檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙及其檢測方法

專利名稱：檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體地說是涉及檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙及其檢測方法。
背景技術：
鹽酸克倫特羅(clenbuterol，Cl)(俗稱“瘦肉精”)，化學名稱為α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，又名雙氯胺、氯哮素、克喘寧，為β-腎上腺素激動劑的一種。用Cl喂養生豬，可提高瘦肉率，但人食用含Cl過量的肉品，會出現心率過速、心悸、肌肉震顫等心血管系統和神經系統的不良反應，嚴重危害人體健康。農業部、對外貿易經濟合作部和國家出入境檢驗檢疫局等部門多次發文嚴令禁止在動物生產中使用β-腎上腺素激動劑。但國內部分地區仍存在非法生產、使用“瘦肉精”等β-激動劑類產品的現象，并發生多起中毒事件。許多國家對飼料和食品中的Cl實施了嚴格的監控。在養殖場，Cl監測最經常采集的活體樣品是尿液，其它易于采集的有效樣品如血漿，奶，糞便和飼料也被經常使用。
目前，測定Cl的方法有高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)等。目前免疫測定法、ELISA和GC-MS的靈敏度能較好地滿足Cl殘留分析要求，應用較多，檢測限通常低于0.5μg/kg，前者是主要的篩選方法，后者則是成熟的確證方法。由于以上方法均需借助高檔的儀器和設備，成本高，同時對操作人員需要特殊培訓，實驗結果無法立即顯示。因此不適合于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象的快速篩查和監控。
ELISA檢測Cl已有多篇文獻報道，目前公開的專利為“一種鹽酸克倫特羅酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法”(申請號，02137941.6)。
免疫層析是出現于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異、高親和性的免疫反應。層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測線)，通過酶反應、或直接利用可目測的標記物(如膠體金)所看到的直觀的實驗現象(如顯色)而獲得測定結果。而游離標記物(即未與待測物結合的標記物)則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。
免疫層析用于測定Cl，目前公開的相關專利如下①樣本中的Cl/層析膜上的Cl共同競爭示蹤粒子標記的限量抗體，通過檢測條帶出現與否判斷結果。如本發明人先前公開的發明專利“一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的制備”(申請號，02131321.0)。另外，發明專利“鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條”(申請號，02101928.2)和實用新型專利“鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條”(申請號，02202033.0)也用了類似的方法。
②樣本中的Cl/示蹤粒子標記的Cl共同競爭層析膜上的限量抗體，通過檢測條帶出現與否判斷結果。例如，公開的實用新型專利“鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條(II)”(申請號，02228104.5)。
③樣本中的Cl/示蹤粒子標記的Cl共同競爭層析膜上的限量抗體，通過檢測條帶出現的條數判斷結果。例如，公開的專利“半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產和使用方法”(申請號，02139704.X)。
