專利名稱：過濾、吸附及滅活病毒的納米催化材料的快速篩選方法
技術領域：
本發明涉及催化材料，具體地說是一種過濾、吸附及滅活病毒的納米催化材料的快速篩選方法。
背景技術：
非典型性肺炎(atypical pneumonia)又名嚴重急性呼吸系統綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)[文獻1.Poutanen SM，Low DE，Henry B，Finkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，AyersM，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，Slutsky AS，Doyle PW，Krajden M，Petric M，Brunham RC，McGeer AJ，N.Engl.J.Med，2003，3481993；文獻2.Lee N，Hui D，Wu A，Chan P，Cameron P，Joynt GM，Ahuja A，Yung MY，Leung CB，To KF，Lui SF，Szeto CC，Chung S，Sung JJ，N.Engl.J.Med，2003，3481984；文獻3.Tsang KW，Ho PL，Ooi GC，Yee WK，Wang T，Chan-Yeung M，Lam WK，Seto WH，Yam LY，Cheung TM，Wong PC，Lam B，Ip MS，Chan J，Yuen KY，Lai KN.，N.Engl.J.Med，2003，3481975]，從2002年11月26日我國廣州出現第一例非典型性肺炎病人，至2003年4月份達到流行高峰并曼延至全國多個省份及城市，病人達5000余，世界上其他國家也有病例報道；全世界的科學家正以極大的熱情投入到相關的研究中。目前，SARS病毒的基因測序已經完成，SARS病毒的可能結構模型已經得出[文獻4.Thomas G.Ksiazek，Dean Erdman，Cynthia S.Goldsmith，et al.N.Engl.J.Med.2003，3481953-65]，抗SARS藥物和疫苗的研制也在加緊進行，但根據藥物和疫苗研制的規律，短時間內恐難以進入臨床實用階段；為預防SARS，保障人類的安全與健康，申請人聯合大連醫科大學組織開展了“用于呼吸道病毒阻隔、吸附和滅活的納米催化材料及相關作用機制研究”，擬利用化物所在催化、分析的優勢，研制出能對病毒具有廣譜殺滅作用的納米催化材料，應用于各種防護設施，有效控制SARS的傳播。
SARS病毒主要是由近三萬個堿基組成的RNA和三個糖蛋白組成的蛋白外殼構成[參見文獻1～4]；由于直接使用病毒進行催化材料過濾、吸附及滅活評價的周期較長，因此首先要建立可對催化劑進行快速篩選的方法；由于擬發展的材料是廣譜性的吸附、氧化材料，初步可考慮選用構成SARS病毒的相近糖蛋白和RNA作為催化材料快速篩選的評價對象；傳統的病毒活性檢測方法是通過細胞培養的方式來分離培養病毒，然后對其特性，包括感染細胞后的細胞病變效應及血凝試驗等來加以鑒定，但傳統方法對病毒進行鑒定需要的周期較長，對操作環境的要求也較高；但由于糖蛋白的分析、檢測方法的建立，RNA的合成均需要較長的時間，也存在一定難度，而且我們的最終目的是篩選非特異性的高效納米催化材料，因此本發明選用較RNA更穩定的DNA分子[文獻5.Leone K.S.，Wessner L.L.，McenteeM.F.，Carcinogenesis 1997，181163；文獻6.Ren J.，Ulvik A.，Ueland P.M.，Refsum H.，Anal.Biochem.1997，24579]做探針，建立對納米催化材料吸附性能和抗水性能進行快速篩選和評價的方法，并利用本發明給出的氣溶膠發生器裝置，建立納米催化材料對病毒阻隔、吸附和滅活評價的實驗方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種對催化材料性能評價周期短的過濾、吸附及滅活病毒的納米催化材料的快速篩選方法。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為1)以100～1000個堿基的核酸分子片段作為探針，采用噴灑或浸泡的方式將核酸分子吸附于催化劑上，然后用不少于探針原液9倍的水進行洗脫，篩選出吸附能力強的(吸附量為原液的90％(w/w)以上)或較強(吸附量為原液的60％(w/w)以上)催化劑；
