專利名稱：微型反應杯式蛋白芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種微型反應杯式蛋白芯片及制備方法。
背景技術：
生物芯片技術是九十年代中期興起的一項新興生物技術，因其可在一次反應中進行多種信息的平行分析，而受到眾多研究者的矚目，迅速在諸多生物學領域得到應用。生物芯片技術按檢測對象分類，主要分為基因芯片和蛋白芯片兩類。蛋白芯片是一種前沿的技術。它通過固定于支持介質上的多種蛋白質構成的微陣列，直接檢測特定功能物質(標志性蛋白)現有的檢測尿液、血清及其它體液的方法，如ELISA、放射性同位素標記、金標、熒光、化學發光、時間分辨熒光等，大多是單指標檢測，信息量少，而且均具有局限性，如標記步驟復雜、儀器和試劑昂貴、操作煩瑣、靈敏度低、易污染等。與傳統檢測方式相比，蛋白芯片技術具有以下優點1)高通量，同時可進行多人份的檢測，也可單獨使用。
2)高敏感度和特異性；3)操作快速、簡便，適用于臨床即時檢測，只需一個半小時便能完成整個檢測反應過程；4)所需樣本量少。
但現有的生物芯片均將多種蛋白固定在一平面固相基質上，采用的材料有玻片、硅片、尼龍膜，硝酸纖維素膜等。用玻片和硅片等無機材料制備蛋白芯片需要將該載體進行化學修飾，操作復雜，而且化學修飾的均勻程度嚴重影響其后蛋白固定的好壞。用尼龍膜和硝酸纖維素膜等膜式有機材料制備蛋白芯片，雖然不需要進行化學修飾，操作相對簡單，但由于其存在毛細滲透現象，同時其均一性不能得到保證，難免影響檢測結果。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種檢測更為穩定、無樣品相互污染的微型反應杯式蛋白芯片。
本發明公開的微型反應杯式蛋白芯片是一種采用有機聚合物材料制成的具有腔室結構的固相載體，各腔室相互分隔有規則地排列，并可獨立使用，相互間有可折斷的橋式結構相聯。
本發明公開的微型反應杯式蛋白芯片由與之配套的有機聚合物材料制成的反應杯架進行支撐。
本發明公開的微型反應杯式蛋白芯片，其中所述的腔室可以是各種形狀，包括圓柱體、長方體、棱柱體、圓錐體或棱錐體等。
本發明所述有機聚合物材料包括聚丙交脂(PLA)、聚已交脂(PGA)、聚己內脂(PCL)、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、ABS樹脂、聚苯乙烯(PS)、纖維素、纖維素-聚乙烯、聚羥基丙酸脂或聚丙烯等。
下面結合附圖對本發明微型反應杯式蛋白芯片的結構作進一步的描述。
圖1為微型反應杯式蛋白芯片的結構示意圖。其中圖1-a為俯視圖，圖1-b為A-A剖視圖。由圖1可見微型反應杯上、下兩端凹陷形成上、下兩個腔室，分別是腔室1和腔室3。腔室1的底面2作為蛋白芯片載體，各種蛋白被有序地固定在2上，生化反應將在腔室1中進行，形成的腔室3使反應杯放置穩定，易于站立。各“反應杯”上部有“耳”式結構4，方便操作。“反應杯”間有“橋式”結構5相聯，該“橋式”結構可折斷。各“反應杯”具有完全分隔開的獨立反應空間，可獨立使用。各反應杯上有豎起的突起6，該突起與反應杯架對應。
圖2為與微型反應杯式蛋白芯片配套使用的反應杯架示意圖，該反應杯架可方便操作者同時對多個反應杯進行操作。反應杯架為多孔的板，孔的形狀與反應杯相對應，其上開有幾個到幾十個孔不等，每孔內有凹槽9，該凹槽與反應杯突起6對應，可將反應杯在杯架中固定。杯架上有數字記號8和字母記號7，方便操作人員進行記錄，區分待測的蛋白樣本。
本發明微型反應杯式蛋白芯片，可將有機聚合物材料注塑、模壓或沖壓制成，這種聚合物材料無毛細滲透現象，牢固并具有韌性，與其他材料制成的平面式蛋白芯片相比具有以下優點1)從真正意義上解決了反應腔室間的互相干擾問題。目前蛋白芯片的常規做法是在一大張硝酸纖維素膜、玻璃基質或其他基質上固定多個蛋白質點陣。然后采用切割或封閉的辦法使點陣分隔開，避免相互干擾。但此方法不能保證絕對的有效，很可能導致樣品相互污染。反應杯式的蛋白芯片從一開始就將各點陣完全獨立的固定在不同的反應杯內，因而根本解決了樣品相互污染的問題。
2)使基質上蛋白固定的量更為準確。膜式基質具有吸水性，因此，液體的毛細滲透時間、蛋白吸附能力等因素將嚴重影響最終固定的蛋白量。同時由于膜式基質制備工藝及材質特性，其均一性存在一定問題，可能導致不同蛋白質點陣中，蛋白固定的量不同，影響檢測結果。反應杯式蛋白芯片不具有吸水性，可保證不同蛋白質點陣中，固定相同的蛋白量，保證檢測的穩定性。