上述3種免疫層析檢測模式有一個共同的特點，就是用于定量時沒有標準品作參照，必需通過檢測體系中加入Cl/抗Cl抗體的量或選擇嚴格的檢測材料，通過控制檢測靈敏度的方法來定量。由此產生的缺點為生產工藝復雜化，或定量的準確性隨著保存時間的延長而發生變化。另外，上述3種免疫層析檢測模式不能同時檢測多個樣本，檢測模式1和2不能對鹽酸克倫特羅具體含量作一個初步判斷。而ELISA檢測Cl操作復雜，檢測步驟多，需要的試劑多，不能常溫保存，只能批量檢測，不適合于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象的快速篩查和監控。因此，迫切需要有一種簡單、快速、便于保存、適合于非批量、多個樣品現場篩查Cl的檢測試紙，并建立其檢測的方法。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足之處，而提供一種結構簡單、使用方便、保存時間長、可在并排的2-10張單元試紙條上分別加入樣本和標準品而同時進行非批量、多個樣品檢測的一種檢測鹽酸克倫特羅(clenbuterol，Cl)濃度的參比免疫層析試紙。
本發明的另一個目的是提供一種步驟簡單、快速、靈敏、準確的利用本發明的參比免疫試紙檢測鹽酸克倫特羅的方法。
本發明的目的通過以下的方案來實現制備檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙，它包括以下兩種形式A.試紙由底卡、面卡和參比免疫層析試紙芯組成，其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙芯固定在底卡和面卡之間，面卡上預留加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與單元試紙條的樣品墊對應，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜對應；B.試紙由底卡、面卡、參比免疫層析試紙芯和樣品杯組成其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙芯固定在底卡和面卡之間，單元試紙條的樣品墊伸出底卡和面卡之外，面卡上預留觀察窗，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜對應，樣品杯位于參比免疫層析試紙之下，每個樣品杯的位置與每條單元試紙條對應。
單元試紙條的層析膜上有1-4條鹽酸克倫特羅抗體線狀點樣的檢測線，示蹤粒子 結合墊上有示蹤粒子標記鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物的結合物；或者，單元試紙條的層析膜上有1-4條鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物線狀點樣的檢測線，示蹤粒子結合墊上有示蹤粒子標記鹽酸克倫特羅抗體的結合物。單元試紙條層析膜上的鹽酸克倫特羅抗體線狀點樣的檢測線或鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物線狀點樣的檢測線優選為1-2條。
用本發明的檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙檢測鹽酸克倫特羅的方法，包括按以下順序進行的步驟[1]樣品處理；[2]在參比免疫層析試紙的加樣孔上分別加入Cl標準和樣本，加入Cl標準與加入樣本的單元試紙條數為任意比例；或者，將形式B的參比免疫層析試紙芯的單元試紙條的樣品墊插入對應的樣品杯中，加入Cl標準與加入樣本的樣品杯數為任意比例；[3]用以下兩種方法中的任何一種檢測樣本中鹽酸克倫特羅的濃度①比較在相同的位置，樣本單元試紙條與標準單元試紙條出現條帶 的時間，樣本單元試紙條在相同位置出現條帶的時間比某標準單元試紙條出現的時間晚，則樣品內Cl濃度大于某標準濃度；②在相同時間內，比較樣本單元試紙條和單元試紙條出現的條帶顏色，在相同時間內，樣本單元試紙條在相同位置出現條帶的顏色比某標準單元試紙條出現的顏色淺，則樣本內Cl濃度大于某標準濃度。
用本發明的方法檢測鹽酸克倫特羅時，其檢測下限為1ng/ml。
本發明的檢測鹽酸克倫特羅參比免疫層析試紙制作方法如下[1]單元試紙的制作單元試紙條的層析膜上的檢測線用以下的模式1或模式2制備模式1用抗鹽酸克倫特羅抗體(ClenbuteroAntibody，Cl-Ab)在層析膜上線狀點樣作為檢測線。將硝酸纖維素膜(NC膜)按10-35mm寬的尺寸剪裁。Cl-Ab用緩沖液充分透析后，將濃度調整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測線之間的距離為2-12mm。
模式2用鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物(Clenbuterol-carrier protein，Cl-Cp)在層析膜上線狀點樣作為檢測線。將NC膜按10-35mm寬的尺寸剪裁。Cl-Cp溶液用緩沖液充分透析后，將濃度調整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測線之間的距離為2-12mm。
