參考。
盡管前述的方面已經略為詳細地通過闡明和實施例被描述，以達到清楚理解的目的，對于本領域技術人員來說，在不背離本文的公開，包括附隨的權利要求書的精神和范圍情況下，在本發明的教導下對本發明進行特定的變化和改變，對本領域普通技術人員是顯而易見的。
序列表<110>比奧根公司(BIOGEN，INC.)<120>用于治療TWEAK相關病癥的方法<130>A140PCT<140>
<141>
<150>60/371,611<151>2002-04-09<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>249<212>PRT<213>鼠科(Murine sp.)<400>1Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro1 5 10 15Gly Thr Ala Leu Leu Ala Pro Leu Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu20 25 30Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala35 40 45Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ser Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp50 55 60Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp65 70 75 80Val Val Pro Phe Leu Glu Gln Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro85 90 95Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu100 105 110Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly115 120 125Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr Lys Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu130 135 140
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權利要求
1.一種用于治療機體中的TWEAK相關病癥的方法，包括將TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑施用給所述機體的步驟，其中所述TWEAK相關病癥選自(a)纖維變性；(b)心臟病；(c)肝臟疾病；(d)肺部疾病；(e)腎臟疾病；(f)皮膚病；(g)骨骼肌疾病；(h)脂肪組織疾病；(i)胃腸道疾病；(j)胰腺疾病；(k)生殖器官疾病；(l)神經疾病；(m)軟骨疾病；(n)骨病；(o)結締組織疾病；(p)細胞死亡；或(q)表達TWEAK受體的組織的病理狀況。
2.按照權利要求1的方法，其中所述TWEAK相關病癥是非炎癥的病癥。
3.按照權利要求2的方法，其中所述TWEAK相關病癥是非炎癥性的心肌病。
4.按照權利要求1或2的方法，其中所述表達TWEAK受體的組織的病理狀況選自(a)纖維變性；(b)心肌病；(c)腎臟病癥；(d)肺部病癥；(e)肝臟病癥；(f)皮膚病癥；(g)骨骼肌病癥；(h)脂肪組織病癥；(i)胃腸道病癥；(j)胰腺病癥；(k)生殖器官病癥(l)神經組織病癥；(m)軟骨病癥；(n)骨病癥；或(o)結締組織病癥。
5.按照權利要求1或2的方法，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑選自(a)抗TWEAK抗體；(b)抗TWEAK受體的抗體；(c)TWEAK多肽片段；(d)TWEAK多肽類似物；(e)TWEAK突變蛋白；(f)TWEAK模擬物；(g)TWEAK融合蛋白；(h)TWEAK受體多肽片段；(i)TWEAK受體多肽類似物；(j)TWEAK受體突變蛋白；(k)TWEAK受體模擬物；(l)TWEAK受體融合蛋白；(m)有機化合物；或(n)無機化合物。
6.按照權利要求1或2的方法，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑被施用給所述機體，給藥途徑選自注射、經粘膜、口服、吸入、眼部、直腸、支架植入、體表、胃腸外、長效植入、緩釋、基因治療或耳朵的路徑。
7.權利要求1或2的方法，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑在呈遞的劑型中，該劑型選自片劑、藥丸、脂質體、顆粒、球體、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、果汁、糖漿、懸浮液、支架包被或緩釋制劑。