本發微型反應杯式蛋白芯片所固定的蛋白質樣品可以是抗原、抗體、受體，特別是與體內疾病性標志蛋白特異結合的蛋白，如SARS病毒相關蛋白、自身免疫疾病相關蛋白、腫瘤相關蛋白等。由于各“反應杯”內有序的固定了上述蛋白樣品，因此可以達到多樣品、多指標并行檢測的目的。
采用本發明微型反應杯式蛋白芯片制備多指標并行檢測的蛋白芯片的方法包括1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統將這些蛋白質點制在反應杯里，點樣密度在10-200點/cm2，點樣濃度為0.01-10mg/ml，點樣量0.1-40nl/點。
2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區域隨機吸附其它蛋白質，影響反應結果。干燥0.5-24小時。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理，2--8℃貯存。為了長期保持蛋白活性，采用凍干的方法來增加產品穩定性。
以下濃度單位除非特指均為w/v。
其中所述的稀釋液配方為0-0.04mol/l PBS+0-0.2％BSA，0-0.04mol/l TE+0-0.2％BSA或0--80mM的CBS溶液或0-40mM Tris.HCL+0-80mM NaCl+0--5mM EDTA或0--50mM NaAc或pH為7.0-8.0的PBS(KH2PO4-Na2PO4)。
其中所述的封閉液配方為70-95％CBS+5-15％小牛血清+1-9％蔗糖。或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。
采用上述蛋白芯片為主體，還可用于多指標并行檢測的試劑盒，利用化學發光反應同時檢測多種蛋白質在體液內的含量。該試劑盒包括1、蛋白芯片，其上固定有多種與體內疾病性標志蛋白特異結合的蛋白，如多種腫瘤標志物抗體，自免性疾病抗原，SARS蛋白抗原2、一種以一定濃度配比配制而成，并標記過氧化物酶的蛋白質或多蛋白質混合液。如辣根過氧化物酶標記的抗多種腫瘤標志物抗體混合物，辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG、兔抗人IgG或鼠抗人IgG等；3、一種產生化學發光反應的化合物組成的化學組合物；4、一種蛋白芯片的洗滌液；5、標準品一種已知蛋白質的標準混合液，該組分不是必須，視被檢測蛋白性質不同而選用。
圖1本發明微型反應杯式蛋白芯片結構示意圖1-a反應杯俯視圖1-bA-A剖視2反應杯架示意圖；圖3用本發明蛋白芯片檢測的SARS病人血樣結果的示意圖；圖4用本發明蛋白芯片檢測的干燥綜合癥病人血樣結果的示意5用本發明蛋白芯片檢測的類風濕性關節炎病人血樣結果的示意6用本發明蛋白芯片檢測的肝癌病人血樣結果的示意圖下面結合具體實施例進一步闡述本發明，但并不限制本發明的范圍。
具體實施例方式實施例1用于檢測SARS抗體蛋白芯片的制備反應杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型，微型反應杯形狀為圓柱體，反應杯架由ABS樹脂注塑成型。
1)將SARS的S蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、N蛋白用稀釋液稀釋到0.06mg/ml、M蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、3CL蛋白用稀釋液稀釋到0.04mg/ml、標準IgG蛋白用稀釋液稀釋到0.04mg/ml；用芯片自動點樣系統將這些蛋白質點制在反應杯里，每種蛋白2點平行，點樣密度在10-200點/cm2，點樣量40nl/點。點陣排布如下
2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區域隨機吸附其它蛋白質，影響反應結果。干燥30-60分鐘。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理，2-8℃貯存。為了長期保持蛋白活性，采用凍干的方法來增加產品穩定性。
以下濃度單位除非特指均為w/v。
其中所述的稀釋液配方為0.01mol/l PBS+0.2％BSA或0.02mol/lTE+0.2％BSA其中所述的封閉液配方為75％CBS+8％小牛血清+7％蔗糖。
用上述蛋白芯片檢測SARS患者血清，其中抗S蛋白抗體，抗M蛋白抗體，抗N蛋白抗體，抗3CL蛋白抗體均為陽性，結果如圖3所示。
