專利名稱：用于恙蟲病診斷的重組抗原及其快速診斷的試紙的制作方法
技術領域：
本發明涉及疾病診斷的抗原，具體說是一種用于恙蟲病診斷的重組抗原及其快速診斷的試紙。
恙蟲病的臨床癥狀中，蟲咬潰瘍是其特異性的體征，但由于蟲咬潰瘍大都部位隱蔽，數量少，對其檢出率的報道各地差異較大，因此必須輔以實驗室檢查以便及時確診。恙蟲病東方體是嚴格的專性細胞內寄生的微生物，繁殖慢，純化繁瑣，因而難以獲得大量純化的恙蟲病東方體抗原，限制了檢驗方法的發展。傳統的診斷方法，如外斐氏試驗(Weil-Felix test)、免疫過氧化物酶試驗(IIP)、間接免疫熒光抗體檢測(IFAT)等，均以血清學反應為基礎，但因各自的局限性而限制了它們的使用。外斐氏試驗雖然操作簡單，但對恙蟲病診斷缺乏敏感性和特異性；IFAT具有很好的敏感性和特異性，但需要熒光顯微鏡和訓練有素的專業人員，難以在農村、基層醫院及現場使用；IIP雖然以普通光學顯微鏡代替了熒光顯微鏡或甚至不需要顯微鏡，但仍然需要培養和純化恙蟲病東方體，需要昂貴的組織培養設備。因此，急需建立一種簡便、快速并能克服上述局限的血清學診斷方法，以滿足恙蟲病東方體臨床檢測的需要。
恙蟲病東方體56kD抗原(Scrub typhus antigen，Sta56)作為恙蟲病東方體表面含量最豐富的外膜蛋白，可占菌體總蛋白的10～15％；免疫原性強，最常被宿主免疫系統所識別；Sta56可與株特異性單抗和群特異性單抗反應，表明Sta56存在株特異性表位和群特異性表位，因而Sta56是恙蟲病診斷抗原的主要候選者之一。
膠體金是一種處于半還原狀態的懸浮顆粒，能迅速吸附蛋白質等大分子而不影響其活性，膠體金具有易分辨的紅至紫紅色，在與大分子結合后，易于用肉眼識別，不需二級放大即可直接觀察結果，膠體金診斷產品因而可直接進入沒有復雜檢測設備的診所甚至家庭里。近年來，以早孕檢測試紙為代表的膠體金免疫診斷試劑已進入千家萬戶，給人們的生活帶來很大的方便。
從包括中國專利等有關資料檢索表明，目前尚未有利用基因工程方法獲得的重組抗原用于恙蟲病的診斷及恙蟲病快速診斷試紙的相關報道。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是一.本發明涉及的溶液配方為(1)重組抗原溶解液SDS 0.1％甘氨酸 250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)膠體金溶液3～5/萬的四氯金酸，加1～2％檸檬酸三鈉制備成膠體金顆粒；(3)二抗抗人IgG、抗人IgM多抗，購自Sigma公司；(4)包被緩沖液1～3％蔗糖in PBS；(5)基礎緩沖液購自廈門波生生物技術有限公司；(6)反應緩沖液0.01～0.05％NaN3in PBS；(7)PBS在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，用鹽酸調節溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。
二.本發明重組抗原的工藝流程(1)從恙蟲病東方體Karp株基因組中擴增出sta56基因的ORF或其中的大片段，用TA克隆技術將此大片段克隆；(2)以該重組質粒為模板，擴增出截短的sta56片段，定向插入pET30a載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達；Western blot證實該重組蛋白能被恙蟲病患者陽性血清所識別；(3)采用電洗脫方法純化重組蛋白對大量誘導時收集的菌體進行超聲粉碎后，將超聲上清進行制備電泳，確定目標條帶在凝膠中的位置，切下含目標蛋白的凝膠膠置于透析袋中進行電洗脫；純化樣品進行SDS-PAGE，確定純度并進行蛋白定量。
三.本發明的試紙制作工藝(1)以膠體金標記重組抗原和鼠IgG；(2)兩種金標抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機凍干；(3)羊抗人μ鏈1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG 1.0～5.0mg/ml與羊抗鼠IgG單抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干；(4)將吸水紙、NC膜和吸附了金標抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM、IgG和總Ig試紙條。
用本發明制作的重組抗原及利用重組抗原制作成的試紙條就可以用于恙蟲病的臨床診斷了。
本發明的有益效果是本發明利用基因工程技術，克隆恙蟲病東方體的免疫優勢抗原的結構基因，并在大腸桿菌內表達，以方便地獲得大量廉價的重組抗原，純化后即可用于免疫學診斷。由此方法得到的重組抗原及快速診斷試紙克服了現有恙蟲病診斷方法的局限性，可以快速、簡便地診斷恙蟲病，無需特殊儀器，無需訓練有素的專業人員，可以滿足基層醫院、農村衛生院等臨床檢測的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者。同時本發明診斷精確度高，從而使患者能夠得到及時的治療，達到了防治的目的。
