用于測定復合生物介質中瞬時蛋白水解活性濃度的診斷測試的制作方法

專利名稱：用于測定復合生物介質中瞬時蛋白水解活性濃度的診斷測試的制作方法
技術領域：
本發明屬于診斷領域，更具體而言，涉及一種實時測定在血液或其它體液中瞬時存在的生物活性酶的濃度進程的方法，還涉及一種實施該方法的測試試劑盒。
背景技術：
a.引言在諸如消化、發炎、血凝和血栓形成的許多過程中，蛋白水解酶在體液中的產生和分解是一個關鍵因素。給出一個例子凝血酶是一種瞬時存在于凝血中的酶，是止血和形成血栓的關鍵酶。在半數以上的致殘和致命的疾病中，止血血栓形成系統(HTS)紊亂是關鍵的。從數量上較不重要的那些病，血友病和肺栓塞，易于引起注意。未被廣泛地認識到的是，動脈血栓引起冠狀動脈梗塞或十分之一的老年人可能由于阻塞腦動脈的凝塊(基于心房纖顫和頸動脈栓塞的栓塞)而喪失腦功能，或病情嚴重的病人可能會由于凝血系統的紊亂而出血死亡(事故的受害者和具有致命的血管內凝血的患有膿毒病的病人)。還未被充分認識到如下事實，更多人死于動脈血栓而非惡意行為，更多人死于靜脈血栓而非事故。考慮到這種醫學上的重要性，令人吃驚的是目前臨床醫生竟然對HTS沒有有效的功能檢測。
在體液中存在著若干在生理學上更為重要的生化系統，其通過蛋白水解酶的激活及隨后的失活而起作用，例如，血液中的凝固系統、溶血纖系統和補體系統和腸胃液中的消化酶。為了評估這些系統的生物功能，重要的是能夠及時跟蹤該蛋白水解活性在體外的體液樣品中被觸發后發展的過程。這種功能評估具有極其重要的診斷重要性，因為這些系統的失調可導致致命疾病如冠狀動脈梗塞、中風或致命的出血(血凝固和纖維蛋白溶解)、全身感染和自體免疫性疾病(補體系統)或擾亂食物吸收(腸胃液)。
在止血和形成血栓中，凝固時間是目前可利用的最好評估方法，它們對輕微止血障礙(例如，血友病攜帶者、輕度肝病)、或對導致血栓癥風險提高的升高的凝固力不敏感。凝固試驗常常需要適應于特定的用途。例如，可將促凝血酶原激酶時間(＝凝血酶原時間(PT)，＝快速時間)用于診斷嚴重的肝病、或使用抗凝血劑但沒有血友病延遲的治療、或肝素治療。臨床凝固實驗室的許多科學技術停留于知道如何解釋由不同類型的凝固時間、血小板凝聚、出血時間等獲得的分散信息。
綜合檢測的不足可通過對凝固系統的單組分的許多復雜檢測得到部分補償，檢測之多使得在每種特定情況下都應進行明智的選擇，這是臨床止血實驗室特定知識的另一半。
b.凝血酶產生的機理在血漿中凝血酶產生的機理可以示例如下。組織因子(TF)豐富地，但不是唯一地存在于管壁上。當血管損傷時，血液進入組織，血漿蛋白因子VIIa(VIIa)可與TF互相作用。這在血漿蛋白和血小板之間觸發了一套極其復雜的交互作用，其導致了在時間和空間上留存有限的凝血酶的瞬時暴發，結果傷口停止流血而凝固不會擴展到身體的其它部分。
該機理看起來可能是如此復雜，充滿了正負反饋的反應，使得其作用不能通過各部分的知識進行預測(不能分解的復雜性)。因而，如果一個人想評估止血系統的功能，就必須像在體內、或身體的隔離部分，即血液或富含血小板的血漿那樣探查凝血酶的產生。血小板和血漿因子之間的相互作用具有特殊的重要性，由貧血小板的血漿獲得的信息本質上是有缺陷的。參見，例如Béguin S.，R.Kumar，I.Keularts，U.Seligsohn，B.C.Coller and H.C.Hemker，Fibrin-Dependent PlateletProcoagulant Activity Requires GPIb Receptors and Von WillebrandFactor，Blood(1999)93564-570；Béguin，S.and R.Kumar，supra(1997)]。
凝固血漿中形成的所有凝血酶的一個重要部分(≈30％)附著于血纖維蛋白凝塊上。附著于凝塊中的凝血酶仍保留其血栓形成性能，它可以使纖維蛋白原、激活因子V，VIII和XI、及血小板凝固[Béguin，S.and R.Kumar，Thromb.Haemost.(1997)78590-594；Kumar，R.，S.Béguin，and H.C.Hemker，Thromb.Haemost.(1994)72713-721，and(1995)74962-968]。它只是部分地被抗凝血酶抑制。因此，重要的是當探查凝固系統的功能時，纖維蛋白是存在的。
為了評估這種系統的功能以用于診斷目的和抗血栓藥物的安全使用，已經開發出了對該凝固系統中的單個組分進行檢測的許多方法，以下將對其作進一步的說明。
如前面所述，在損傷部位產生的凝血酶活性對于繼而發生的止血-血栓形成反應的程度是一個重要的決定因素。大部分凝血酶(＞95％)是在凝固后產生的，因此凝固時間并不是自然而然的有效指標。凝血中的凝血酶活性是一種瞬時現象，因此應該在凝固過程中進行測定。
在凝血或血漿中凝血酶形成的典型進程，也叫作凝血酶產生曲線，示于表1中。在沒有可觀察到的凝血酶形成的時期之后，其濃度陡然上升，達到頂峰然后再下降。參數是滯后時間、曲線下的面積(AUC)，也叫作內生凝血酶勢(ETP，參見下面)、峰高、和達到峰值所需的時間。
c.相關的現有技術

圖1所示的凝血酶產生曲線是典型地通過對從凝固血液或血漿中短時間內取出的少量次級樣品中的凝血酶含量進行測定獲得的。參見，例如R.Biggs and R.G.Macfarlane，Human Blood Coagulation and itsDisorders，Blackwell Scientific Publications，Oxford 1953；W.Seegers，Prothombin，Harvard University Press，Cambridge Mass.1962。該方法通常需要對次級樣品的獨立分析，使得僅3-5個曲線的同時測定就要連續地占用一個熟練的實驗工。它是如此地勞動密集，以至于使之不能應用于臨床或藥學的常規程序。