根據層析的原理，層析的距離離加樣孔越遠，層析的速度越慢，分辨率越高。本發明利用了層析的原理，采用多條層析膜檢測線，以提高分辨率，本發明根據被測樣品中Cl含量的范圍，采用的層析膜檢測線為1-4條，優選為1-2條。
單元試紙條的示蹤粒子結合物墊用以下的模式3或模式4制備模式3用示蹤粒子標記的Cl-Cp結合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結合物墊；模式4用示蹤粒子標記的Cl-Ab結合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結合物墊。
制備示蹤粒子結合物墊的示蹤粒子選自膠體金顆粒、膠體硒顆粒、乳膠顆粒，其制備和標記方法如下(a)膠體金顆粒膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；膠體金標記Cl-Cp/Cl-Ab取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH(標記Cl-Cp選用pH6.0-7.5，標記Cl-Ab選用pH7.5-9.0)，攪拌下將膠體金溶膠和Cl-Cp/Cl-Ab混合，再加入聚乙二醇水溶液，使其終濃度為0.05％。將粗制品在4,000-20,000×g下離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
(b)膠體硒顆粒膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內加入去離子水550ml和聚丙烯酸5-20g，通氮室溫攪拌并加入水合肼40-100ml，繼續攪拌10-30分鐘。將亞硒酸5-15g溶解于280ml水中，室溫攪拌下滴入反應混合液得到50-250nm紅色硒溶膠。
膠體硒標記Cl-Cp/Cl-AbCl-Cp/Cl-Ab用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(標記Cl-Cp選用pH6.0-7.5，標記Cl-Ab選用pH7.5-9.0)配成1-8mg/ml濃度溶液，取25μl加入25ml硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1ml1％的PEG 8000，混勻，于4℃以3,000-10,000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
(c)乳膠顆粒彩色乳膠顆粒購自Bangs Laboratories公司。
乳膠顆粒標記Cl-Cp/Cl-Ab用磷酸鹽緩沖液將乳膠稀釋到1％濃度，攪拌下加入一定量的Cl-Cp/Cl-Ab溶液，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴保溫60分鐘，4℃放置4-5小時。15,000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
單元試紙用以下的模式5或模式6組裝，其中的襯墊為涂布粘膠的塑料板或紙板模式5參照圖3，在襯墊上先加上用模式1制備檢測線的層析膜、然后向下依次加上用模式3制備的示蹤粒子結合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊；模式6參照圖4，在襯墊上先加上用模式2制備檢測線的層析膜、然后向下依次加上用模式4制備的示蹤粒子結合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊。
試紙組裝完成后剪切成適當寬度，即為單元試紙條。
參比免疫層析試紙的制作把2-10張單元試紙條并排固定在底卡上，形成參比免疫層析試紙芯，底卡一般為塑料卡，它能使襯墊上的層析膜、示蹤粒子結合物墊、樣品墊和吸水墊緊密結合，并排的單元試紙條的表面用面卡壓緊，面卡一般也為塑料卡，它可保護試紙，使其不受損壞。根據本發明的參比免疫層析試紙適用于非批量、多個樣品測定的特征，選用2-10張單元試紙條為合適。
用以下的模式7或模式8制作檢測鹽酸克羅特倫的參比免疫層析試紙模式7參照圖1，將單元試紙條固定在底卡上，形成參比免疫層析試紙芯，試紙表面用面卡壓緊，面卡上預留加樣孔和觀察窗；加樣孔的位置與單元試紙條的樣品墊對應，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜對應。檢測時從加樣孔加樣，結果從觀察窗讀取。
模式8參照圖2，參比免疫層析試紙分為上、下兩部分，上部為并排的單元試紙條，下部為樣品杯，單元試紙條樣品墊以上的部分固定在底卡上，試紙表面用面卡壓緊，樣品墊伸出底卡和面卡之外，面卡上對應于層析膜的位置預留觀察窗。檢測時在樣品杯中分別裝入Cl標準品和樣本，伸出底卡和面卡的樣本墊同時插入下部的樣品杯中，結果從觀察窗讀取。