2)將上述步驟選取的催化劑對目標病毒進行吸附、洗脫，對催化劑用水或生理鹽水一次或多次洗脫，然后對洗脫液中的病毒進行傳統的活性檢測；篩選出對病毒的過濾、吸附及滅活作用好的(吸附量為原液的95％(w/w)以上且能殺滅病毒)催化劑。
所述的核酸分子最好為熒光標記的核酸分子；最好采用PCR方式制備而成；本發明步驟1)中的洗脫液的檢測是采用毛細管電泳方法，其采用的篩分介質為線性聚丙烯酰胺凝膠；具體操作條件為，線性聚丙烯酰胺凝膠涂層毛細管柱50μm×47cm，進樣電壓為15kV，分離溫度為50℃，分離電壓15kV；本發明所述目標病毒也可以為與其性質類似的病毒，性質類似是指直徑大小相近、包膜的結構相似；當目標病毒為SARS病毒，性質類似的病毒應為副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。
為進一步簡化病毒實驗，本發明提供了一種專用裝置，用于步驟2)中催化劑對目標病毒的吸附過程；氣溶膠發生器由空氣氣瓶、三通、吸附腔、病毒樣品容器構成，具體為空氣氣瓶經減壓表和凈化管接三通的進氣口，三通的一出氣口經數字調節閥和壓力表接吸附腔中上部，三通的另一出氣口經噴霧量調節閥接吸附腔上端，在噴霧量調節閥和吸附腔之間的管路上連接有病毒樣品容器和噴霧開關，吸附腔下端帶有排氣口，排氣口插入吸液瓶中；所述吸附腔上部為可拆卸的有機玻璃套管，中下部裝有不銹鋼紗網，紗網上裝催化劑，催化劑上蓋有紗布。
催化劑毒性用細胞毒實驗評價，采用白血病耐藥細胞株和白血病敏感細胞株，用不同濃度梯度的催化劑對細胞毒性的作用大小，來確定其毒性范圍。
本發明具有如下優點1.首先以核酸分子作為探針，以副流感病毒作為模擬對象，建立了對納米催化材料吸附性能和抗水性能進行快速篩選和評價的方法，并進行了相應催化材料過濾、吸附核酸分子的作用特性研究；進行納米催化材料阻隔、吸附和滅活病毒的可能性的快速研究，并以此為思路建立了DNA吸附能力的快速評價方法。
2.為進一步簡化病毒實驗，本發明提供了一種簡便易操作的氣溶膠發生器裝置，在此基礎上建立了對納米催化材料阻隔、吸附及滅活病毒作用進行評價的實驗方法，可對新合成的催化劑對病毒的阻隔、吸附和滅活作用進行評價，知道是否對病毒具有吸附和殺滅作用；并對多種催化材料進行了病毒吸附及滅活實驗。
3.運用吸附-洗脫-接種雞胚再增殖試驗的辦法來評價固體材料對病毒的吸附、滅毒效果(具體地說，病毒在固體吸附劑上吸附后，用水或生理鹽水一次或多次洗脫，對洗脫液采用雞胚再增殖試驗病毒是否有活性的辦法)；針對SARS病毒，選用與其性質類似的副流感病毒(PIV)、流感病毒(IV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒(AdV)等進行催化劑吸附與滅活病毒的實驗研究。對催化劑吸附病毒后的洗脫液進行血凝試驗，以血凝效價對催化劑的吸附能力進行評價；經納米催化劑吸附作用于病毒后先后三次洗脫病毒液經100倍稀釋后接種于9-11日齡雞胚(尿囊腔)，孵育后收獲尿液測病毒血凝效價，并與接種前的血凝效價進行比較、孵育，取出雞胚置4℃過夜，次日收獲尿液測病毒血凝效價，并與接種前的血凝效價進行比較，以證明病毒增殖狀況，判定病毒是否被滅活。
圖1帶病毒的氣溶膠發生器；圖2玻璃微球的DNA洗脫液CE圖；圖3普通分子篩的DNA洗脫液CE圖；圖4吸附性能較強的催化材料DNA洗脫液CE圖；圖5慢吸附催化材料的DNA洗脫液CE圖；圖6弱吸附催化材料的DNA洗脫液CE圖。
具體實施例方式
實施例1.