EP-A-0 420 332(等同于US 5,192,689)披露了一種通過測定由人造底物在凝固期間生成的產物的量，來測定已存在于凝固血液或血漿樣品中的凝血酶量的方法。該量與凝血酶產生曲線下的面積，也叫作內生凝血酶勢ETP成正比。該方法包括將凝血酶形成激活物同凝血酶底物一起加入到凝固血液或血漿樣品中，其中對凝血酶底物的用量和動力學特性進行選擇，使得樣品中產生的凝血酶量不能把所述凝血酶底物消耗完，從而生成一種轉化產物，測定所生成的所述轉化產物的量，并由此確定樣品中的內生凝血酶勢。可用以下反應說明這種ETP-法 3)凝血酶+抗血栓藥→非活性復合物 所有反應均不可逆，因此凝血酶只是暫時地存在于反應混合物中。當凝血酶存在時，其參與反應4，結果，底物的轉化度指示了凝血酶催化該反應所經過的時間和達到的時間。
重要的是底物量不能在凝血酶消失前耗盡。為了將底物的量轉化為所產生的凝血酶活性總量的精確代表，在任意時刻反應速率應與凝血酶濃度成正比。這種ETP法的本質是作為終點法來測定凝血酶勢，而沒有同樣地測定凝血酶/時間曲線。如果短促地測定底物，終點就只是所形成產物的最大量，這種數據是沒有任何意義的。
另外，在實際操作中該ETP-法的實施采用了可通過光密度測定檢測出的發色性底物，即帶有發色性離去基團的底物。纖維蛋白原，和相應的血小板必須從血漿中除去，因為凝血酶導致的纖維蛋白原-纖維蛋白轉化所引起的混亂使得進一步的測定成為不可能。但是，纖維蛋白原和血小板是凝固系統的重要組分，對凝血酶的形成進程有影響。這對應用光密度作為檢測方式形成了嚴重的限制。因此，評估含血小板和/或纖維蛋白原的血漿的ETP是不可能的。
已經嘗試了通過以下方法對凝血酶濃度進行連續監測在凝固樣品中加入適當的凝血酶底物，然后監測酰胺水解分裂產物。例如，采用發色性底物并檢測光密度，以監測對硝基苯胺的發展(Hemker HC，S.Wielders，H.Kessels，S.BéguinThromb Haemost.(1993)70(4)617-24；Hemker HC，and S.BéguinThromb Haemost.(1995)74(1)134-8)。如果該測試中的反應速率僅取決于凝血酶濃度，且信號與產物的量成正比，那么產物曲線的斜率就正比于存在的凝血酶量，結果，若比例常數(Kc)是已知的，就可以從產物曲線的一階導數獲得凝血酶產生曲線。
但是，實際上反應速率并不僅僅取決于凝血酶濃度，信號并不一定與產物量成正比，且Kc是未知的。原因如下A底物消耗信號不但取決于樣品中凝血酶的活性，還取決于底物的量，該量恰由于酶活性本身而及時降低。這種效應通過加入過量的底物而削弱，但僅削弱到一定限度。底物可逆地結合到凝血酶的活性中心上，從而使凝血酶不被天然的抗凝血酶鈍化。消除底物消耗效應至可接受的程度，其代價是延長實驗，使之持續約兩小時。(所加底物越多，被占用而不能用于天然鈍化過程的酶分子就越多。這延長了實驗的持續時間。在1×Km時反應在30min后結束，在5Km時獲得了對底物消耗的實際獨立性，但反應持續90min)。另外，在這種底物濃度下，凝血酶抑制會干擾反饋反應，不再能保證天然過程的測定。這也是下述情況的原因在打算從底物的轉化總量評估曲線下面積的方法中，必須加入過量的底物，這使得需要加入額外的抗凝血酶以使實驗可行(參見以上討論過的EP-A-0 420 332)。
B血漿樣品凝固時光密度的改變。使用發色性底物意味著除去纖維蛋白原，結果即除去了血小板，這導致在凝固時光散射出現欺騙性的OD升高。但是，纖維蛋白原和血小板是對凝血酶的形成過程產生影響的凝固系統的重要成分(參見以上內容)。這對于將光密度法作為檢測方法形成了嚴重的限制。可通過使用產生熒光產物的底物繞過這個問題[H.C.Hemker et al.The thrombogrammonitoring thrombingeneration in platelet rich plasma.Thromb Haemost.83589-91(2000)]。但是，這又引起了下一個問題C在熒光測量中，信號并不與產物的量線性相關。特別是熒光信號并不線性地取決于熒光產物的濃度，因為熒光分子吸收其它產物分子的光，即所謂的“內濾波效應”。對于熒光產物，為了限制底物消耗效應，而根據需要將底物的濃度提高到數倍于Km時，也自然地提高了內濾波效應。
問題A對所有連續方法是普遍的。問題B可通過采用熒光底物繞過，但它引起了C問題。
D即使不存在A、B和C問題，還有將反應速率關聯到凝血酶濃度的難題，即，確定校準常數Kc。這種關系隨實驗設置的不同而變化(例如對于不同的熒光計是不同的)、隨樣品的不同(例如，由于血漿顏色的變化)而變化。在樣品中添加已知的標準量的凝血酶是不可能的，因為所添加的酶會干擾生理反應。也不可能在非凝固的平行樣品中加入凝血酶，因為它會在血漿中鈍化。
本發明的目的是通過提供一種涉及測定血液或血漿樣品中凝血酶的方法來消除這些缺點，該方法與上述的ETP-法有本質的不同，因為它不是對產物的量進行終點測定，而是實時地測定凝血酶濃度曲線的進程并提供連續的信號，從而給出諸如滯后時間和峰高的有關參數的更有價值和更精確的信息。后者對于測定凝固機構活性(將在下面說明)的微妙差異更為重要。換句話說，這種新方法并不像ETP-法那樣提供樣品中已存在的凝血酶量的單一值，而是實時提供瞬時存在于樣品中的凝血酶濃度的進程。