本發明的檢測鹽酸克倫特羅參比免疫層析試紙檢測鹽酸克倫特羅的方法如下[1]待檢樣品的處理1)尿樣無需處理取適量尿樣直接進行試驗(尿樣混濁時建議離心或過濾)。
2)低脂肪含量的肝、肉、組織取絞碎的樣品5g，加入5mM Hcl 25ml搖動作用1.5h使其充分勻漿；取6g勻漿(相當于1.0肝)置于離心管中離心，取上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘，加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，4℃下至少放置1.5小時或過夜處理。4000×g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
3)高脂肪肉類組織取絞碎樣品5克加入PH 8.5，50mM Tris緩沖液25ml，振蕩作用0.5小時使其充分勻漿；加入15ml正庚烷，振動5分鐘，4000×g或10-15℃高速離心5分鐘，用滅菌吸管移去上層庚烷液和中層脂肪液；用15ml正庚烷重復提取一次，于水溶性肉勻漿中加入0.5ml HCl，振蕩1小時；取6克肉勻漿(相當于1.0g肉或組織)離心，上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，4℃下至少放置1.5小時或過夜處理。4000×g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
5)飼料樣品處理方法用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。2000rpm離心20分鐘，轉移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾)。用雙蒸水將上清液稀釋10倍(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時樣品總的稀釋倍數為100。取適量的稀釋上清液進行檢測。
加樣在參比免疫層析試紙的結構為模式7的場合，在2-10張單元條試紙條的加樣孔上分別加入Cl標準和樣本，加入Cl標準與加入樣本的單元試紙條數為任意比例；在參比免疫層析試紙的結構為模式8的場合，在2-10個樣品杯中分別加入Cl標準和樣本，加入Cl標準與加入樣本的樣品杯數為任意比例，然后將伸出底卡和面卡外的單元試紙條的樣品墊插入樣品杯內進行測試。
檢測加樣后，按照下述兩種檢測方式，根據檢測線出現時間，或一定時間內檢測線的顏色差異來判斷結果。
①樣本單元試紙條在相同位置出現條帶的時間比某標準單元試紙條出現的時間晚，則樣品內Cl濃度大于某標準濃度。
②在相同時間內，樣本單元試紙條在相同位置出現條帶的顏色比某標準單元試紙條出現的顏色淺，則樣品內Cl濃度大于某標準濃度。
本發明同以往檢測Cl的方法，特別是ELISA相比有如下優點①操作簡便，只需1-2個操作步驟；②檢測速度快，5-15分鐘即可得到結果；③可單份測定也可數份同時測定、室溫保存、保存時間長，并可隨身攜帶。
本發明同以往檢測Cl的方法，特別是免疫層析法相比有如下優點①用標準單元試紙條作參照，不需要額外的質控線抗體(抗示蹤粒子標記物抗體)；②定量的準確性隨著保存時間的增長不會發生變化；③檢測方式靈活，可根據檢測線出現時間或一定時間檢測線的顏色差異來判斷結果；④可加入一個Cl標準，也可同時作幾個Cl標準；⑤可檢測一個樣本，也可同時檢測數個樣本。
本發明可應用于檢測豬尿、人尿、奶制品、糞便、飼料、肉類食品、動物內臟等的Cl濃度。本發明的試紙的使用單位主要為醫院、公檢法部門、運動員興奮劑檢測部門、防疫站等國家監測部門等，個人也可使用。


圖1.是參比免疫層析試紙(模式7)的結構示意圖。
圖中1.底卡；2.面卡；3.參比免疫層析試紙芯；4.加樣孔；5.觀察窗；7.層析膜；10.檢測線；1-1、1-2、1-3、1-4、1-5為單元試紙條。
圖2.是參比免疫層析試紙(模式8)的結構示意圖。
圖中1.底卡；2.面卡；3.參比免疫層析試紙芯；5.觀察窗；6.樣品墊；7.層析膜；10.檢測線；2-1、2-2、2-3、2-4、2-5為單元試紙條；8-1、8-2、8-3、8-4、8-5為樣品杯。
圖3.是參比免疫層析(模式5)試紙芯的結構示意圖。
圖中6.樣品墊；7.層析膜；9.Cl-Ab；10.檢測線；11.示蹤粒子結合物墊；12.Cl-Cp偶聯物；13示蹤粒子標記Cl-Cp偶聯物結合物；15.吸水墊。
圖4.是參比免疫層析(模式6)試紙芯的結構示意圖。
