尿中性肽鏈內切酶的免疫檢測方法

專利名稱：尿中性肽鏈內切酶的免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及尿中性肽鏈內切酶(NEP)的一種檢測方法，特別涉及一種NEP的定量檢測免疫方法。
背景技術：
中性肽鏈內切酶(neutral endopeptidase，NEP，國際酶學編號為EC3.4.24.11)是哺乳動物細胞表面的一種含鋅金屬肽酶。它是NEP酶家族中的一員，屬II型完整膜蛋白，在調節肽類代謝中起重要作用。此酶首先由Kerr和Kenny于1974年從兔腎小管的刷狀緣發現并提純出來。NEP在腎臟和肺組織中含量最豐富，所有的三型NEP的mRNA(I型，IIa型，IIb型)在近端腎小管均有表達，其中IIb型表達最高。這種肽鏈內切酶大量地位于近端小管上皮刷狀緣膜上，在生理狀態下只以頂膜片斷形式少量地排入尿液，處理出現在小管液中的濾過出來的肽類。正如其他近端小管上皮細胞膜表面的蛋白質如丙氨酸氨基肽酶(AAP)、γ-谷氨轉肽酶(γ-GT)一樣，NEP在腎小管細胞受損時才大量地釋放入尿液。
學者分別從幾組腎臟病患者尿中檢測了NEP的活性，發現在急性腎小管中毒性腎病患者(腎毒性藥物所致)中此酶活性最高(尿中NEP的活性達到正常上限的6.5倍)，并且在服用腎毒性藥物后第二天即開始升高。急性腎小管功能不全(非腎毒性藥物引起)患者尿中NEP活性增加到正常上限的2.5倍，而腎小球疾病及糖尿病患者尿中NEP的活性在正常范圍內。本發明人同時研究了急性腎小管功能不全患者尿中的α1-MG的活性，發現尿中NEP的活性已降至正常后，α1-MG的活性仍在增加。
Nortier J等學者檢測了接受腎移植患者尿中的NEP量，發現在移植后第1、2天，尿NEP顯著增加，并在移植后3～5天內恢復正常。移植早期尿中NEP釋放明顯增加，可能與缺血及免疫抑制藥對近端小管上皮的損傷有關。
J.F.Blaikley分別于術前1天、術后3小時、術后第1、4天檢測行心臟搭橋術的患者的尿NEP，發現與對照相比，手術組術后尿NEP明顯增高，且NEP增高最嚴重的病人多數術后進入急性腎功能衰竭并需要血透。因為在術后發生急性腎衰是患者死亡的主要原因，因此他們主張檢測尿NEP，以便早期發現有發展為急性腎衰危險的患者，并及時予以治療。
近來對中草藥引起的腎病研究頗多，因其中引起腎損害的成分主要為馬兜鈴酸，國內稱為馬兜鈴酸腎病。馬兜鈴酸引起的腎損害以慢性腎小管間質性損害最多，也可表現為急性腎小管壞死。主要病理改變是腎小管嚴重受損，腎小管數減少，腎間質纖維化、萎縮，以外皮質層受累最重。JOELLE L.等人分別測定中草藥腎病(CHN)患者、使用中草藥但尚未出現腎功能受累者、腎小球疾病患者及健康對照者尿微量蛋白(包括CC16、β2-MG、α1-MG)及尿β-D-N-乙酰葡萄胺酶(NAG)和尿NEP的量，同時進行腎臟病理活檢，并對這些病人進行了6月～2年的隨訪。結果發現在中草藥腎病患者腎功能中、重度受累時，尿中NEP濃度明顯下降，且其濃度水平與尿中微量蛋白呈負相關與內生肌酐清除率呈正相關，而在腎小球疾病患者中未發現尿NEP與內生肌酐清除率有相關性，且尿NEP下降的程度與腎活檢中近端小管損傷的程度相一致。他們認為，尿NEP的量實際反映了在近端小管殘留的未受損的刷狀緣的比例。
鎘、鉛等重金屬可以引起的腎損害，早期主要累及近端小管。有學者檢測了52名接觸鎘的工人及54名非職業性接觸鎘的工人尿液中的NEP、NAG及NAG-β的量和某些尿微量蛋白的含量[白蛋白、β2-MG、尿視黃醇結合蛋白(RBP)、CC16]。結果發現對鎘只有低劑量接觸時，NEP即開始升高(此時其它近端小管標志物尚未升高)。提示了NEP可以顯示近端小管功能的早期損害。
Huang H.等學者分別檢測了單側腎結石不伴腎積水，輸尿管結石伴同側腎積水及對照組中尿NEP、NAG、β-GAL(β-半乳糖酶)的值和血粘附分子值。結果發現，有輸尿管結石伴腎積水患者組中尿NEP明顯降低，而NAG、β-GAL與對照組相比均增高。尿NEP的低水平提示了尿路梗阻、腎積水引起腎小管功能受損，近曲小管萎縮，殘存的小管數減少。