發明概述現在已令人吃驚地發現，上述缺點可通過測定帶有或不帶有血小板的凝固血漿中的凝血酶濃度來方便地消除，所述測定通過如下方法進行監測適當的信號底物的分裂，并將其與平行樣品中恒定已知的凝血酶活性進行比較。
因此，根據本發明的一個方面，提供了一種實時測定在第一生物樣品中蛋白水解活性從樣品中出現和消失的進程的方法，該方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入蛋白酶激活物以產生蛋白水解活性；b)向步驟a)中加入信號底物，所述信號底物引起與產生的蛋白水解活性導致的反應所形成的轉化產物量相關的可檢測信號；c)加入一種工具(means)，該工具對于步驟b)中定義的信號底物具有恒定已知的穩定蛋白水解活性，而對于其中蛋白水解活性未被觸發的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號底物，所述信號底物通過具有已知的穩定蛋白水解活性的工具導致的反應引起可檢測信號；e)測定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號發展的時間進程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時導出在第一樣品中蛋白水解活性的進程。
在本發明的一個優選實施方案中，提供了一種在第一血液或血漿樣品中實時測定蛋白水解活性從樣品中出現和消失的進程的方法，所述蛋白水解活性主要是溶解血栓活性，所述方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入凝血酶形成激活物以形成凝血酶；b)向步驟a)中加入信號底物，所述信號底物引起與形成的凝血酶導致的反應所形成的轉化產物量相關的可檢測信號；c)加入一種工具，該工具對于步驟b)中定義的信號底物具有恒定已知的穩定凝血酶活性，而對于其中凝血酶活性未被觸發的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號底物，所述信號底物通過具有已知的穩定凝血酶活性的工具導致的反應引起可檢測信號；e)測定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號發展的時間進程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時導出在第一樣品中凝血酶活性的進程。
第一生物樣品通常選自血液，包括富血小板血漿、貧血小板血漿、或無血小板血漿在內的血漿，唾液，血清，尿，腦脊髓液，精液，和糞便。
當在血液樣品上實施本發明的方法時，血液通常是收集在裝有檸檬酸鈉或EDTA等的管中，使得血液中的游離鈣離子被束縛，阻止了凝血酶的形成和凝固。因此，為了啟動凝血酶的產生，應該在測定開始之前立刻加入鈣。但是，如果血液不是收集在檸檬酸鈉等中，就不需要這樣添加鈣。例如在以如下方式使用該方法時使得可以在取得血液后的幾分鐘內開始實驗。
所要測定的蛋白水解活性通常選自激活的凝固因子活性，包括凝血酶、激活的溶血纖因子活性、和補體系統活性的激活組分。按照本發明的方法從血液或血漿樣品中實時測定凝血酶活性的進程是優選的本發明方法中所用的信號底物優選選自含有離去基團的化合物，所述離去基團通過形成的蛋白水解酶導致的反應產生可檢測的轉化產物。該轉化產物通常通過光譜學測定，特別是通過熒光(優選)、光密度和NMR等測定。因此，所述離去基團通常為熒光基團、發色基團、釋放氫離子的基團等。用于實施本發明方法的一種適宜和優選的信號底物是Z-Gly-Gly-Arg-AMC。另外，適宜的可檢測轉化產物包括對硝基苯胺和7-氨基-4-甲基-香豆素。
如上定義的、用于實施本發明方法的具有恒定已知的穩定蛋白水解活性的合適工具包括α2-巨球蛋白-凝血酶復合物(優選)、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復合物、和γ凝血酶。另外，可以使用在次級識別部位進行改性的任何蛋白水解酶，因為其活性中心保持完整，而其與反應混合物中的蛋白質的功能性相互作用已被消除。
用于實施本發明方法的有用蛋白酶激活物包括鈣離子、磷脂、組織因子、可溶性組織因子、促凝血酶原激酶、高嶺土和鞣花酸(elagicacid)。
根據本發明的另一方面，所述第一生物樣品還包括一種藥劑，該藥劑將被測試其對正在研究的蛋白水解系統，如止血-血栓形成系統的影響。可在本發明的方法中測試的適宜藥劑是抗血栓劑，如抗血小板劑和抗凝血劑，例如肝素、硫酸皮膚素、直接凝血酶抑制劑，例如水蛭素、阿加曲班(argatroban)或美加拉群(melagatran)、和Xa因子抑制劑，例如稠抗凝血蛋白。
根據本發明的又一方面，提供了一種試劑盒來實施本發明方法，用于如上所定義的實時測定蛋白水解活性，尤其是溶解血栓活性的進程。該試劑盒方便地包括在合適的容器或其它常規包裝裝置中的一種或多種下列組分-一種已知濃度的α2M-凝血酶復合物；-一種用于富血小板血漿以啟動凝固反應的PRP試劑；-一種用于貧血小板血漿或無血小板血漿以啟動凝固反應的PPP試劑；-一種添加劑，該添加劑有助于診斷溶解血栓活性進程，特別是在遇到或預期有止血-血栓形成系統的特定的反常情況下。適宜的添加劑為例如凝血調節蛋白或激活的蛋白質C，其在診斷V Leiden因子或特定的抗血栓藥或抗血小板藥上特別有用。
-一種含有信號底物的試劑；-一種有助于計算凝血酶活性曲線的軟件程序；-一份使用手冊。