8.一種用于治療機體中的TWEAK相關病癥的方法，包括將能夠干擾第一種TWEAK多肽與分子的作用的TWEAK拮抗劑施用給所述機體的步驟，所述分子選自細胞受體、第二種TWEAK多肽和與TWEAK相互作用的配偶體。
9.用于鑒定作為TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑的化合物的方法，包括步驟(a)將表達編碼TWEAK多肽、或其片段或突變蛋白的外源DNA的試驗轉基因動物暴露于所述化合物；(b)將來自所述試驗轉基因動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織與來自表達外源DNA但是不被暴露于所述化合物的參比動物的相應的器官或組織比較；和(c)確定該化合物是否影響所述試驗動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經、軟骨、骨或結締組織。
10.按照權利要求9的方法，其中所述化合物選自(a)TWEAK多肽；(b)TWEAK多肽片段；(c)TWEAK多肽類似物；(d)TWEAK突變蛋白；(e)TWEAK模擬物；(f)TWEAK融合蛋白；(g)TWEAK受體多肽；(h)TWEAK受體多肽片段；(i)TWEAK受體多肽類似物；(j)TWEAK受體突變蛋白；(k)TWEAK受體模擬物；(l)TWEAK受體融合蛋白；(m)有機化合物；或(n)無機化合物。
11.按照權利要求9的方法，其中所述化合物是抗一種抗原的抗體，該抗原選自(a)TWEAK多肽；(b)TWEAK多肽片段；(c)TWEAK突變蛋白；(d)TWEAK模擬物；(e)TWEAK融合蛋白；(f)TWEAK受體多肽；(g)TWEAK受體片段；(h)TWEAK受體突變蛋白；(i)TWEAK受體模擬物；(j)TWEAK受體融合蛋白；(k)表達TWEAK多肽，其片段、突變蛋白或融合蛋白的細胞；和(l)表達TWEAK受體多肽，其片段、突變蛋白或融合蛋白的細胞。
12.按照權利要求9的方法，其中所述試驗轉基因動物和所述參比轉基因動物各選自(a)小鼠；(b)大鼠；(c)倉鼠；(d)兔；(e)狗；(f)貓；(g)牛；(h)豬；(i)山羊；(j)馬；(k)綿羊；(l)豚鼠；(m)鳥；(n)靈長類；(o)魚；(p)兩棲類；(q)昆蟲；或(r)無脊椎動物。
13.按照權利要求9的方法鑒定的化合物，其中所述化合物選自(a)TWEAK多肽；(b)TWEAK多肽片段；(c)TWEAK多肽類似物；(d)TWEAK突變蛋白；(e)TWEAK模擬物；(f)TWEAK融合蛋白；(g)TWEAK受體多肽；(h)TWEAK受體多肽片段；(i)TWEAK受體多肽類似物；(j)TWEAK受體突變蛋白；(k)TWEAK受體模擬物；(l)TWEAK受體融合蛋白；(m)抗TWEAK多肽的抗體，或其片段、類似物、突變蛋白、模擬物或融合蛋白；(n)抗TWEAK受體多肽，或其片段、類似物、突變蛋白、模擬物或融合蛋白的抗體；(o)有機化合物；或(p)無機化合物。
14.按照權利要求13的化合物，其中所述抗體是多克隆抗體。
15.按照權利要求13的化合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.按照權利要求15的化合物，其中所述單克隆抗體是人源化抗體。
17.按照權利要求14或15的化合物，其中所述抗體是異種抗體。
18.一種表達編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉基因動物，其中所述表達導致選自如下的病癥(a)纖維變性；(b)心肌病；(c)腎臟疾病；(d)肝臟疾病；(e)肺疾病；(f)皮膚疾病；(g)骨骼肌疾病；(h)脂肪組織疾病；(i)胃腸道疾病；(j)胰腺疾病；(k)生殖器官疾病；(l)神經疾病；(m)軟骨疾病；(n)骨病；(o)結締組織疾病；或(p)細胞死亡。
19.按照權利要求18的轉基因動物，其中所述動物選自(a)小鼠；(b)大鼠；(c)倉鼠；(d)兔；(e)狗；(f)貓；(g)牛；(h)豬；(i)山羊；(j)馬；(k)綿羊；(l)豚鼠；(m)鳥；(n)靈長類；(o)魚；(p)兩棲類；(q)昆蟲；或(r)無脊椎動物。
20.按照權利要求18的轉基因動物，其中所述DNA由組成型啟動子啟動表達。
21.按照權利要求18的轉基因動物，其中所述DNA由誘導型啟動子啟動表達。
22.按照權利要求18的轉基因動物，其中所述DNA由組織特異性啟動子啟動表達。
23.按照權利要求18的轉基因動物，其中所述TWEAK多肽選自(a)全長TWEAK多肽；(b)可溶性TWEAK多肽；(c)突變蛋白；或(d)TWEAK多肽片段。
24.表達編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉基因動物，其中所述DNA在選自下面的器官或組織中被表達(a)心臟；(b)血管；(c)肺；(d)肝臟；(e)腎臟；(f)皮膚；(g)神經；(h)胎盤；(i)骨骼肌；(j)胰腺；(k)脾；(l)淋巴；(m)胸腺；(n)闌尾；(o)外周血液淋巴細胞；(p)生殖器官；(q)脂肪組織；(r)胃腸組織；(s)軟骨；(t)骨；或(u)結締組織。