圖中6.樣品墊；7.層析膜；9.Cl-Ab；10.檢測線；11.示蹤粒子結合物墊；12.Cl-Cp偶聯物；14.示蹤粒子標記Cl-Ab結合物；15.吸水墊。
本發明的參比免疫層析試紙利用樣本中的Cl/示蹤粒子標記的Cl共同競爭層析膜上的限量抗體，或樣本中的Cl/層析膜上的Cl共同競爭示蹤粒子標記的限量抗體，根據檢測線出現時間，或一定時間內檢測線的顏色差異來檢測樣品中Cl的原理說明如下
參照圖3，在樣品墊上滴加樣本或Cl標準后，樣本或Cl標準向吸水墊端擴散，使示蹤粒子結合物墊上的示蹤粒子標記Cl-Cp偶聯物結合物進入樣本或Cl標準的液相，并與其一起向吸水墊端擴散，在層析膜上，樣本或Cl標準中的Cl與示蹤粒子結合物中的Cl-Cp競爭，阻止示蹤粒子結合物和Cl-Ab的反應。由于擴散速度較快，反應是動態且不完全的。在參比單元試紙條的樣品墊上加入Cl標準后，標準中的Cl和示蹤粒子合物上的標記Cl比例是一定的，因此，標準品阻止示蹤粒子結合物和Cl-Ab的反應的速率一定，檢測線出現可見顏色所需的時間也就一定。在檢測單元試紙條的樣品墊上同時加入樣本，如果樣本中的Cl濃度大于標準，樣本中Cl阻止示蹤粒子結合物的Cl-Cp和Cl-Ab9反應的速率增大，檢測線上的Cl-Ab富集示蹤粒子結合物至可見顏色所需的時間也增加；或者，在一定的時間內，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的Cl濃度小于標準，檢測線上的Cl-Ab富集示蹤粒子結合物至可見顏色所需的時間減少；或者，在一定的時間內，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據可見顏色出現的先后，或同一時間內出現的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的Cl濃度大于或小于標準。
參照圖4，在樣品墊上滴加樣本或Cl標準，樣本或Cl標準向吸水墊端擴散，使示蹤粒子結合物墊上的示蹤粒子結合物進入樣本或Cl標準的液相，并與其一起向吸水墊端擴散，在層析膜上，樣本或Cl標準中的Cl與檢測線上的Cl-Cp競爭，阻止檢測線上的Cl-Cp和示蹤粒子結合物的反應。由于擴散速度較快，反應是動態且不完全的。在參比單元試紙條的樣品墊上加入Cl標準后，標準中的Cl阻止檢測線中的Cl和示蹤粒子結合物反應的速率是一定的，檢測線出現可見顏色所需的時間也就一定。在檢測單元試紙條的樣品墊上同時加入樣本，如果樣本中的Cl濃度大于標準，樣本中Cl阻止檢測線中的Cl-Cp和示蹤粒子結合物中的Cl-Ab反應的速率增大，檢測線上Cl-Cp富集示蹤粒子結合物至可見顏色所需的時間增加。或者，在一定的時間內，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的Cl濃度小于標準，檢測線上Cl-Cp富集示蹤粒子結合物至可見顏色所需的時間減少。或者，在一定的時間內，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據可見顏色出現的先后，或同一時間內出現的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的Cl濃度大于或小于標準。
具體實施例方式
實施例一膠體硒參比免疫層析試紙檢測尿液的鹽酸克倫特羅濃度1.單元試紙的制作[1]硝酸纖微素層析膜(NC膜)檢測線10的制備將NC膜按25mm寬的尺寸剪裁。鹽酸克倫特羅-載體蛋白(Clenbuterol-carrier protein，Cl-Cp)12的溶液用磷酸鹽緩沖液充分透析后，將濃度調整為1mg/ml，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8mm，檢測線為1條。點樣后的NC膜在室溫下干燥30min，再置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃保溫30min，置室溫干燥處密封儲藏。
膠體硒結合物墊11的制備①膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內加入去離子水550ml和聚丙烯酸10g，通氮室溫攪拌并加入水合肼69.5ml，繼續攪拌20分鐘。將9.63g亞硒酸溶解于280ml水中，室溫攪拌下滴入反應混合液內，得到顆粒直為120nm的紅色硒溶膠。
②膠體硒標記抗鹽酸克倫特羅抗體(clenbuterolantibody，Cl-Ab)9IgG型Cl-Ab用20mmol/LpH7.3磷酸鹽緩沖液配成濃度為4.6mg/ml的溶液，取25μl加入pH7.3的25ml硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1％PEG80001ml，混勻，于4℃下，以5,000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