在缺血、中毒等引起急性腎小管損傷時，近端小管刷狀緣大量脫落，NEP隨脫落的刷狀緣排入尿中，尿中NEP明顯增加。此時部分腎小管重吸收功能下降，而部分腎小管重吸收功能卻代償性增加，因此，反映近端腎小管重吸收功能的尿微量蛋白尚無明顯變化；進入慢性損害期的腎小管，已不能再提供NEP釋放入尿液中，其尿中的NEP降低。同時其腎小管損傷的程度越重，腎小管的重吸收功能就越差，因而，尿內排出的微量蛋白就越多，尿NEP與尿微量蛋白之間出現程度不等的負相關。比較急性腎小管損傷組和慢性腎小管損傷組可以發現，在腎小管損傷的急性期，某些尿中微量蛋白尚無明顯增高或僅有輕度增高，尿NEP已有明顯增高，而隨疾病進展，在腎小管損傷的慢性期，尿NEP已下降后，尿α1-MG及RBP的量仍在增加。因此，若尿中NEP的量增加，而尿α1-MG及RBP等尿微量蛋白的量并無明顯增加，常提示腎小管早期急性損害并伴有腎小管重吸收功能代償性增加。而尿NEP降低，尿α1-MG及RBP等微量蛋白增高，可提示腎小管的慢性病變，此時尿NEP因為腎小管上皮細胞的萎縮，腎小管數及表面刷狀緣的減少而排出減少，并且由于腎小管重吸收功能逐漸降低，尿中的微量蛋白逐漸增高。
綜上所述，在急性腎小管損傷中，尿NEP明顯增高，此時尿微量蛋白尚未明顯增加，因此檢測尿NEP可以幫助我們更加早期地發現腎小管的急性損傷；在慢性腎小管損傷組中尿NEP降低，并與尿微量蛋白的增高呈負相關；而腎小球疾病尚未引起腎小管明顯損害時，尿NEP與正常相比無變化。正是由于尿NEP在不同病程中出現雙向的變化，當結合其他尿微量蛋白檢測時，它可以幫助我們判斷腎小管損傷處于急性期還是慢性期，從而有助于對治療方案的選擇和對預后進行估計。
但目前國內對尿NEP的研究尚屬空白，而國外只有少數幾個實驗室在進行研究，他們采用熒光法檢測(Joelle L，Nortier，Monique M，et al.Proximal tubular injury in Chinese herbs nephropathyMonitoring by neutral endopeptidase enzymuria.Kidney International，1997，51288-293.)，用丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-氨甲基香豆素(succinyl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-AMC)作底物，NEP能夠在succinyl-alanyl-alanyl-和-phenylalanyl-AMC之間將此底物水解，接著用氨基肽酶M進一步孵育，釋出游離的氨甲基香豆素(AMC)，這一物質含有熒光基團，在λex＝367nm，λem＝440nm時，可以選擇性的測定游離的AMC。并且同時做對照管，反應前加入NEP的特異性抑制劑抑制酶活性。得到的結果減去有抑制劑存在的相應對照組的數據，以避免非特異性底物水解造成的誤差。用純化的人腎NEP建立起來的標準曲線，可使游離的氨甲基香豆素的熒光度轉化為酶的量。但因該法需特殊的熒光發光檢測儀，該儀器約10萬美元，價格昂貴，反應步驟較為復雜，目前僅用于實驗研究中，不能在臨床應用中大范圍推廣。

發明內容
本發明的目的是解決上述問題，提供一種可在臨床推廣應用的尿中性肽鏈內切酶(NEP)的免疫檢測方法。
本發明的目的通過下述技術方案來實現一種尿中性肽鏈內切酶(NEP)的免疫檢測方法，其特征在于該方法采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)技術。
該方法可用于尿NEP的定量測定。
上述尿NEP的濃度測定范圍為20-200μg/L。
上述ELISA方法包括下列步驟1)用5-15μg/ml動物抗人尿NEP抗體包被酶標反應板，每孔50-200μl，置1-40℃12小時；2)棄去孔中液體，洗滌甩干；3)1-40℃封閉酶標反應板1-24小時；4)棄去孔中液體，洗滌甩干；5)加入適當稀釋的標準品、尿樣、緩沖液(陰性對照)，每份均加復孔，每孔50-200μl，1-40℃孵育10分鐘-24小時；6)棄去孔中液體，洗滌甩干；7)加入2-10μg/ml動物抗人尿NEP的單克隆抗體，每孔50-200μl，1-40℃孵育1-24小時；8)棄去孔中液體，洗滌甩干；9)加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗步驟7中的動物免疫球蛋白的抗體，每孔50-200μl，1-40℃孵育1-24小時；10)洗滌甩干；11)顯色后，終止反應；12)酶標儀在λ＝450nm處讀取各孔吸光度OD值；
