專利名稱：一種制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法
技術領域：
本發明涉及一種在電極表面用自組裝的方法制備二氧化鈦凝膠膜并固定生物活性物質制備電化學生物傳感器。
現行的載體表面生物物質的固定方法有吸附法、共價鍵合法、交聯法和包埋法。吸附法是一種簡單的固定方法，通常是通過靜電引力的作用來固定生物物質，這種方法對生物物質的活性保持較好，但所固定的分子不是很穩定。共價鍵合法固定生物物質，往往表面濃度低，而且會影響生物物質的活性。交聯法中各種條件往往不容易控制，因此實用化受到一定的限制。包埋法利用生物相容性好的高分子材料和溶膠-凝膠方法進行生物物質的固定在近年來受到廣泛關注。
溶膠-凝膠法借助溶膠-凝膠過程的形成來包埋固定生物物質，而傳統的溶膠-凝膠法包括了溶膠的形成、凝膠化、干燥和老化幾個步驟。常見的溶膠-凝膠法制備生物傳感器是將生物物質分散于溶膠后涂在相應的載體表面，利用凝膠化過程固定生物物質。而硅溶膠不但需要用強酸催化，而且在干燥的過程中，水揮發的速度控制不好直接導致膜的開裂，使固定生物物質失敗。因此為了改進固定方法，一些新物質和新方法被提出改進生物物質的固定。氧化鈦溶膠-凝膠就是其中的發展方向之一。董紹俊等將二氧化鈦溶膠與含酶的聚乙烯基吡啶水溶液混合，通過涂膜在4度的條件下放置24-48小時，制得生物傳感器(中國專利01128285)。鞠熀先等利用氣相沉積法發展了一種新型的生物物質固定方法，并用于制備新型生物傳感器(中國專利01138059)。
二氧化鈦是一類重要的半導體材料，它們被廣泛地應用于化學傳感器、磁性存儲介質、太陽能轉換、電子器件和催化等領域。近年來，過渡金屬氧化物納米粒子因其具有大的表面體積比、高的活性、特殊的電學性能和獨特的光學性質而引起了科學界的廣泛關注。Sadaghi小組通過一系列的電化學檢測，直接證明了TiO2在電極表面有很好的生物相容性[參見(1)E.Topoglidis，A.E.G.Cass，G.Gilardi，S.Sadaghi，Anal Chem.1998，70，5111]由于它獨特的生物化學性質，對生物分子的高度選擇性，同時TiO2又提供了很高的比表面積來固定酶等生物分子[參見(2)Q.Li，G.Luo，and J.Feng，Electroanalysis，2001，13，359.(3)Q.Li，G.Luo，Electroanalysis，2001，13，413]。納米TiO2膜不僅保持了生物分子的活性，同時還為這些分子的固定提供了很高的相容性。還沒有通過分子自組裝的方法在溶膠凝膠中固定TiO2膜，并且用來固定生物分子的報導。
而電化學檢測技術由于其儀器簡單，檢測靈敏度高，具有非常廣闊的應用前景。發展電化學傳感器對于進行在線實時檢測具和儀器的自動化都有很大的意義。
本發明的技術方案如下一種制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法，它主要由下列步驟組成步驟1、制備TiO2膜步驟1.1.將ITO電極在2～8mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡5～12個小時，使電極表面-OH化步驟1.2.將步驟1.1所得的電極浸入50-300mM鈦酸丁酯溶液中2-5分鐘，溶劑為體積比為1∶3～3∶1的乙醇和甲苯混合溶劑，步驟1.3.把步驟1.2所得的電極放入無水乙醇中浸泡1-3分鐘，步驟1.4.將步驟1.3所得的電極在二次水中浸泡1-3分鐘，步驟2、將步驟1所得的電極浸入酶的水溶液(濃度2～4mg/L)中30～120分鐘，利用溶膠化表面的電荷來吸附生物酶，利用鈦酸丁酯在凝膠化的過程來固定和包埋酶，從而制備成生物傳感器，該傳感器的靈敏度、檢測限等性能可以通過電化學檢測儀來測定。
上述的制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法，在步驟1.1之后，可以增加步驟1.1.1步驟1.1.1.將步驟1.1所得的電極浸入到質量百分濃度為10～15％的硅烷偶聯劑氨丙基三甲氧基硅烷(KH550)或硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷KH560水溶液中5-25分鐘，使電極表面-NH2化，其余步驟同上述制備方法。