③將膠體硒標記的Cl-Ab結合物13分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
單元試紙的組裝
在襯墊上先加上有Cl-Cp檢測線的NC膜7、然后向下依次加上膠體硒結合物墊11、樣品墊6、最后在NC膜之上加上吸水墊15。
單元試紙條的剪切單元試紙組裝完成后剪切成4mm的寬度，即為單元試紙條。
2.參比免疫層析試紙制作把10張單元試紙條并排安裝在塑料底卡1上，即成為參比免疫層析試紙芯3，試紙表面用面卡2壓緊，同時使單元試紙條的樣品墊6伸出底卡和面卡之外，面卡上對應單元試紙條層析膜7的部位預留觀察窗5。試紙下部是和上部單元試紙條位置對應的樣品杯8。
3.檢測方法在2個樣品杯中分別加入濃度為0和10ng/ml的Cl標準品，其余8個加入尿液樣本，把上部單元試紙條的樣品墊6平行插入下部的樣品杯中，用以下方式判斷結果。
①反應15min，觀測條帶顏色深淺。標準0ng/ml單元試紙出現紅色條帶，標準10ng/ml單元試紙出現較弱的淺紅色條帶。如果尿樣單元試紙不出現條帶則Cl濃度大于10ng/ml；如果尿樣單元試紙出現淺紅色條帶顏色在0和10ng/ml標準單元試紙之間，則Cl濃度在0和10ng/ml之間；如果尿樣單元試紙條帶顏色和0ng/ml標準單元試紙條帶顏色一致，則結果為陰性。
②反應5min左右，標準0ng/ml單元試紙剛出現較弱紅色條帶，10ng/ml單元試紙不出現條帶，同時觀測尿樣單元試紙，如果出現條帶為陰性，不出現條帶為陽性。
實施例二膠體金參比免疫層析試紙檢測豬肝臟樣品中鹽酸克倫特羅濃度1.單元試紙的制作[1]NC膜檢測線10的制備將NC膜按25mm寬的尺寸剪裁。Cl-Ab9用磷酸鹽緩沖液充分透析后，將濃度調整為0.1mg/ml，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊8mm，檢測線為1條，兩條檢測線之間的距離為6mm。點樣后的NC膜在室溫下干燥30min，再置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃保溫30min，置室溫干燥處密封儲藏。
膠體金結合物墊的制備①膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入2ml1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現橙紅色，膠體金顆粒直徑為35-45nm；②膠體金標記Cl-Cp12Cl-Cp的載體蛋白選用牛血清白蛋白，取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH到6.5，攪拌下加入親和純化的Cl-Cp5ml，再加入聚乙二醇水溶液，使其終濃度為0.05％。將粗制品在12000×g下離45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml并稀釋到OD520為3，4℃保存。
③將膠體金標記的Cl-Cp結合物14分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
單元試紙的組裝在襯墊上先加上有Cl-Ab檢測線的NC膜7、然后向下依次加上膠體金結合物墊11、樣品墊6、最后在NC膜之上加上吸水墊15。
單元試紙條的剪切單元試紙組裝完成后剪切成4mm的寬度，即為單元試紙條。
2.參比免疫層析試紙制作把3張單元試紙條并排安裝在塑料底卡1上，即成為參比免疫層析試紙芯3，試紙表面用面卡2壓緊，面卡在對應單元試紙的樣品墊6和層析膜7的部位分別預留加樣孔4和觀察窗5。
3.檢測方法豬肝臟樣本按本說明書所述方法處理，得到的上清液作為檢測樣，檢測時在加樣孔4中分別加入0ng/ml、5ng/mlCl標準品和檢測樣，結果從觀察窗讀取，用以下方式判斷結果。
①反應15min，觀測條帶顏色的深淺。此時0ng/ml、5ng/ml Cl標準單元試紙均出現條帶，如檢測單元試紙不出現條帶，或條帶顏色比5ng/ml Cl標準單元試紙的淺，則檢測樣的Cl＞5ng/ml；如檢測單元試紙出現的條帶顏色比5ng/ml Cl標準單元試紙的深，但比0ng/ml的淺，則檢測樣的Cl在0ng/ml和5ng/ml之間。
②反應5-10min，觀測條帶出現先后。0ng/ml、5ng/ml標準單元試紙出現檢測線時未見檢測單元條帶，則檢測樣的Cl＞5ng/ml；0ng/ml標準單元出現檢測線時未見5ng/ml標準單元和檢測單元出現條帶，則檢測樣的Cl在0ng/ml和5ng/ml之間。