該試劑盒可適當地包括凍干試劑。
下面將對本發明的這些及其它目的進行更詳細的說明。
附圖簡述圖1為凝血酶產生曲線，顯示了在凝固血液或血漿中凝血酶形成的典型進程，通過二次采樣測定。
圖2顯示了在加熱的含有熒光底物的血漿或緩沖劑(上部符號線)中添加凝血酶(下部符號線)和α2-巨球蛋白-凝血酶(粗線)后熒光信號的產生。
圖3顯示了在兩份加入了相同濃度的熒光底物的相同血漿樣品中的原始熒光信號。在一個樣品中加入了凝血酶產生激活物，導致凝血酶的產生。在另一個樣品中加入了導致穩定的酰胺水解活性的已知濃度的α2-巨球蛋白-凝血酶復合物。
粗線凝血酶產生已被激活的樣品中產生的信號細線已加入了α2-巨球蛋白-凝血酶復合物的樣品中產生的信號圖4顯示了圖1中信號的一階導數。
粗線出現凝血酶產生的樣品的dFU/dt細線已加入了已知濃度的α2-巨球蛋白-凝血酶復合物的樣品的dFU/dt圖5顯示了兩個在血漿中的凝血酶產生曲線。粗線未對底物消耗或內濾波效應進行校正的實時凝血酶濃度；細線對底物消耗或內濾波效應進行校正后的實時凝血酶濃度。在這兩種情況下，凝血酶濃度都是通過血漿中α2-巨球蛋白-凝血酶復合物的已知活性，從熒光底物的初始轉化速率進行測定的。
圖6顯示了同時測定的來自24個凝血酶產生的平均值和置信界限。曲線A描述了正常血漿，曲線B描述了除去纖維蛋白原的正常血漿。
圖7顯示了對由各重復四次的三個個體進行同時測定得到的凝血酶曲線。
圖8顯示了在不同的六天內、從重復四次的一個個體的PRP得到的曲線。
圖9分別顯示了健康供體的富血小板血漿和用血小板激活抑制劑處理的相同血漿中凝血酶的產生曲線。
定義本文使用的與血液或血漿樣品中產生的蛋白水解酶有關的術語“瞬時活性”是指一旦生理進程通過本領域熟知的方法啟動，酶活性首先升高，然后再降低到最終的(接近)零活性。
本文使用的術語“復合生物介質”是指血漿、帶有血細胞或整個血液或任何其它源自身體的流體或其它成分的血漿，其中會發生酶活化和酶失活的生理過程。
本文使用的術語“實時”是指在樣品于反應容器中活化和失活的同時，顯示介質中酶濃度的進程。
本文使用的術語“滯后時間”是指在凝血酶的形成真正開始之前所經過的時間。
本文使用的術語“峰高”是指所達到的最大凝血酶活性。
本文使用的術語“上升坡的陡度”是指凝血酶濃度達到峰值前的升高速率。
本文使用的術語“達到峰值的時間”是指從反應開始至達到峰值的時間。
本文使用的術語“ETP”是指直到凝血酶活性達到(接近)零時的曲線的時間積分。
本文使用的術語“信號底物”指可被介質中的蛋白水解酶分裂的底物，從其上分裂出可通過光學、NMR或其它方法檢測出的離去基團。可光學檢測出的離去基團為例如對硝基苯胺和7-酰氨基-4-甲基-香豆素。對硝基苯胺在405nm產生吸收，7-酰氨基-4-甲基-香豆素是熒光性的(在390nm處激發，在460nm處發射)。NMR-活性離去基團的例子是那些含有31P、13C、或任何其它可被NMR或相似技術檢測出的原子的基團。另外，H+離子可以用作離去基團，它可以通過測定pH值的變化檢測出來。
發明詳述為了實施本發明，下面將給出對止血和血栓形成系統(HTS)的典型描述，重點在于其最重要的酶，凝血酶。但應該注意的是，本發明也涉及其它酶和其它生理系統，如血液和血漿中凝固系統的其它激活的蛋白水解酶(因子)、在血液和血漿中溶血纖系統的胞漿素和其它激活的成分、在血液和血漿中激活的補體因子、胃液中的胃蛋白酶、十二指腸液中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等。
如上所述，通常瞬時酶活性可通過添加一種在轉變時產生信號的底物來測定。采用本領域中的熒光底物時，該方法典型地包括將熒光底物添加到凝血酶的產生已經被觸發(使用本領域熟知的方法)的血液(或另一種生物樣品)中。底物分裂后，就形成了可在適當的激發和發射波長上可測定的熒光產物。
通常，在相似的情況下，可通過以下方法達到該目的向第二個可完全比較的樣品中添加固定量的具有已知活性的相同底物酶，也叫“校準物”，然后將所探測樣品的活性與該已知活性進行實時比較。但是，在現在的情況下，因為其不穩定且繼而會從血漿中消失，就不可能將凝血酶本身用作校準物。另外，在添加凝血酶后的即刻，凝塊隨之形成，這保證可阻止試劑的適當混合并導致不規律的結果。
但是，除了上述問題，在Y軸上的單位會是不定的，隨實驗的進展而變化，因為由于所謂的內濾波效應及伴隨的可用底物的減少，轉化產物濃度的提高會改變凝血酶濃度與信號產生速率之間的關系。并且，實驗的實施是在血液或血漿中，具有供體依賴性，會通過光吸收和熒光淬滅對信號產生影響。
因此應該采取某種方法對每一供體的每一樣品進行測定，使得Y軸上的任意單位可實時地歸因于凝血酶活性的有效量，表示為摩爾單位的凝血酶濃度。
本發明基于以下令人吃驚的發現某種底物表現出恒定的類似凝血酶的活性，這可被適當地用于將絕對值(nM)分配到由分子所獲得的信號的一階導數上，凝血酶在凝固血漿中出現和消失時將所述分子分裂。一種適宜的特別優選的物質是α2-巨球蛋白(本文也稱為α2-M或α2M)與凝血酶的不可逆復合物、或可替代地為葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復合物。
如果凝血酶在樣品中的活性是通過例如其產生熒光性分子的酰胺水解行為進行監測，由于多種原因所獲得的信號不能與凝血酶活性直接相關。每單位時間里所形成的熒光產物量與熒光信號的升高之間的關系取決于儀器、樣品的光吸收性能和樣品中已有的產物量(所謂的內濾波效應)。凝血酶量與熒光產物量之間的關系取決于已經消耗的底物量。即使在某一時間內產物的形成(dP/dt)與凝血酶活性之間存在有直接關系，它也具有儀器和樣品依賴性，且在實驗過程中發生改變。