13)根據標準系列濃度的吸光度值，在半對數坐標上得到標準曲線；14)根據標準曲線求得的回歸方程，將相應的吸光度值計算得到尿NEP的濃度。
其中，上述步驟1和7中所述的動物抗人尿NEP抗體為兔抗人或鼠抗人尿NEP抗體。
上述步驟9中所述的HRP標記的抗步驟7中的動物免疫球蛋白的抗體為1∶1000的HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠免疫球蛋白的抗體。
上述步驟11中的顯色條件為加入現配的底物液，每孔50-200μl，1-40℃避光環境下。
本發明的積極進步效果為ELISA法為常用的免疫檢測方法(沈霞主編.人民軍醫出版社2002年北京.臨床免疫學與免疫學檢驗新技術.沈霞第二章酶免疫測定技術.P12-20.)，但本發明采用了三明治ELISA法來檢測尿NEP，這在國內外文獻中尚未見報道；同時進行的方法學評價顯示這種方法有較好的靈敏度，準確度和重復性，檢測的線性范圍能夠涵蓋臨床檢測標本；且本法操作簡便，方法無創，所需儀器價格低廉，一般醫學實驗室均可購置。
由于其實驗操作步驟簡單，易于推廣，成本較低；且實驗結果準確可靠，對臨床診治有較大幫助，因此有廣闊的臨床應用前景。


圖1為本發明方法所測的NEP標準曲線。
具體實施例方式
本研究通過對抗體體系的選擇、抗體工作濃度的選擇、最佳標準品/抗體作用時間的選擇等大量實驗，總結出尿NEP定量檢測的ELISA方法。下舉的幾個較佳實施例，僅為更好的說明本發明方法，而并不受其限制。
材料1.Elx800型酶標儀(購自美國Bio-Tec公司)；
2.96孔酶標板(購自美國Labsystem公司)；3.人NEP標準品(比利時laboratoire Pluridisciplinaire de RechercheExperimentale Biomedicale實驗室獲得)；4.兔抗人NEP多克隆抗體(購自上海基因公司)；5.小鼠抗人NEP單克隆抗體(購自上海基因公司)；6.辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠、羊抗兔免疫球蛋白抗體(上海第二醫科大學醫學檢驗重點實驗室獲得)；7.包被稀釋液pH9.6，0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；8.封閉液含0.5％BSA的PB緩沖液；9.洗滌液0.1％Tween-20；10.NEP和抗體稀釋液pH7.4的PBS；11.底物液TMB(購自Sigma公司)；12.終止液2mol/L的H2SO4。
實施例1步驟1.用10μg/ml兔抗人NEP的多克隆抗體包被酶標反應板，每孔100μl，置4℃，12小時；步驟2.棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次3分鐘，甩干；步驟3.用封閉液封閉酶標反應板，每孔200μl，置4℃，18小時；步驟4.同步驟2；步驟5.加入適當稀釋的標準品、尿樣、緩沖液(陰性對照)，每孔100μl，每份標準品、樣品、對照均加復孔，37℃孵育1小時；步驟6.同步驟2；步驟7.加入6μg/ml小鼠抗人NEP的單克隆抗體，每孔100μl，37℃孵育1小時；步驟8.同步驟2；
步驟9.加入1∶1000HRP標記的羊抗小鼠免疫球蛋白抗體，每孔100μl，37℃孵育1小時；步驟10.洗滌液洗板4次，每次3分鐘甩干；步驟11.加入現配的底物液，每孔100μl，37℃避光環境下顯色，15分鐘后，每孔加終止液50μl終止反應；步驟12.酶標儀在λ＝450nm處讀取各孔吸光度(OD)值；步驟13.根據標準系列濃度的吸光度值，在半對數坐標上得到標準曲線；步驟14.根據標準曲線求得的回歸方程，將相應的吸光度值計算得到NEP的濃度。