實施例2用于檢測自身免疫疾病蛋白芯片的制備反應杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型，微型反應杯形狀為長方體，反應杯架由ABS樹脂注塑成型。
1)將dsDNA蛋白用稀釋液稀釋到0.3mg/ml、SSA-52蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、U1RNP蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、SSB蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、Jo-1蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、CK19蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、Scl-70蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml、SSA-60蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、Sm蛋白用稀釋液稀釋到0.07mg/ml、Histone蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、ssDNA蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、RF蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、CENP-B蛋白用稀釋液稀釋到0.1mg/ml、CCP蛋白用稀釋液稀釋到0.05mg/ml；用芯片自動點樣系統將這些蛋白質點制在反應杯里，每種蛋白2點平行，點樣密度在40點/cm2，點樣量20nl/點。
點陣排布如下
2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區域隨機吸附其它蛋白質，影響反應結果。干燥30-60分鐘。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理，2-8℃貯存。
以下濃度單位除非特指均為W/V。
其中所述的稀釋液配方為0.01mol/l PBS+0.2％BSA或0.02mol/l TE+0.2％BSA其中所述的封閉液配方為80％CBS+10％小牛血清+5％蔗糖。
用上述蛋白芯片檢測干燥綜合癥患者血清，其中ANA，抗SSA-60抗體，抗SSA-52抗體，抗Histones抗體，抗SSB抗體均為陽性，結果如圖4所示。
實施例3以用于檢測自身免疫疾病蛋白芯片為主體的檢測試劑盒的使用方法試劑盒組分蛋白芯片；反應液；檢測液；洗滌液。
1、濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍。
2、血清用洗滌液按1∶50稀釋，吸取200μl加入反應孔內。
3、37℃溫育振蕩30分鐘。棄去孔內的液體。
4、孔內加滿稀釋后的洗滌液，溫育振蕩5分鐘，棄去洗滌液。共洗滌3次。
5、每反應杯內中加入200μl反應液。
6、同步驟3。
7、同步驟4。
8、在每個反應杯內加入150μl已混合15分鐘的檢測液A和B混合液，靜置60秒。
9、用HD-2001系列生物芯片檢測儀讀取數據并進行數據分析。
用上述蛋白芯片檢測類風濕性關節炎患者血清，其中抗G-IgG(類風濕因子)抗體，抗CK-19抗體均為陽性，結果如圖5所示。
實施例4用于檢測腫瘤標志物蛋白芯片的制備方法和試劑盒反應杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型，微型反應杯形狀為圓柱體，反應杯架由ABS樹脂注塑成型。
1)將抗AFP抗體用稀釋液稀釋到0.25mg/ml，將抗CEA抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml，將抗NSE抗體用稀釋液稀釋到0.3mg/ml，將抗CA12-5抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml，將抗CA153抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml，將抗CA199抗體用稀釋液稀釋到0.5mg/ml，將抗B-HCG抗體用稀釋液稀釋到0.7mg/ml，將抗HGH抗體用稀釋液稀釋到0.3mg/ml，將抗CA242抗體用稀釋液稀釋到0.7mg/ml，將抗PSA抗體用稀釋液稀釋到0.25mg/ml，將抗f-PSA抗體用稀釋液稀釋到0.3mg/ml，用芯片自動點樣系統將這些蛋白質點制在反應杯里，每種蛋白2點平行，點樣密度在40點/cm2，點樣量20nl/點。點陣分布為