凝血酶在系統觸發后的出現和消失正是凝固系統的特性。出現和消失速率的病理學變化導致嚴重的疾病。因此，凝血酶在樣品中的消失速率是一個重要的生物學變量，必須在待測的樣品中保持原樣。該相同特性使得不可能得到一種在血漿中具有恒定活性的凝血酶制劑，該制劑可用作校準物而給凝血酶活性分配絕對值。
本發明的重要因素是，通過將凝固血漿中的信號與具有恒定的類似凝血酶活性的工具相比較，消除儀器、樣品和時間信賴性。已經發現，α2-巨球蛋白-凝血酶復合物具有所期望的特性，可作為這種提供恒定的類似凝血酶活性的極好工具，這種活性可由本領域的技術人員方便地測定。將凝血酶附著在α2-巨球蛋白上使其能夠對存在于血漿中的天然滅活劑免疫，但又保留其分裂小底物的能力，該小底物在分裂后可釋放出具有光吸收性、熒光性或其它信號性的分子。由于α2-巨球蛋白能夠結合很多種蛋白水解酶，可以將其用于制備其它蛋白水解酶(例如，激活的凝固因子X、血纖蛋白溶酶、胰蛋白酶(trypsis)、胃蛋白酶、補體因子3)的校準物。如上所述，發現葡萄球菌凝固酶和凝血酶原的復合物具有相似的特性，因為它也可以提供恒定的類似凝血酶的活性，該活性對血漿抑制劑不敏感，從而可以作為替代的校準系統用于其它的蛋白水解酶。
本發明的方法包括將血液或血漿樣品分成兩份，或僅僅使用兩份基本相同的樣品，向這兩份樣品中均加入一種在單位時間內產生一定量的可檢測信號的底物，信號的量與存在的凝血酶的活性相關。在一份樣品中，凝血酶的產生(即凝血)通過本領域熟知的方法觸發。向另一份樣品中加入一種具有獨立測定的恒定的凝血酶活性的制劑，優選加入上述的α2-巨球蛋白-凝血酶復合物。優選同時在這兩份樣品中測量產物形成。在凝固樣品中任意時刻存在的凝血酶的精確摩爾量是通過如下方法得到的將該樣品中產生的信號與同時測得的來自已加入具有已知的恒定凝血酶活性的制劑但凝血酶的形成未被觸發的樣品的信號進行比較。
除了α2-巨球蛋白-凝血酶復合物之外，具有酰胺水解性但沒有凝血酶生物活性的替代性酶是葡萄球菌凝固酶，其由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產生。這種酶能夠結合到血漿中存在的凝血酶原上。葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復合物能夠不被AT抑制地轉化少量凝血酶底物。例如，葡萄球菌凝固酶、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原或α2M-凝血酶復合物以一定量加入到測試樣品中，用量通常為5至1000毫微摩/升、優選約100毫微摩/升。
由本發明的方法得到的曲線的特征在于諸如滯后時間、曲線下的面積、峰高、上升斜率的陡度、達到峰值的時間的參數及其它的類似于數學函數T＝a.t^b.exp-ct(在滯后時間后開始)的曲線的所有參數。凝血酶的濃度通常開始于零，升高到通常為50-500毫微摩值的峰高，然后再回到零。滯后時間通常為0-20分鐘，在凝血酶濃度約高于10毫微摩時馬上結束。此時，也出現凝固的形成，而峰值發生在幾分鐘后。在此描述的凝血酶產生曲線的參數(也稱Thrombogram，是Synapse B.V.的注冊商標)為復合參數，其受到一大組濃度及相互作用的凝固因子的反應常數的影響。它們反映了這些變量的所有變化，所述變量就像在臨床、治療學或其它設置中那樣影響止血血栓形成系統的功能。因此與測量的止血血栓形成系統有關的所有抗血栓藥和所有疾病會影響這些參數。在任何類型的抗血栓形成處理或止血凝固紊亂期間，滯后時間及達到峰值的時間通常會升高，峰高及曲線下的面積通常會降低。另一方面，在高凝血狀態下，這些參數向相反的方向移動。Thrombogram以這種方式真實地反映了血液的凝固性，并給出血栓形成或止血風險的指示。
本發明還涉及如本文所述用于實施本發明方法的試劑盒，以及涉及用于常規地實施本發明方法的測定的設備、和涉及批量的測試元件源，以利于操作可處理大量測試樣品的自動化設備。
在一個優選的實施方案中，測試試劑盒適當地包括1.一種由已知濃度的α2-巨球蛋白-凝血酶復合物組成的凝血酶“校準物”，所述復合物任選地為凍干形式。
2.一種PRP-試劑，用于富血小板血漿，且含有觸發劑以啟動凝固反應，通常為促凝血酶原激酶或重組再脂質化(relipidated)組織因子或可溶性組織因子，任選地為凍干形式。可替代地，它可含有激活固有系統如鞣花酸或高嶺土的觸發劑。
3.一種PPP-試劑，用于貧血小板血漿或無血小板血漿，含有與促凝血酶原激酶或重組再脂質化組織因子或可溶性組織因子組合的磷脂囊，任選地為凍干形式。可替代地，它可含有激活固有系統如鞣花酸或高嶺土的觸發劑。
4.含有來自PPP或PRP試劑的化合物加上特定化合物的試劑，使Thrombogram對凝固系統的特定異常更為敏感。例如，沒有磷脂的PPP-試劑會使Thrombogram對血漿中存在的微粒敏感。添加了凝血調節蛋白或激活的蛋白質C(APC)的PPP或PRP試劑使得Thrombogram對天然抗凝固系統即已知的蛋白質C系統的所有紊亂更為敏感。添加了激活的蛋白質C(APC)的PPP或PRP試劑使得Thrombogram對V Leiden因子及V因子和/或VIII因子的所謂APC抗性的其它的先天或獲得形式很敏感。沒有組織因子的PRP-或PPP-試劑使Thrombogram對樣品中內源性組織因子活性的存在敏感(參見Giesen et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1999 96(5)2311-5.)。