實施例三膠體金參比免疫層析試紙檢測豬肉樣本中鹽酸克倫特羅濃度除檢測線為Cl-Cp，檢測線為2條以外，1.單元試紙的制作、2.參比免疫層析試紙制作同實施例二。
3.檢測方法豬肉樣本按本說明書所述方法處理，得到的上清液作為檢測樣，檢測時在加樣孔4中分別加入0ng/ml、1ng/mlCl標準品和檢測樣，結果從觀察窗讀取，用以下方式判斷結果。
①反應15min，觀測條帶顏色的深淺。此時0ng/ml、1ng/ml Cl標準單元試紙均出現條帶，如檢測單元試紙不出現條帶，或條帶顏色比1ng/ml Cl標準單元試紙的淺，則檢測樣的Cl＞1ng/ml；如檢測單元試紙出現的條帶顏色比1ng/ml Cl標準單元試紙的深，但比0ng/ml的淺，則檢測樣的Cl在0ng/ml和1ng/ml之間；檢測單元試紙出現的條帶顏色與0ng/ml標準單元試紙的顏色無明顯差異，則檢測樣的Cl為陰性。
②反應5-10min，標準單元試紙和檢測單元試紙出現的檢測線為以下情況時，檢測樣的Cl＞1ng/ml0ng/ml標準單元出現第一條線，1ng/m標準單元和檢測單元未出現條帶；0ng/ml標準單元出現第一、第二條線，1ng/ml標準單元出現第一條線，檢測單元未出現條帶；0ng/ml標準單元、1ng/ml標準單元均出現第一、第二條線，檢測單元出現第一條線。標準單元試紙和檢測單元試紙出現的檢測線為以下情況時，檢測樣的Cl在0ng/ml和1ng/ml之間0ng/ml標準單元、及檢測單元均出現第一條線，但1ng/ml標準單元未出現條帶；0ng/ml標準單元出現第一、第二條線，檢測單元出現第一條線但1ng/ml標準單元未出現條帶；0ng/ml標準單元檢測單元均出現第一、第二條線，1ng/ml標準單元均出現第一條線。
檢測單元試紙出現的條帶數和顏色與0ng/ml標準單元試紙的顏色無明顯差異，則檢測樣的Cl為陰性。
實施例四乳膠參比免疫層析試紙檢測飼料樣本中鹽酸克倫特羅濃度1.單元試紙的制作[1]NC膜7上檢測線10的制備將NC膜按25mm寬的尺寸剪裁。Cl-Ab9用磷酸鹽緩沖液充分透析后，將濃度調整為0.05mg/ml，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊6mm，檢測線為4條，兩條檢測線之間的距離為2.5mm。點樣后的NC膜在室溫下干燥30min，再置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃保溫30min，置室溫干燥處密封儲藏。
乳膠結合物墊的制備①乳膠標記Cl-Cp彩色乳膠顆粒購自BangsLaboratories公司，Cl-Cp的載體蛋白選用牛血清白蛋白。取100ml用磷酸鹽緩沖液稀釋到濃度為1％的乳膠，攪拌下加入500μg的Cl-Cp溶液，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴保溫60分鐘，4℃放置4-5小時。15,000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
②將乳膠標記的Cl-Cp結合物14分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
單元試紙的組裝在襯墊上先加上有Cl-Ab檢測線10的層析膜7、然后向下依次加上膠體金結合物墊11、樣品墊6、最后在層析膜之上加上吸水墊15。
單元試紙條的剪切單元試紙組裝完成后剪切成4mm的寬度，即為單元試紙條。
2.參比免疫層析試紙制作把4張單元試紙條并排安裝在塑料底卡1上，即成為參比免疫層析試紙芯3，試紙表面用面卡2壓緊，面卡在對應單元試紙的樣品墊6和層析膜7的部位分別預留加樣孔4和觀察窗5。
3.檢測流程。
飼料樣本處理按本說明書所述方法處理，所得的上清液作為檢測樣。
檢測時在加樣孔4中分別加入0ng/mlCl標準品和檢樣，結果從觀察窗讀取，用以下方式判斷結果。
①反應15min，觀測條帶顏色深淺。強陽性(＞10ng/ml)標準單元試紙出現條帶，檢測單元試紙不出現條帶。陽性(＞5ng/ml)標準單元試紙和檢測單元試紙均出現第一條檢測線，標準單元試紙出現第二條檢測線而檢測單元試紙不出現。弱陽性(＞1ng/ml)標準單元試紙和檢測單元試紙均出現第一、第二條檢測線，標準單元試紙出現第三條檢測線而檢測單元試紙不出現。弱陽性(＞0.5ng/ml)標準單元試紙和檢測單元試紙均出現第一、第二、第三條檢測線，標準單元試紙出現第四條檢測線而檢測單元試紙不出現。陰性(0ng/ml)標準單元試紙和檢測單元試紙出現2條檢測線顏色無明顯差異。