實施例2步驟1.用15μg/ml鼠抗人NEP的多克隆抗體包被酶標反應板，每孔50μl，置40℃，1小時；步驟2.棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次3分鐘，甩干；步驟3.用封閉液封閉酶標反應板，每孔100μl，置1℃，24小時；步驟4.同步驟2；步驟5.加入適當稀釋的標準品、尿樣、緩沖液(陰性對照)，每孔50μl，每份標準品、樣品、對照均加復孔，40℃孵育10分鐘；步驟6.同步驟2；步驟7.加入2μg/ml兔抗人NEP的單克隆抗體，每孔50μl，1℃孵育24小時；步驟8.同步驟2；步驟9.加入1∶1000HRP標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，每孔50μl，40℃孵育4小時；步驟10.洗滌液洗板4次，每次3分鐘甩干；步驟11.加入現配的底物液，每孔200μl，1℃避光環境下顯色，30分鐘后，每孔加終止液200μl終止反應；
步驟12.酶標儀在λ＝450nm處讀取各孔吸光度(OD)值；步驟13.根據標準系列濃度的吸光度值，在半對數坐標上得到標準曲線；步驟14.根據標準曲線求得的回歸方程，將相應的吸光度值計算得到NEP的濃度。
實施例3步驟1.用5μg/ml兔抗人NEP的多克隆抗體包被酶標反應板，每孔200μl，置1℃，24小時；步驟2.棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次3分鐘，甩干；步驟3.用封閉液封閉酶標反應板，每孔50μl，置40℃，1小時；步驟4.同步驟2；步驟5.加入適當稀釋的標準品、尿樣、緩沖液(陰性對照)，每孔200μl，每份標準品、樣品、對照均加復孔，1℃孵育24小時；步驟6.同步驟2；步驟7.加入10μg/ml小鼠抗人NEP的單克隆抗體，每孔200μl，40℃孵育3小時；步驟8.同步驟2；步驟9.加入1∶1000HRP標記的羊抗小鼠免疫球蛋白抗體，每孔200μl，1℃孵育24小時；步驟10.洗滌液洗板4次，每次3分鐘甩干；步驟11.加入現配的底物液，每孔50μl，40℃避光環境下顯色，5分鐘后，每孔加終止液10μl終止反應；步驟12.酶標儀在λ＝450nm處讀取各孔吸光度(OD)值；步驟13.根據標準系列濃度的吸光度值，在半對數坐標上得到標準曲線；步驟14.根據標準曲線求得的回歸方程，將相應的吸光度值計算得到NEP的濃度。
統計學方法用SAS6.12及EXCEL軟件進行相關回歸分析和描述性統計。
結果(一)線性范圍將人腎組織提取的NEP純品用PBS緩沖液稀釋成濃度為400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L，空白孔加PBS緩沖液，以濃度的對數對相應的吸光度值作圖，當NEP濃度在20～200μg/L時，對上述數據進行相關回歸分析，發現其濃度的對數與吸光度間有良好的線性關系(Y＝A*LgX+B)，如圖1示。
在不同時間，取線性范圍內，對標準曲線的重復性進行檢測。
取不同時間點線性范圍內的標準曲線，各標準濃度的CV為2.063～4.170％，平均2.987％。
所有標準曲線r＞0.99(p＜0.001)，重復性良好。
(二)準確度檢測回收實驗用來檢測實驗的準確度，即測定值與真值的接近程度，常用回收率表示。向五份尿樣中加入不同濃度的NEP，計算其各自回收率。回收率93.6～107.3％，平均101.7％，有良好準確度。
(三)精確度檢測取兩份濃度不同的尿標本于同一批內各測10次，計算批內變異系數(CV)；在10個不同檢測日分別對兩份尿標本測定10次，計算批間CV。
批內變異系數(CV)4.152～5.469％，平均4.811％，批間變異系數(CV)6.241～6.395％，平均6.318％，有良好精確度。
(四)檢測限值檢測限值即為某一實驗的最低檢測值，以空白吸光度的均值X+2S所對應的濃度值作為檢測限值，經計算得出檢測限值為3.20μg/L。