DNA分子制備本實例所用的DNA分子為K-ras基因第一外顯子中一段長為211bp的DNA片段，由熒光(6-FAM，也可以用其它熒光素標記，如HEX，TET，ROX等)標記的引物經聚合酶鏈反應(PCR)擴增而成；PCR反應體積為50μl，包括1μl模板DNA(100ng)，5μl PCR緩沖液，4μl dNTP混合物，1.5U Taq DNA聚合酶，PCR引物各25Pmol，去離子水適量；PCR反應條件為96℃預變性5min，然后94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環后，72℃再延伸7min，4℃放置。
催化材料的DNA分子吸附實驗將上述的PCR產物用去離子水稀釋成30倍的DNA分子原液。然后稱取0.2-0.3g催化材料，使之在表面皿上均勻鋪開。取50μl的DNA分子原液噴灑到催化材料表面，并調勻，分別過10min，20min后洗脫，離心過濾，取上清液進行分析。
在310型DNA全自動遺傳分析儀上電泳，激光誘導熒光檢測。篩分介質為短鏈線性聚丙烯酰胺凝膠[10]，涂層毛細管柱[11]50μm×47cm，進樣時間和進樣電壓分別為5-50s，15kV，分離溫度為50℃，分離電壓15kV。
吸附量大于90％為強吸附，60％-90％為中等吸附，小于60％為弱吸附。
病毒氣溶膠的阻留與吸附實驗副流感病毒(1∶1280)0.1ml置氣溶膠發生器內，以每秒按開關進行1次噴霧，共噴霧氣溶膠120次，形成的病毒氣溶膠通過兩層200目孔不銹鋼網(于兩層200目不銹鋼網之間加每種不同納米催化材料2g，鋪平約4.5-5.0mm)，收集在2.0ml生理鹽水中，立即測試病毒的血凝效價。
實施例2.玻璃微球對DNA分子吸附能力的評價玻璃微球表面光滑，原理上對DNA分子無吸附能力。經其吸附后的洗脫液中DNA分子的含量應該與DNA分子原液相近，我們的實驗也得到了預想的結果；如圖2所示，未經純化處理的玻璃微球對DNA分子有少量吸附，經過乙醇和水清洗的玻璃微球對DNA分子無吸附，這也說明所建立的方法可用于納米催化材料的DNA吸附能力評價。
實施例3.分子篩對DNA分子吸附能力的評價5A分子篩是一種常見的吸附劑，對DNA分子應該有一定的吸附作用，但不會太強。我們也用上述方法對5A分子篩的DNA分子吸附性能進行了考察，與預期效果完全一致(圖3)；與此同時，我們還比較了水洗脫及甲醇/水(1∶1)洗脫的效果，發現兩種洗脫方法的效果相近，因此對所有材料的DNA吸附能力評價均選用水洗脫。
實施例4.固體材料對DNA分子吸附能力的評價大部分都具有不同程度的吸附能力，對DNA分子也應有不同程度的吸附；因此本實驗用此法對近百種催化材料進行了吸附實驗；結果表明，大部分吸附性能強的催化材料在10min內即可將DNA完全吸附(圖4)，少部分需要近20min分鐘才能吸附完全(圖5)，對DNA分子吸附性能較差的催化材料在20min后，其洗脫液中仍然含有大量DNA分子(圖6)。
實施例5.納米催化劑細胞毒試驗本實驗所用的細胞株為白血病耐藥細胞株(K562/A)和白血病敏感細胞株(K562/S)，分別將K562/A和K562/S制成2×105個/ml和1×105個/ml的細胞懸液。每種催化材料均制成三個濃度梯度原液(1000ug/ml)、1/10原液(100ug/ml)、1/100原液(10ug/ml)。取各催化材料樣品100μL和細胞100μL加入96孔細胞培養板，催化材料的三個劑量(絕對量)100μg、10μg、1μg來確定其細胞毒范圍；將96孔細胞培養板放入CO2孵箱孵育24h，顯微鏡下觀察細胞形態。