實施例2快速診斷試紙的制作(1)取3/萬四氯金酸1000ml，加熱至沸騰，加入1％檸檬酸三鈉溶液25ml，繼續煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由有藍經紫變紅后，自然冷卻后備用；(2)取膠體金溶液1ml，加入0.2M K2CO310μl、50μg純化抗原，攪勻后靜置1h；(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％ PEG 20,000 15μl，8,000r/min，離心8min，棄上清；(4)沉淀加入1ml基礎緩沖液懸浮，即為金標抗原溶液；(5)同法標記鼠IgG；(6)兩種金標抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機凍干；(7)羊抗鼠IgG單抗3.0mg/ml、羊抗人IgG 3.0mg/ml、羊抗人μ鏈1.0mg/ml分別在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；或羊抗鼠IgG單抗3.0mg/ml、重組抗原溶液2mg/ml在NC膜的上、下三分之一處包被NC膜，自然晾干；(8)在約10cm寬的底板上，將吸水紙、NC膜、吸附了金標抗原的玻璃纖維和未吸附抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM與IgG和檢測總Ig的試紙條。
評價在試紙條的玻璃纖維上加3μl(檢測IgM和IgG)或5μl待檢血清(檢測總Ig)，再滴加1～2滴反應液。觀察金標抗原釋放后NC膜上檢測線和對照線的反應情況，檢測線和對照線同時出現紅色條帶判為陽性，僅對照線出現紅色條帶判為陰性，對照線未出現條帶為無效試驗。金標免疫層析法檢測IgM、IgG、總Ig的敏感性分別為92.3％，90.9％和98.6％；特異性分別為94.7％，94.7％和93.3％。
權利要求
1.一種用于恙蟲病診斷的重組抗原及其快速診斷試紙的溶液制備，其特征是溶液配方為(1)重組抗原溶解液 SDS 0.1％甘氨酸250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)膠體金溶液2～5/萬的四氯金酸，加1～2％檸檬酸三鈉還原成中等大小的膠體金顆粒；(3)二抗抗人IgG、抗人IgM多抗，購自Sigma公司；(4)包被緩沖液1～3％蔗糖in PBS；(5)基礎緩沖液購自廈門波生生物技術有限公司；(6)反應緩沖液0.01～0.05％NaN3in PBS；(7)PBS在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用鹽酸調節溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。
2.一種用于恙蟲病診斷的重組抗原的制備工藝流程，其特征是重組抗原的工藝流程為(1)從恙蟲病東方體Karp株基因組中擴增出sta56基因的ORF或其中的大片段，用TA克隆技術將此大片段克隆；(2)以該重組質粒為模板，擴增出截短的sta56片段，定向插入pET30a載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達；Western blot證實該重組蛋白能被恙蟲病患者陽性血清所識別；(3)采用電洗脫方法純化重組蛋白對大量誘導時收集的菌體進行超聲粉碎后，將超聲上清進行制備電泳，確定目標條帶在凝膠中的位置，切下含目標蛋白的凝膠膠置于透析袋中進行電洗脫；純化樣品進行SDS-PAGE，確定純度并進行蛋白定量。
3.一種用于恙蟲病診斷的重組抗原的快速診斷試紙，其特征是試紙制作工藝為(1)以膠體金標記重組抗原和鼠IgG；(2)兩種金標抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機凍干；(3)羊抗人μ鏈1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG 1.0～5.0mg/ml與羊抗鼠IgG單抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干；(4)將吸水紙、NC膜、吸附和未吸附金標抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM、IgG和總Ig試紙條。
全文摘要
本發明公開了一種用于恙蟲病診斷的重組抗原及其快速診斷的試紙。恙蟲病，又稱叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病東方體引起的以發熱、皮疹、蟲咬潰瘍(焦痂)和淺表淋巴結腫大為主要特征的發熱性疾病，嚴重者出現肝脾腫大、腹水，救治不及時可導致死亡。本發明利用基因工程技術，克隆恙蟲病東方體的免疫優勢抗原的結構基因，并在大腸桿菌內表達，以方便地獲得大量廉價的重組抗原，純化后即可用于免疫學診斷。由此方法得到的重組抗原及快速診斷試紙克服了現有恙蟲病診斷方法的局限性，可以快速、簡便地診斷恙蟲病，無需特殊儀器，無需訓練有素的專業人員，可以滿足基層醫院、農村衛生院等臨床檢測的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者。
文檔編號G01N33/558GK1479099SQ0314731
公開日2004年3月3日 申請日期2003年7月5日 優先權日2003年7月5日
發明者嚴延生, 鄧艷琴 申請人:福建省衛生防疫站