應用實施例一、材料和方法一)受試對象1、分組情況病人組共分為五組，包括急性腎小管損傷組、慢性腎小管損傷組、馬兜鈴酸腎病組、單純腎小球疾病組、腎小球疾病所致的CRF組(具體分組情況見表16)。所有病例均系2002年1月至2002年10月間在上海第二醫科大學附屬瑞金醫院住院患者。均為病理診斷或臨床診斷確診者。臨床診斷依據通過病史、體檢、實驗室檢查(除其他常規化驗外，同時檢測患者的尿常規、尿α1-微球蛋白(α1-MG)、尿轉鐵蛋白(TRU)、尿RBP、尿NAG、尿免疫球蛋白(IgG)、尿肌酐、血尿滲透壓、血Scr、24小時尿電解質、尿可滴定酸和尿銨、血β2-MG、血α1-MG、尿β2-MG、尿α1-MG、尿氨基酸測定、尿糖測定、尿蛋白電泳、尿濃縮稀釋實驗等)。正常對照組均系本院健康醫務人員和二醫大健康在校生。
在病人組中68例行腎活檢穿刺術并做病理切片。其中男性36例，女性32例。所有病理切片均行光鏡(包括HE、PAS、Masson和PASM染色)、免疫熒光和電鏡檢查。其中病理診斷為各類腎小球疾病者為38例(包括腎小球疾病引起的慢性腎功能衰竭7例)，急性腎小管損傷(包括急性腎小管壞死，腎曲管空泡變等)為15例，其他病因引起的慢性腎小管間質性病變7例。馬兜鈴酸腎病患者為8例，鏡下均表現為慢性腎小管間質性病變。
二)尿NEP定量檢測采用實施例1的方法步驟。
三)統計學分析用SAS6.12軟件及Excel進行相關分析，Wilcoxin秩和、符號秩檢驗和描述性分析。
二、結果(一)正常對照組尿NEP的檢測(結果見下表1)表1正常對照組尿NEP的檢測結果分組 例數 NEP中位數 四分位數間距(μg/mmol Cr) (μg/mmol Cr)總正常組 100 68.41 68.15男性組 54 71.84 69.28女性組 46 63.76 61.44＜60歲組 92 70.35 67.57≥60歲組 859.19 57.80男女尿NEP檢測差異無統計學意義(Z＝0.9356，P＞0.05)，＜60歲組和≥60歲組檢測差異無統計學意義(Z＝1.5483，P＞0.05)。正常對照組尿NEP的95％可信區間為46.29～89.52μg/mmol Cr。
(二)各組尿NEP及與正常組的比較(結果見下表2)表2各組尿NEP及與正常組的比較結果分組 各組樣本的中位數與正常對照組比較(μg/mmol Cr) P急性腎小管損傷組 196.360.0001*慢性腎小管損傷組 31.64 0.0017*馬兜鈴酸腎病組 32.78 0.0076*單純腎小球疾病組 75.49 0.1425腎小球疾病所致的CRF組19.40 0.0042*急性腎小管損傷組，尿中NEP明顯高于正常對照組(*P＜0.01)；慢性腎小管損傷組和馬兜鈴酸腎病組及CRF組，尿中NEP明顯低于正常對照組(*P＜0.01)；單純腎小球疾病組，尿NEP與正常對照差異無統計學意義(P＞0.05)。
(三)兩種檢測方法的符合率比較符合率是一項能同時反映敏感性和特異性的指標。為了比較本發明的ELISA法和熒光法檢測尿NEP的效果，同時用熒光法檢測尿NEP，并以尿NAG活性、尿α1-MG作為腎小管損傷的參考指標，對兩種測定方法進行符合率比較(結果詳見下表3、4)。
符合率＝(真陽性例數+真陰性例數)/總病例數。
其中，所采用尿NAG活性的正常參考值＜18.50u/l；尿α1-MG正常參考值＜1.28mg/ml。
表3以尿NAG活性為標準的兩種方法的符合率比較結果分組 ELISA 法符合 熒光法符合 兩種方法符合率比較率(％) 率(％) X2值 P值急性腎小管損傷組 77.27 79.54 0.032 0.885慢性腎小管損傷組 52.08 54.17 0.213 0.534馬兜鈴酸腎病組61.54 61.54 0.517 0.406腎小球疾病組 38.71 35.48 0.069 0.698CRF組 38.46 32.77 0.018 0.973表4以尿α1-MG活性為標準的兩種方法的符合率比較結果分組 ELISA 法符合 熒光法符合 兩種方法符合率比較率(％) 率(％) X2值 P值急性腎小管損傷組 43.45 46.45 0.530 0.467慢性腎小管損傷組 72.92 70.83 0.043 0.835馬兜鈴酸腎病組 69.23 76.92 0.000 1.000腎小球疾病組 41.94 38.71 0.065 0.799CRF組 69.23 69.23 0.170 0.680表3、4的X2檢驗均顯示各病人組兩種方法檢驗的符合率無顯著差異(P值均＞0.05)。
權利要求