25.按照權利要求24的轉基因動物，其中所述DNA由組成型啟動子啟動表達。
26.按照權利要求24的轉基因動物，其中所述DNA由誘導型啟動子啟動表達。
27.按照權利要求24的轉基因動物，其中所述DNA由組織特異性啟動子啟動表達。
28.用于在機體中鑒定充血性心肌病的方法，包含在所述機體中檢測TWEAK蛋白表達、TWEAK蛋白功能、TWEAKmRNA表達的變化或染色體改變的步驟。
29.按照權利要求28的方法，其中所述TWEAK蛋白表達、TWEAK蛋白功能、TWEAKmRNA表達的變化或染色體改變通過選自下面的方法檢測(a)免疫分析；(b)免疫組織化學分析；(c)酶的或其他蛋白功能的分析；(d)Northern印跡；(e)Southern印跡；(f)單核苷酸多形性分析；或(g)熒光原位雜交分析。
30.用于影響細胞增殖或分化的方法，包括將祖細胞暴露于TWEAK肽、TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑。
31.按照權利要求30的方法，其中所述祖細胞選自(a)干細胞；(b)全能細胞；(c)多潛能細胞；(d)多能細胞；(e)雙能細胞；(f)組織特異性細胞；(g)胚胎細胞；或(h)成體細胞。
32.按照權利要求30的方法，其中所述祖細胞是未分化的脂肪細胞。
33.按照權利要求30的方法，其中所述祖細胞是未分化的生肌細胞。
34.促進組織替換或再生的方法，包括給需要組織替換或再生的機體施用一種化合物，該化合物選自(a)抗TWEAK抗體；(b)抗TWEAK受體抗體；(c)TWEAK多肽片段；(d)TWEAK多肽類似物；(e)TWEAK突變蛋白；(f)TWEAK模擬物；(g)TWEAK融合蛋白；(h)TWEAK受體多肽片段；(i)TWEAK受體多肽類似物；(j)TWEAK受體突變蛋白；(k)TWEAK受體模擬物；(l)TWEAK受體融合蛋白；(m)有機TWEAK激動劑；(n)有機TWEAK拮抗劑；(o)無機TWEAK激動劑；或(p)無機TWEAK拮抗劑。
35.按照權利要求1、30和34的任何一項的方法，其中所述方法與祖細胞或組織移植治療聯合應用。
36.按照權利要求35的方法，其中所述細胞或組織移植治療擴增細胞群體。
37.按照權利要求30的方法，其中所述祖細胞是未分化的軟骨細胞。
38.按照權利要求30的方法，其中所述祖細胞是未分化的骨細胞。
39.按照權利要求30的方法，其中所述祖細胞是未分化的結締組織細胞。
40.TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑在制備用于在機體中治療TWEAK相關病癥的藥物組合物中的用途，其中所述TWEAK相關病癥選自(a)纖維變性；(b)心臟病；(c)肝臟疾病；(d)肺疾病；(e)腎臟疾病；(f)皮膚病；(g)骨骼肌疾病；(h)脂肪組織疾病；(i)胃腸道疾病；(j)胰腺疾病；(k)生殖器官疾病；(l)神經疾病；(m)軟骨疾病；(n)骨病；(o)結締組織疾病；(p)細胞死亡；或(q)表達TWEAK受體的組織的病理狀況。
41.按照權利要求40的用途，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑選自(a)抗TWEAK抗體；(b)抗TWEAK受體抗體；(c)TWEAK多肽片段；(d)TWEAK多肽類似物；(e)TWEAK突變蛋白；(f)TWEAK模擬物；(g)TWEAK融合蛋白；(h)TWEAK受體多肽片段；(i)TWEAK受體多肽類似物；(j)TWEAK受體突變蛋白；(k)TWEAK受體模擬物；(l)TWEAK受體融合蛋白；(m)有機化合物；或(n)無機化合物。
42.TWEAK拮抗劑在制備用于在機體中治療TWEAK相關病癥的藥物組合物中的用途，其中所述TWEAK拮抗劑能夠干擾第一種TWEAK多肽與一種分子的作用，該分子選自細胞受體、第二種TWEAK多肽和與TWEAK相互作用的配偶體。
全文摘要
本發明提供用于治療TWEAK相關病癥的方法和試劑，該病癥包括心臟、肝臟、腎臟、肺、脂肪、骨骼、肌肉、神經、骨和軟骨的病癥。本發明還提供用于鑒定治療TWEAK相關病癥的TWEAK的激動劑或拮抗劑的方法。此外，本發明提供表達編碼TWEAK多肽或其片段、類似物或突變體的外源DNA的轉基因動物，以及用這種動物來鑒定TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。本發明還提供用于診斷基于TWEAK表達的疾病的方法。本發明還提供用TWEAK多肽、激動劑或拮抗劑來影響祖細胞的細胞分化的方法。
文檔編號G01N33/53GK1658901SQ03813317
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月9日 優先權日2002年4月9日
發明者琳達·伯克利, 阿尼拉·賈庫博夫斯基, 蒂莫西·鄭, 咸庚旼 申請人:比奧根艾迪克Ma公司