②反應5-10min，觀測條帶出現先后。陽性(＞5ng/ml)標準單元出現第一條檢測線時未見檢測單元條帶；陽性(＞2ng/ml)標準單元出現第二條檢測線時未見檢測單元第二條帶。弱陽性(＞1ng/ml)標準單元出現第三條檢測線時未見檢測單元第三條帶。弱陽性(＞0.5ng/ml)標準單元出現第四條檢測線時未見檢測單元第四條帶。陰性(0ng/ml)標準單元和檢測單元條帶出現無差異。
本發明方法用于生物樣品中鹽酸克倫特羅的定量檢測。
權利要求
1.檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙，其特征在于它包括以下二種形式A.試紙由底卡(1)、面卡(2)和參比免疫層析試紙芯(3)組成，其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙芯(3)固定在底卡和面卡之間，面卡上預留加樣孔(4)和觀察窗(5)，加樣孔的位置與單元試紙條的樣品墊(6)對應，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜(7)對應；B.試紙由底卡(1)、面卡(2)、參比免疫層析試紙芯(3)和樣品杯(8)組成，其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙(3)固定 在底卡和面卡之間，單元試紙條的樣品墊(6)伸出底卡和面卡之外，面卡上預留觀察窗(5)，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜(7)對應，樣品杯位于參比免疫層析試紙之下，每個樣品杯的位置與每條單元試紙條對應；單元試紙條的層析膜(7)上有1-4條用鹽酸克倫特羅抗體(9)線狀點樣的檢測線(10)，示蹤粒子結合墊(11)上有示蹤粒子標記鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物(12)的結合物(13)；或者，單元試紙條的層析膜上有1-4條鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物(12)線狀點樣的檢測線(10)，示蹤粒子結合墊(11)上有示蹤粒子標記鹽酸克倫特羅抗體(9)的結合物(14)。
2.根據權利要求1所述的檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙，其特征在于單元試紙條上的鹽酸克倫特羅抗體線狀點樣的檢測線，或鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物線狀點樣的檢測線為1-2條。
3.一種用檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙檢測鹽酸克倫特羅的方法，其特征在于它包括按以下順序進行的步驟[1]樣品處理；[2]在形式A的參比免疫層析試紙的加樣孔(4)上分別加入Cl標準和樣本，加入Cl標準與加入樣本的單元試紙條數為任意比例；或者，將形式B的參比免疫層析試紙的單元試紙條的樣品墊(6)插入對應的樣品杯(8)中，加入Cl標準與加入樣本的樣品杯數為任意比例；[3]用以下兩種方法中的任何一種檢測樣本中鹽酸克倫特羅的濃度①比較在相同的位置，樣本單元試紙條與標準單元試紙條出現條帶 的時間，樣本單元試紙條在相同位置出現條帶的時間比某標準單元試紙條出現的時間晚，則樣品內Cl濃度大于某標準濃度；②在相同時間內，比較樣本單元試紙條和單元試紙條出現的條帶顏色，在相同時間內，樣本單元試紙條在相同位置出現條帶的顏色比某標準單元試紙條出現的顏色淺，則樣本內Cl濃度大于某標準濃度。
4.根據權利要求3所述的方法，其中鹽酸克倫特羅的檢測下限為1ng/ml。
全文摘要
本發明涉及檢測鹽酸克倫特羅(clenbuterol，Cl)的參比免疫層析試紙及其檢測方法。該試紙包括兩種形式A.試紙由底卡、面卡和參比免疫層析試紙組成，面卡上預留加樣孔和觀察窗；B.試紙由底卡、面卡、參比免疫層析試紙和樣品杯組成，面卡上預留觀察窗。單元試紙條的層析膜上有1－4條鹽酸克倫特羅抗體或鹽酸克倫特羅載體蛋白偶聯物線狀點樣的檢測線；示蹤粒子結合墊上有示蹤粒子標記鹽酸克倫特羅－載體蛋白偶聯物的結合物或示蹤粒子標記鹽酸克倫特羅抗體的結合物。本發明的試紙結構簡單、使用方便、保存時間長，檢測步驟少、快速、準確，適合于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象樣品的Cl進行非批量、多個樣品的現場快速篩查和監控。
文檔編號G01N33/543GK1484031SQ0315334
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月11日 優先權日2003年8月11日
發明者陳高明, 李林 申請人:江西中德生物工程有限公司