1.一種尿中性肽鏈內切酶的免疫檢測方法，其特征在于該方法采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)技術。
2.根據權利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于該方法用于尿中性肽鏈內切酶的定量測定。
3.根據權利要求2所述的免疫檢測方法，其特征在于該尿中性肽鏈內切酶的濃度測定范圍為20-200μg/L。
4.根據權利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于該方法包括下列步驟1)用5-15μg/ml動物抗人尿中性肽鏈內切酶抗體包被酶標反應板，每孔50-200μl，置1-40℃12小時；2)棄去孔中液體，洗滌甩干；3)1-40℃封閉酶標反應板1-24小時；4)棄去孔中液體，洗滌甩干；5)加入適當稀釋的標準品、尿樣、緩沖液，每份均加復孔，每孔50-200μl，1-40℃孵育10分鐘-24小時；6)棄去孔中液體，洗滌甩干；7)加入2-10μg/ml動物抗人尿中性肽鏈內切酶的單克隆抗體，每孔50-200μl，1-40℃孵育1-24小時；8)棄去孔中液體，洗滌甩干；9)加入辣根過氧化物酶標記的抗步驟7中的動物免疫球蛋白的抗體，每孔50-200μl，1-40℃孵育1-24小時；10)洗滌甩干；11)顯色后，終止反應；12)酶標儀在λ＝450nm處讀取各孔吸光度OD值；13)根據標準系列濃度的吸光度值，在半對數坐標上得到標準曲線；14)根據標準曲線求得的回歸方程，將相應的吸光度值計算得到尿中性肽鏈內切酶的濃度。
5.根據權利要求4所述的免疫檢測方法，其特征在于該步驟1和7中所述的動物抗人尿中性肽鏈內切酶抗體為兔抗人或鼠抗人尿中性肽鏈內切酶抗體。
6.根據權利要求4所述的免疫檢測方法，其特征在于該步驟9中所述的辣根過氧化物酶標記的抗步驟7中的動物免疫球蛋白的抗體為1∶1000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠免疫球蛋白的抗體。
7.根據權利要求4所述的免疫檢測方法，其特征在于該步驟11中的顯色條件為加入現配的底物液，每孔50-200μl，1-40℃避光環境下。
8.如權利要求4-7任一權利要求所述的免疫檢測方法，其特征在于該方法的具體步驟為1)用10μg/ml兔抗人中性肽鏈內切酶的多克隆抗體包被酶標反應板，每孔100μl，置4℃，12小時；2)棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次3分鐘，甩干；3)用封閉液封閉酶標反應板，每孔200μl，置4℃，18小時；4)同步驟2；5)加入適當稀釋的標準品、尿樣、緩沖液，每孔100μl，每份標準品、樣品、緩沖液均加復孔，37℃孵育1小時；6)同步驟2；7)加入6μg/ml小鼠抗人中性肽鏈內切酶的單克隆抗體，每孔100μl，37℃孵育1小時；8)同步驟2；9)加入1∶1000辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠免疫球蛋白抗體，每孔100μl，37℃孵育1小時；10)洗滌液洗板4次，每次3分鐘甩干；11)加入現配的底物液，每孔100μl，37℃避光環境下顯色，15分鐘后，每孔加終止液50μl終止反應；12)酶標儀在λ＝450nm處讀取各孔吸光度OD值；13)根據標準系列濃度的吸光度值，在半對數坐標上得到標準曲線；14)根據標準曲線求得的回歸方程，將相應的吸光度值計算得到中性肽鏈內切酶的濃度。
全文摘要
本發明公開了一種用于定量檢測尿中性肽鏈內切酶的免疫檢測方法，其特征在于該方法采用ELISA法。本方法有較好的靈敏度，準確度和重復性，檢測的線性范圍能夠涵蓋臨床檢測標本；且本法操作簡便，方法無創，所需儀器價格低廉，一般醫學實驗室均可購置，成本較低，易于推廣。
文檔編號G01N33/577GK1580773SQ0314229
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月15日 優先權日2003年8月15日
發明者陳楠 申請人:上海第二醫科大學附屬瑞金醫院