實施例6.納米催化劑吸附與滅活病毒試驗
1)方法稱取催化劑1g于無菌瓶中，加病毒液(1∶1280)0.1ml于室溫混合作用30min，每10min振蕩2min，共操作3次，加入2ml無菌生理鹽水，立即混勻振蕩2min 1000r/min離心5min。吸取洗脫病毒液進行血凝試驗，同時吸取0.1ml稀釋100倍后，取0.1ml接種9-11日齡雞胚(尿囊腔接種)，置37℃孵箱孵育72h后收集尿液測病毒血凝效價，并與培養前的血凝效價進行比較，以證明病毒增殖狀況，判定病毒是否被滅活。
2)結果催化劑吸附病毒液30min后，用2ml生理鹽水振蕩2min洗脫病毒，離心后收集洗脫液1；然后加3ml生理鹽水輕微搖動以洗脫游離的病毒，離心后收集洗液2；最后加2ml生理鹽水，混勻后強振蕩3次，每次2min。每隔10分鐘振蕩1次，離心后收集洗脫液3。將三種洗液分別測血凝效價(表1)，然后用洗脫液1和洗脫液3分別接種9-11日齡雞胚，進行病毒增殖；3天后收獲尿囊液測病毒血凝效價，結果如表2。
表1 催化劑吸附病毒的3次洗脫液血凝效價
表2 洗脫液接種雞胚前后的血凝效價比較
催化材料對副流感病毒的吸附-洗脫-接種雞胚再增殖試驗的結果表明，ASC-28和AB-2-1兩種納米催化材料具有吸附與滅活副流感病毒的作用。其中ASC-28吸附病毒后洗脫液能查出少量病毒(1∶20)，但接種雞胚后無病毒增殖，證明病毒已被滅活。AB-2-1的洗脫液接種雞胚前后均為陰性，證明病毒完全被吸附并已被滅活。實驗中也有在洗脫液中有少量病毒存在，但保持活性，經接種雞胚增殖后血凝效價呈升高趨勢，如ASC-32和DSA-4接種前血凝效價分別為1∶60和1∶40，接種雞胚后增殖，血凝效價均上升為1∶1280，說明這種吸附并不能滅活病毒。
發明效果選用核酸分子及副流感病毒作為探針和模擬對象，進行了納米催化材料吸附、滅活病毒的實驗研究。結果表明，選用DNA分子作為探針，可對研制的納米催化材料的吸附能力進行快速地篩選及評價，可為進一步的病毒模擬實驗提供依據。副流感病毒實驗的結果表明，應用本發明評價的101種納米催化材料中，發現兩種材料具有吸附與滅活副流感病毒的作用。其中一種吸附病毒后洗脫液能查出少量病毒，但接種雞胚后無病毒增殖，證明病毒已被滅活。另一種的洗脫液接種雞胚前后均為陰性，證明病毒完全被吸附并已被滅活。說明我們所建立的方法完全適用于對催化材料過濾、吸附及滅活病毒的評價。
權利要求
1.過濾、吸附及滅活病毒的納米催化材料的快速篩選方法，其特征在于1)以100～1000個堿基的核酸分子片段作為探針，采用噴灑或浸泡的方式將核酸分子吸附于催化劑上，然后用不少于探針原液9倍的水進行洗脫，篩選出吸附能力強的、即吸附量為原液重量60％)以上的催化劑；2)將上述步驟選取的催化劑對目標病毒進行吸附、洗脫，對催化劑用水或生理鹽水一次或多次洗脫，然后對洗脫液中的病毒進行傳統的活性檢測；篩選出對病毒的過濾、吸附及滅活作用好的、即吸附量為原液重量95％的催化劑。