5.含有信號底物如Z-Gly-Gly-Arg-AMC并通常還含有鈣離子的試劑。
6.一種有利于本方法中包括的校準計算，以及時獲得凝血酶濃度的軟件程序。專門設計用來實施本發明方法、且注冊商標為Thrombinoscope的適宜軟件程序可從申請人Synapse B.V.獲得，可通過其網址www.thrombin.com或通過電子郵件info@thrombin.com與其聯系。
7.一份指導如何使用試劑盒的手冊也可以成為測試試劑盒的一部分。
PPP和PRP試劑的不同在于磷脂的含量，為了能夠測定凝血酶形成中血小板的貢獻，在PRP情況下該含量應該是低的。
測試試劑盒方便地以下面的方式使用向80微升PPP中加入20BL的PPP試劑，并向另外80μL相同血漿的樣品中加入20μL凝血酶校準劑。然后向兩種樣品中加入熒光底物和鈣的混合物20μL，反應開始在熒光計中進行。通常在每種條件下要再測定80μL樣品，可通過專用的軟件程序計算每種條件下的平均值和標準偏差。
對于本領域的熟練技術人員可以理解的是，本發明的方法和試劑盒并不局限于使用熒光底物，而可以潛在地用于發色性、NMR、化學發光及其它類似的檢驗方法。但是，目前的熒光底物是優選的選擇，因為相對于任何其它可利用的方法，其可以在纖維蛋白的存在下進行評估，因而也可以測定纖維蛋白上的凝血酶。并且，可以避免通常很麻煩的脫纖維蛋白，成為在臨床上易于操作的更簡單和更可靠的方法。另外，本方法中使用熒光底物，這允許在血小板的存在的情況下評估凝血酶(正如本領域所熟知的，血小板的激活需要纖維蛋白)，因而可以測定抗血小板藥物，可以測定血小板病理學，從而可進行更適當的治療。
圖9是一個實驗實施例，其中對健康供體的富血小板血漿及用已知血小板激活抑制劑(ReoPro)處理過的相同血漿進行測定。兩條曲線形狀不同，差異在于更長的TTP和更低的峰高，但這兩條曲線下的面積在3％以內是相同的。這種對峰高和TTP有影響、對ETP沒有明顯影響的情況也見于許多輕微的凝固因子缺陷中，如von Willebrand病、VII因子或V因子缺陷、及VIII或IX因子缺陷(血友病)。在許多情況下，峰高和TTP已被證明是凝血酶產生曲線上比ETP自身敏感得多的參數。
本發明的方法可以適當地被用于診斷人和動物天生的、獲得的或藥物引起的高凝血或低凝血狀態，從而監測預防性治療或治療性治療，其中采用了抗血栓藥，和通常可影響凝固系統功能和以該系統障礙為特征的所有疾病狀態的所有藥物。
現在將通過下列實施例對本發明作進一步地說明，這些實施例絕不能被當作是對本發明范圍的限定。
實驗1、凝血酶校準物的制備α2-巨球蛋白的分離按照Barrett，A.J.，Alpha 2-macroglobulin，Methods Enzvmol，(1981)80(PtC)p.737-54.制備粗α2-巨球蛋白(α2M)。將該材料從檸檬酸化的牛血漿中分離。進行該過程，直到α2M在12％(w/v)的PEG-20000中沉淀出。將小丸溶解在100mM NaCl、20mM HEPES(pH7.9)中，用來制備α2M-凝血酶復合物(α2M-T)。
α2-巨球蛋白-凝血酶復合物的制備向α2M中加入12μM牛凝血酶原、6mM CaCl2、50μM磷脂囊(20％的腦磷脂酰絲氨酸，80％的蛋黃磷脂酰膽堿)、5nM牛Xa因子和0.78nM牛Va因子。室溫下攪拌該混合物30min，然后在4℃下保存過夜。除去形成的凝塊，并將制劑分成適當的量以通過凝膠過濾(尺寸排阻色譜法)進行凈化；即，在這種情況下中按40ml的量使用。現在可將制劑在-80℃下冷凍，直到進行進一步處理。
將40ml的α2M-T加到用100mM檸檬酸鈉、20mM HEPES(pH7.4)、0.02％NaN3平衡的Sephacryl柱(20cm2×90cm)中。在該柱的運行中，平衡緩沖劑以0.7ml/min的速率添加700ml，然后以3ml/min的速率添加。保留體積為774-846ml的部分含有α2M-T。材料的洗提形成尖峰。
α2M-T的濃度可通過其水解發色性底物82238的能力進行測定。水解發色性底物的能力被稱為酰胺水解活性。將制劑的酰胺水解活性調整到與600nM人凝血酶相同的活性，然后加入100nM的牛抗凝血酶和2U/ml肝素(LEO)。現在該材料已準備好用作凝血酶校準物。如需要，可將該材料按適當的量凍干。
2、向血漿中添加凝血酶或α2M-凝血酶當凝血酶加入到血漿中時，由于血漿中存在的凝血酶的天然抑制劑，其活性會立即降低。另一方面，相同活性的α2M-凝血酶導致直線彎曲，這僅僅是由于底物消耗和內濾波效應。圖1顯示了在96-井板的井中測定的熒光信號，向井中加入了凝血酶(100nM)或α2M-凝血酶復合物，以及熒光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(0.417μM，可從BACHEM獲得，商品目錄號#1-1140)。可以看到相對于α2M-凝血酶復合物(粗線)，凝血酶曲線(符號)的活性下降很快。在緩沖劑(20mMHepes，140mM NaCl，5g/l牛血清白蛋白(BSA)，pH7.35)中，這兩種制劑具有相同的活性(細線和符號)，并且也可觀察到緩沖劑中的熒光產量比血漿中的高。這是由于血漿的顏色與緩沖劑有顯著的差異。甚至由于在血漿顏色中供體對供體的不同也能產生信號量的顯著不同。這就強調了始終需要將特定供體血漿中的凝血酶活性與相同供體的血漿中已知校準物的活性進行比較。