2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區域隨機吸附其它蛋白質，影響反應結果。干燥60分鐘。
3)將蛋白芯片冷凍干燥處理，2-8℃貯存。
以下濃度單位除非特指均為W/V。
其中所述的稀釋液配方為0.01mol/l PBS+0.2％BSA或0.02mol/l TE+0.2％BSA其中所述的封閉液配方為80％CBS+10％小牛血清+5％蔗糖。
以上述蛋白芯片作為主體制備用于體內腫瘤標志物含量的試劑盒。試劑盒組分包括蛋白芯片；反應液；檢測液；洗滌液；標準品(一系列已知蛋白濃度腫瘤標志物的凍干品)。
用該試劑盒檢測肝癌患者的血清中腫瘤標志物的含量，其中AFP和CA-125均為陽性，結果如圖6所示。
權利要求
1.一種微型反應杯式蛋白芯片，其特征在于該芯片是采用有機聚合物材料制成的具有腔室結構的固相載體，各腔室相互分隔有規則地排列，并可獨立使用，相互間有可折斷的橋式結構相聯。
2.根據權利要求1所述的微型反應杯式蛋白芯片，其特征在于其中所述的腔室形狀包括圓柱體、長方體、棱柱體、圓錐體或棱錐體等。
3.根據權利要求1所述的微型反應杯式蛋白芯片，其特征在于其中所述的有機聚合物材料包括聚丙交脂、聚已交脂、聚己內脂、聚甲基丙烯酸甲脂、ABS樹脂、聚苯乙烯、纖維素、纖維素-聚乙烯、聚羥基丙酸脂或聚丙烯等。
4.根據權利要求1所述的微型反應杯式蛋白芯片，其特征在于所述的微型反應杯上、下兩端凹陷形成上、下兩個腔室，分別是腔室(1)和腔室(3)，腔室(1)的底面(2)作為蛋白芯片載體，各反應杯上部有“耳”式結構(4)，反應杯間有橋式結構(5)相聯，該“橋式”結構可折斷，各反應杯上有豎起的突起(6)，與反應杯架對應。
5.根據權利要求4所述的微型反應杯式蛋白芯片，其特征在于其中所述的反應杯架為多孔的板，孔的形狀與反應杯相對應，其上開有幾個到幾十個孔不等，每孔內有凹槽(9)，該凹槽與反應杯突起(6)對應，杯架上有數字記號(8)和字母記號(7)。
6.根據權利要求1所述的微型反應杯式蛋白芯片應用，其特征在于所述的蛋白芯片可用于體內疾病性標志蛋白特異結合的蛋白的多指標并行檢測。
7.一種微型反應杯式蛋白芯片的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)將有機聚合物材料注塑、模壓或沖壓制成微型反應杯式蛋白芯片；2)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統將這些蛋白質點制在反應杯腔室(1)的底面(2)上，點樣密度在10-200點/cm2，點樣濃度為0.01-10mg/ml，點樣量0.1-40nl/點；3)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，干燥0.5-24小時；4)將蛋白芯片冷凍干燥處理，2-8℃貯存。
8.根據權利要求7所述的微型反應杯式蛋白芯片的制備方法，其特征在于其中所述的稀釋液配方為w/v0-0.04mol/l PBS+0-0.2％BSA，0-0.04mol/l TE+0-0.2％BSA或0--80mM的CBS溶液或0-4mMTris.HCL+0-80mM NaCl+0--5mM EDTA或0--50mM NaAc或pH為7.0-8.0的PBS(KH2PO4-Na2PO4)；其中所述的封閉液配方為w/v70-95％CBS+5-15％小牛血清+1-9％蔗糖。或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。
全文摘要
本發明涉及一種微型反應杯式蛋白芯片及制備方法。該微型反應杯式蛋白芯片是一種采用有機聚合物材料制成的具有腔室結構的固相載體，各腔室相互分隔有規則地排列，并可獨立使用，相互間有可折斷的橋式結構相聯。采用本發明蛋白芯片進行蛋白質樣品的多指標并行檢測，可使檢測更為穩定，同時無樣品相互污染問題。
文檔編號G01N33/50GK1580770SQ0314199
公開日2005年2月16日 申請日期2003年7月31日 優先權日2003年7月31日
發明者胡賡熙 申請人:上海數康生物科技有限公司