將電極表面改變性質，用硅烷偶聯劑和電極表面的羥基反應使ITO電極表面生成一層氨基。氨基上的氮不但能有良好的配位效應，還具有和羥基相反的電荷，可以更好的固定表面生成的溶膠-凝膠膜，如此制備的二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的使用壽命長達一個月。
本發明與現有技術相比，顯著的優點是溶膠-凝膠成膜過程和生物物質固定過程合二為一，大大縮短了反應時間。現有工藝通常都需要很長的凝膠化時間，為防止膜的干裂，必須使水分慢慢地揮發干，而本發明的工藝大大縮短了凝膠化時間。由于在電極表面衍生出的羥基或氨基使得溶膠-凝膠膜能很好地固定在電極表面，防止了膜從表面脫落。表面鈦酸丁酯量的減少也使得膜不會開裂，能有效的固定生物活性物質。在溶膠凝膠過程中不加入酸或表面活性劑，避免了酶的失活。本發明的方法簡化了溶膠和凝膠成膜和生物傳感器的制備過程，而且由于制備過程中的膜厚度可控，膜不易開裂和脫落。凝膠膜的制備過程溫和，生物相容性較好，不會影響生物物質的活性，使得制得的傳感器性質良好。
圖2為相同過氧化氫濃度下本發明方法制備的傳感器在不同檢測電位下得到的響應電流曲線。
圖3為本發明方法制備的傳感器測定過氧化氫的濃度和電流關系曲線。
圖4為本發明方法制備的葡萄糖生物傳感器測定葡萄糖的濃度-電流曲線。
五具體實施例方式
實施例1.自組裝形成二氧化鈦膜并制備過氧化氫生物傳感器1.將ITO電極切割成0.5×1.0cm大小，然后將其放入清潔劑中超聲清洗15分鐘2次，然后在無水乙醇中超聲清洗10分鐘，最后在二次水中超聲清洗15分鐘，結束后，將電極吹干，靜置待用。
1.1.將ITO電極在5mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡10個小時，取出后用二次水充分淋洗，氮氣吹干；1.2.將電極浸入100mM鈦酸丁酯溶液中3分鐘，溶劑為體積比1∶1的乙醇和甲苯混合溶液；然后把電極放入無水乙醇中浸泡一分鐘，最后將電極在二次水中浸泡一分鐘。
2.將上述修飾電極浸入2mg/mL辣根過氧化物酶水溶液中30分鐘，從而組成生物傳感器，該傳感器的靈敏度、檢測限等性能通過電化學檢測儀來測定。
3.電化學測定在電解池中加入100mmol/L的磷酸緩沖溶液(用三電極體系，修飾過的ITO電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極)，對每一個電極修飾過程都進行電流-時間測定，通過連續的加入不同濃度的H2O2溶液，以測定該傳感器的性能。通過電流-時間的測定，可以檢測出該生物傳感器在pH＝6.0，溫度為30攝氏度，還原電位為-0.35V時的響應達到最大值。條件選擇實驗結果見
圖1、圖2。
通過穩態電流法進行了測定過氧化氫的研究，結果如圖3所示。其結果表明，通過該方法制備的傳感器可以在10s內達到最大響應，檢測限達10-6mol/L，檢測線性范圍為2×10-6mol/L～3×10-3mol/L，檢測實例見表1，五次重復檢測標準偏差為2.4％，并且該傳感器可以保存14天不失去活性，可以重復使用。
實施例2.自組裝形成二氧化鈦膜并制備過氧化氫生物傳感器1.將ITO電極切割成0.5×1.0cm大小，然后將其放入清潔劑中超聲清洗15分鐘2次，然后在無水乙醇中超聲清洗10分鐘，最后在二次水中超聲清洗15分鐘，結束后，將電極吹干，靜置待用。
1.1.將ITO電極在2mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡12個小時，取出后用二次水充分淋洗，氮氣吹干；1.2.將電極浸入200mM鈦酸丁酯溶液中2分鐘，溶劑為體積比3∶1的乙醇和甲苯混合溶液；1.3.把電極放入無水乙醇中浸泡3分鐘；1.4.將電極在二次水中浸泡3分鐘；2.將上述修飾電極浸入2mg/mL辣根過氧化物酶水溶液中120分鐘，從而組成生物傳感器，該傳感器的靈敏度、檢測限等性能通過電化學檢測儀來測定。具體條件同實施例1。