3、α2M-凝血酶復合物活性的評價校準物的酰胺分解活性是通過將其活性與已知量的人凝血酶進行比較而測定的。該人凝血酶濃度通過活性部位滴定來測定，使凝血酶與在催化反應的第一部分反應非常迅速的底物進行相互作用，以釋放發色性產物，例如，酶迅速酰化而釋放出可測定的產物(如，對硝基苯胺)，然后由一種慢得多的反應結束該轉換反應。因此，產物的釋放正比與活性部位的數目。通過該凝血酶，可以精確地得知以單位時間內單位酶分子的轉化分子數目計的活性。比較是在以下條件下和在一種介質中進行的溫度、pH和底物濃度與實際實驗中的相同，在所述介質中凝血酶在實驗的時間界限(＜30min)內穩定的。這可以是緩沖劑(見上述內容和圖2)或加熱的血漿，即其中的凝血酶天然抑制劑已被加熱滅活(70℃下10分鐘)的血漿。
4、凝血酶產生的自動熒光測定首先說明一個實驗，在該實驗中對富血小板血漿樣品中的凝血酶產生進行測定。所用溶液富血小板的人血漿，根據Beguin，S.，T.Lindhout，and H.C.Hemker，The effect of trace amounts of tissue factoron thrombin generation in platelet rich plasma，its inhibition by heparin.Thromb Haemost，1989.61(1)p.25-9.獲得。緩沖劑A20mM Hepes，140mM NaCl，5g/l牛血清白蛋白(BSA)，pH7.35；緩沖劑C20mMHepes，140mM NaCl，BSA 60mg/mL，pH7.35，以0.02％的疊氮化鈉作為防腐劑。
FluCa溶液向1750μL緩沖劑C中加入200μL的1M CaCl2。將混合物加熱到37℃。然后噴入50μL的100mmol/l底物的DMSO溶液，并立即旋轉試管，獲得極清澈的溶液，其中底物為2.5mM，CaCl2為100mM，DMSO為2.5％。
將微量滴定板熒光計(Fluoroscan Ascent，Thermolab Systems，Helsinki，Finland)恒溫至37℃。在96-井圓底板中，向一個井加入20μL預熱的由濃度為30皮摩的重組組織因子的緩沖劑A溶液組成的觸發溶液，向另一個井中加入20μL預熱的由濃度為600毫微摩的α2M-凝血酶復合物組成的校準物；向這些井中的每一個加入80μL血漿。向熒光計的分配器中充入FluCa溶液，開始實驗。圖3顯示了產生的熒光信號。所獲得的熒光信號的一階導數示于圖4。
圖3所示的一階導數并未真實地代表凝血酶-時間曲線，原因有三個a)產物-熒光關系不是線性的，因為熒光分子在測量波長下也吸收光(內濾波效應)，b)底物有消耗，c)α2-巨球蛋白-凝血酶由實驗中產生的凝血酶而形成，α-巨球蛋白一般存在于任何血漿中。
實驗中α2M-凝血酶的形成效應是所有凝血酶產生測定的共有特征，其中通過其對少量信號底物的酰胺水解活性評價凝血酶，二次采樣和連續方法相似。校準該效應的方法已經被公布，是所屬領域人員已知的[Hemker，H.C.and S.Beguin，Thrombin generation in plasmaitsassessment via the endogenous thrombin potential.Thromb Haemost，1995.74(1)p.134-8]。
干擾效應a和b的校準可通過以下方式進行在線地連續由該樣品中產生的凝血酶所得信號的一階導數(O＝f(t))與另一樣品中校準物所產生信號的一階導數(S＝f(t))進行比較。后者很接近于與公式S＝B-A*t吻合的直線。A和B是在實驗中通過S＝f(t)由最吻合的直線連續算出的。校準值(R)通過下式得到R(t)＝B*SQRT(((B^2-4*A)*O(t))/(2*A))-(B^2/(2*A))實驗期間，在實施這些實驗的計算機的屏幕上連續地顯示所得到的曲線R＝f(t)(圖5A和B)。
5、同時實驗序號4所描述的實驗需要96井板中的兩個井。也可以在任何數量的可用井中同時進行重復實驗或不同的實驗。唯一的要求是給定血漿中的實驗總是伴有來自相同血漿的另一樣品中校準物信號的記錄。圖6顯示了24個同時實驗的信號的平均值和置信界限。可看出，存在纖維蛋白(原)時產生的凝血酶量更高，這表明該方法確實得到了凝塊束縛的凝血酶的活性。
圖7顯示了對三個不同個體進行各重復四次的同時測定得到的曲線。圖8顯示了由在不同的6天中測定的重復四次的一個個體的PRP得到的曲線。
本發明提供了一種實時地測定生物樣品中蛋白水解活性、特別是血液或血漿中凝血酶活性的進程的簡便試驗方法，該方法將其作為連續的信號提供出來，從而，與屬于本領域技術的方法如ETP-法相比，本方法給出了有關諸如滯后時間和峰高的參數的更有價值和更為精確的信息，像ETP-法這樣的方法只能對產物量進行終點測定。
無論從哪方面來看，本發明的公開內容都應被認為是說明性的而非限定性的，通過權利要求指定的本發明的范圍、及任何落在等同物的主旨和范圍內的改變都包含在內。
權利要求
1.一種實時測定在第一生物樣品中蛋白水解活性從樣品中出現和消失的進程的方法，該方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入蛋白酶激活物以產生蛋白水解活性；b)向步驟a)中加入信號底物，所述信號底物引起與產生的蛋白水解活性導致的反應所形成的轉化產物量相關的可檢測信號；c)加入一種工具，該工具對于步驟b)中定義的信號底物具有恒定已知的穩定蛋白水解活性，而對于其中蛋白水解活性未被觸發的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號底物，所述信號底物通過具有已知的穩定蛋白水解活性的工具導致的反應引起可檢測信號；e)測定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號發展的時間進程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時導出在第一樣品中蛋白水解活性的進程。