2.按照權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于所述的探針為核酸分子。為了提高靈敏度，可采用熒光標記的辦法。
3.按照權利要求2所述的快速篩選方法，其特征在于所述的核酸分子是采用PCR方式制備而成。
4.按照權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于所述步驟1)中的洗脫液的檢測是采用毛細管電泳方法，其采用的篩分介質為線性聚丙烯酰胺凝膠。
5.按照權利要求4所述的快速篩選方法，其特征在于所述毛細管電泳方法具體操作條件為，線性聚丙烯酰胺凝膠涂層毛細管柱50μm×47cm，進樣電壓為15kV，分離溫度為50℃，分離電壓15kV。
6.按照權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于所述目標病毒也可以為與其性質類似的病毒，所述性質類似是指直徑大小相近、包膜的結構相似。
7.按照權利要求6所述的快速篩選方法，其特征在于所述目標病毒為SARS病毒，性質類似的病毒副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等。
8.一種按照權利要求1所述的快速篩選方法的專用裝置，其特征在于步驟2)中催化劑對目標病毒的吸附過程是在氣溶膠發生器進行的，氣溶膠發生器由空氣氣瓶(1)、三通(4)、吸附腔(7)、病毒樣品容器(8)構成，具體為空氣氣瓶(1)經減壓表(2)和凈化管(3)接三通(4)的進氣口，三通(4)的一出氣口經數字調節閥(5)和壓力表(6)接吸附腔(7)中上部，三通(4)的另一出氣口經噴霧量調節閥(8)接吸附腔(7)上端，在噴霧量調節閥(8)和吸附腔(7)之間的管路上連接有病毒樣品容器(8)和噴霧開關(9)，吸附腔(7)下端帶有排氣口，排氣口插入吸液瓶(10)中；所述吸附腔(7)上部為可拆卸的有機玻璃套管，中下部裝有不銹鋼紗網(11)，紗網(11)上裝催化劑(12)，催化劑(12)上蓋有紗布(13)。
全文摘要
本發明涉及催化材料，具體地說是一種過濾、吸附及滅活病毒的納米催化材料的快速篩選方法，具體操作為1)以100～1000個堿基的核酸分子片段作為探針，采用噴灑或浸泡的方式將核酸分子吸附于催化劑上，然后用不少于探針原液9倍的水進行洗脫，篩選出吸附能力強的、即吸附量為原液重量60％)以上的催化劑；2)將上述步驟選取的催化劑對目標病毒進行吸附、洗脫，對催化劑用水或生理鹽水一次或多次洗脫，然后對洗脫液中的病毒進行傳統的活性檢測；篩選出對病毒的過濾、吸附及滅活作用好的、即吸附量為原液重量95％的催化劑。本發明首先以核酸分子作為探針，建立了對納米催化材料吸附性能和抗水性能進行快速篩選和評價的方法。
文檔編號G01N33/00GK1553180SQ0313353
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月31日 優先權日2003年5月31日
發明者許國旺, 明平文, 楊凌, 劉中民, 張卓然, 趙春霞, 馬磊, 許磊, 齊越, 孫承林, 韓秀文, 陳研, 曲振平, 繆少軍, 鄭叢龍, 趙欣捷, 杜遜甫, 劉波, 孔宏偉, 王暢, 葉芬, 胡剛, 劉宇新, 劉頁, 張濤, 黃向陽, 包信和 申請人:中國科學院大連化學物理研究所