該方法制備的傳感器可以在10s內達到最大響應，檢測限達10-6mol/L，檢測線性范圍為2×10-6mol/L～3×10-3mol/L，并且該傳感器可以保存14天不失去活性，可以重復使用。
實施例3.自組裝形成二氧化鈦膜并制備過氧化氫生物傳感器電極的清洗及表面-OH化的過程同實施例1，在-OH化后，可以將電極浸入到10％的硅烷偶聯劑KH550水溶液中25分鐘，使電極表面-NH2化，其余步驟同實施例1。
得到的生物傳感器性能穩定性更好，保存一個月不失活，實驗條件的選擇同實施例4.自組裝形成二氧化鈦膜并制備過氧化氫生物傳感器將實施例中的硅烷偶聯劑KH550換成硅烷偶聯劑KH560，其余同實施例3。
電化學生物傳感器性能測試同實施例3。
實施例5.自組裝形成二氧化鈦膜并制備葡萄糖電化學傳感器
1.將ITO電極切割成0.5×1.0cm大小，然后將其放入清潔劑中超聲清洗15分鐘2次，然后在無水乙醇中超聲清洗10分鐘，最后在二次水中超聲清洗15分鐘，結束后，將電極吹干，靜置待用。
1.1.將ITO電極在8mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡5個小時，取出后用二次水充分淋洗，氮氣吹干；1.2.將電極浸入50mM鈦酸丁酯溶液中5分鐘，溶劑為體積比1∶3的乙醇和甲苯混合溶液；1.3.把電極放入無水乙醇中浸泡3分鐘；1.4.將電極在二次水中浸泡3分鐘；2.將上述修飾電極浸入4mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液中120分鐘，從而制成葡萄糖酶傳感器。測定葡萄糖濃度范圍為3×10-4mol/L～1×10-2mol/L(見圖4)，檢測實例見表2，五次重復檢測標準偏差為9.4％。該傳感器可以重復使用，14天內不失去活性。
實施例6.自組裝形成二氧化鈦膜并制備葡萄糖電化學傳感器電極的清洗及表面-OH化的過程同實施例1，在-OH化后，可以將電極浸入到15％的硅烷偶聯劑KH550中5分鐘，使電極表面-NH2化，其余步驟同實施例5。
得到的生物傳感器性能穩定性更好，保存一個月不失活，檢測條件的選擇同表1，過氧化氫生物傳感器測定牛奶中過氧化氫
表2，葡萄糖生物傳感器測定尿中葡萄糖含量
權利要求
1.一種制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法，其特征是它主要由下列步驟組成步驟1、制備TiO2膜步驟1.1.將ITO電極在2～8mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡5～12個小時，步驟1.2.將步驟1.1所得的電極浸入50-300mM鈦酸丁酯溶液中2-5分鐘，溶劑為體積比為1∶3～3∶1的乙醇和甲苯混合溶劑，步驟1.3.把步驟1.2所得的電極放入無水乙醇中浸泡1-3分鐘，步驟1.4.將步驟1.3所得的電極在二次水中浸泡1-3分鐘，步驟2、將步驟1所得的電極浸入酶的水溶液中30～120分鐘，制備成二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器。
2.根據權利要求1所述的制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法，其特征是步驟2中酶溶液的濃度為2～4mg/L。
3.根據權利要求1所述的制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法，其特征是在步驟1.1之后，增加步驟1.1.1步驟1.1.1.將步驟1.1所得的電極浸入到質量百分濃度為10～15％的硅烷偶聯劑氨丙基三甲氧基硅烷或硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷水溶液中5-25分鐘，其余步驟同權利要求1。
全文摘要
一種制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法，它主要由下列步驟組成步驟1、制備TiO
文檔編號G01N27/327GK1472529SQ0313205
公開日2004年2月4日 申請日期2003年7月17日 優先權日2003年7月17日
發明者朱俊杰, 傅瑞玲, 徐錦忠, 陳洪淵 申請人:南京大學