2.如權利要求1所述的方法，用于實時測定蛋白水解活性在第一血液或血漿樣品中從樣品中出現和消失的進程，所述蛋白水解活性主要是凝血酶活性，該方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入凝血酶形成激活物以形成凝血酶；b)向步驟a)中加入信號底物，所述信號底物引起與形成的凝血酶導致的反應所形成的轉化產物量相關的可檢測信號；c)加入一種工具，該工具對于步驟b)中定義的信號底物具有恒定已知的穩定蛋白水解活性，而對于其中凝血酶活性未被觸發的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號底物，所述信號底物通過具有已知的穩定凝血酶活性的工具導致的反應引起可檢測信號；e)測定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號發展的時間進程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時導出在第一樣品中凝血酶活性的進程。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中第一生物樣品選自血液，包括富血小板血漿、貧血小板血漿或無血小板血漿在內的血漿，唾液，血清，尿，腦脊髓液，精液，和糞便。
4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中蛋白水解活性選自激活的凝固因子活性，包括凝血酶、激活的溶血纖因子活性、和補體系統活性的激活組分。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中信號底物選自含有離去基團的化合物，所述離去基團通過形成的蛋白水解酶導致的反應產生可檢測的轉化產物。
6.如權利要求5所述的方法，其中信號底物為Z-Gly-Gly-Arg-AMC。
7.如權利要求5或6所述的方法，其中可檢測的轉化產物通過光譜學，特別是熒光、光密度和NMR測定。
8.如權利要求5至7中任一項所述的方法，其中離去基團為熒光基團、發色基團或釋放氫離子的基團。
9.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中可檢測的轉化產物是對硝基苯胺或7-氨基-4-甲基-香豆素。
10.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中具有恒定已知的穩定蛋白水解活性的工具選自α2-巨球蛋白-凝血酶復合物、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復合物和γ凝血酶。
11.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中蛋白酶激活物選自鈣離子、磷脂、組織因子、可溶性組織因子、促凝血酶原激酶、高嶺土和鞣花酸。
12.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一生物樣品還包括一種藥劑，該藥劑將被測試其對正在研究的蛋白水解系統的影響。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述蛋白水解系統是止血-血栓形成系統。
14.如權利要求12或13所述的方法，其中藥劑是抗血栓劑，如抗血小板劑或抗凝血劑。
15.如權利要求14所述的方法，其中抗血栓劑選自肝素、硫酸皮膚素、直接凝血酶抑制劑，例如水蛭素、阿加曲班或美加拉群、和Xa因子抑制劑，例如稠抗凝血蛋白。
16.用于實施權利要求1至15中任一項所述的方法的試劑盒，該試劑盒包括以下組件中的一種或多種-一種已知濃度的α2M-凝血酶復合物；-一種用于富血小板血漿以啟動凝固反應的PRP試劑；-一種用于貧血小板血漿或無血小板血漿以啟動凝固反應的PPP試劑；-一種有助于診斷溶解血栓活性進程的添加劑；-一種含有信號底物的試劑；-一種有助于計算凝血酶活性曲線的軟件程序；-一份使用手冊。
17.如權利要求16所述的試劑盒，該試劑盒含有凍干試劑。
全文摘要
本發明提供了一種實時測定在血液或血漿樣品中凝血酶活性從樣品中出現和消失的進程的方法，該方法包括向樣品中加入可在每個單位時間發出一定量可檢測信號的凝血酶底物，信號的量與存在的凝血酶量相關。同時，在凝血酶的產生未被觸發的相同血液或血漿的對照樣品中，測定具有恒定凝血酶活性的標準制劑的活性。通過將在凝血中測得的活性與同時測得的校準物進行比較，獲得在任意時刻存在的凝血酶的精確摩爾量。該方法尤其適用于診斷人和動物天生的、獲得的或藥物引起的高凝血狀態和低凝血狀態。本發明還提供了一種用于該方法的試劑盒。
文檔編號G01R33/465GK1650170SQ03809938
公開日2005年8月3日 申請日期2003年5月1日 優先權日2002年5月1日
發明者彼得·吉森, 亨德里克·C·赫姆克爾, 雷德·奧·迪耶里, 敘澤特·L·貝甘, 羅伯特·瓦根伍爾德 申請人:瑟納普斯有限責任公司