專利名稱：新型導電聚合物、應用所述聚合物的傳感器和應用該傳感器檢測靶分子的方法
技術領域：
本發明涉及新型導電聚合物、含有用該導電聚合物涂布的電極的傳感器和應用該傳感器檢測靶分子的方法。
背景技術：
已經有許多研究開發基于電化學原理來檢測生物分子的傳感器。應用電化學原理的一個優點在于傳感器可以被微型化。因此，關于電化學傳感器(例如離子傳感器、氣體傳感器、生物傳感器等)的研究有許多優點。在基因學(genomics)和蛋白質學(proteomics)領域，關于監測其它生物分子之間的DNA的雜交是非常重要的，監測蛋白質的構象變化也是非常重要的。為此目的，已經開發出應用有機材料(例如具有電化學活性的intercalator)和應用導電聚合物的傳感器。具體說，由于進行廣泛研究的結果，基于intercalator的傳感器容易走向市場。
在導電聚合物傳感器中，只有少數代表性的單體能夠聚合到電極上，并且難以控制聚合物的物理性質。結果，這些研究進展緩慢。用于導電聚合物傳感器的代表性材料包括吡咯類、噻吩類和苯胺類等。然而，由于苯胺類僅僅在酸性條件下有效所造成的局限性，因此，吡咯類和噻吩類成為研究的主要焦點。
然而，吡咯類由于具有小的氧化還原電位而不能長期應用(參見美國專利US 6,201,086)。噻吩類具有較高的氧化還原電位，但疏水性比吡咯類強，因此不適合用于水中的生物分子分散系統(Bauerle P和Emge A.，Adv.Materi.，3324(1998))。
發明內容
本發明提供新型導電聚合物。
本發明還提供能夠聚合成所述導電聚合物的新單體化合物。
本發明還提供具有用所述導電聚合物涂布的電極。
本發明還提供含有該導電聚合物涂布的電極的傳感器。
本發明還提供應用傳感器檢測靶分子的方法。
本發明一方面提供具有下列通式(I)的導電聚合物 其中m為1、2或3；R為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基或五氟苯酚基；n為0或整數。
本發明的一種導電聚合物可以具有下列式(II)結構 其中m為1、2或3；R′為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基或五氟苯酚基、或探針(probe)基團，其中至少一個R′為探針基團；n為0或整數。
本發明另一方面提供用于合成屬于N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯或3-五氟苯酚基-3-噻吩基乙酸酯的任一上述本發明導電聚合物的單體。
本發明另一方面提供檢測靶分子的方法，包括(a)在底物上通過電聚合反應提供上述式(I)導電聚合物；(b)把探針固定于導電聚合物的表面；(c)接觸含有靶分子的樣品，以便與探針雜交，其中所述靶分子能夠特異性與探針反應；和(d)通過測定導電聚合物的電壓或電流變化檢測靶分子。
另一種檢測本發明靶分子的方法包括(a)在底物上通過電聚合反應提供上述式(II)導電聚合物；(b)接觸含有靶分子的樣品，以便與鍵合到所述導電聚合物的探針雜交，其中所述靶分子能夠特異性與探針反應；和(c)通過測定導電聚合物的電壓或電流變化檢測靶分子。
通過參照下列附圖詳細描述本發明實施方案，本發明的上述特征和優點以及其它特征和優點將變得更明顯。這些附圖簡述如下圖1舉例說明應用具有本發明導電聚合物涂層的電極的傳感器的實施方案。
圖2顯示應用本發明導電聚合物的傳感器的另一個實施方案。
圖3為說明應用本發明導電聚合物計時電位分析的聚合實例圖。
圖4為用計時電位分析聚合的本發明導電聚合物的掃描電子顯微鏡照片。
圖5為用計時電位分析聚合的本發明導電聚合物層的循環伏安圖。
圖6A為通過計時電位分析聚合的本發明導電聚合物層以三種不同掃描速率得到的循環伏安圖；圖6B為基于圖6A循環伏安圖得到的掃描速率對峰電流之間的相關圖。
圖7舉例說明固定探針DNA和互補靶DNA的雜交；
圖8為用本發明導電聚合物涂層的電極上兩點的循環伏安圖，一點用于固定于電極的探針DNA，另一點用于雜交至探針DNA的靶DNA。
圖9為靶DNA濃度和峰電流的關系曲線，其中從靶DNA的循環伏安圖測定得到的，所述靶DNA以不同濃度雜交至固定于被本發明導電聚合物涂層的電極上的探針DNA上。
圖10顯示在雜交至探針DNA后，完全配對靶DNA與單堿基錯配靶DNA之間峰電流的不同。
具體實施例方式
本發明的導電聚合物具有下式(I)結構 其中m為1、2或3；R為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基或五氟苯酚基；n為0或整數。
本發明另一種導電聚合物具有下列式(II)結構
其中m為1、2或3；R′為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基或五氟苯酚基、或探針基團，其中至少一個R′為探針基團；n為0或整數。
整個說明書中所用的術語“探針”意指能夠特異性結合到靶物質上的分子。這樣的探針的例子包括核酸和蛋白質，其中優選作為探針的物質為脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、抗體、抗原、酶、輔因子和底物。
本發明的導電聚合物可以用單體經循環伏安法、計時電位分析、計時電流法和lime聚合反應合成得到。本發明的導電聚合物具有高氧化還原電位。
本發明提供能夠通過聚合反應形成本發明導電聚合物的單體。這樣單體的優選實例包括下式(III)的N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯和下式(IV)的五氟苯酚基-3-噻吩基乙酸酯。
本發明提供涂有本發明導電聚合物的電極。所有通常用于形成電極的材料(例如鉑)均可用于本發明的電極。
本發明提供應用以本發明導電聚合物涂布的電極的傳感器。本發明的傳感器除了含有通常的傳感器組成元件外還包括具有本發明導電聚合物涂層的電極。本發明的傳感器可能包括常用的工作電極、反電極和參比電極。
圖1舉例說明應用具有本發明導電聚合物涂層的電極的傳感器的實施方案。根據圖1，本發明傳感器包括具有本發明導電聚合物6涂層的工作電極4、反電極12、參比電極14和用于測定電位的穩壓器2，其中聚合物6與探針8共價連接。
涂有導電聚合物6的工作電極4可以按照下列方法制備。首先，合成單體，即一種能夠結合至探針的含氨基的噻吩化合物，其中優選能夠進行電聚合反應的噻吩單體。把合成的單體在底物上進行聚合反應，與探針(例如DNA)連接，得到以本發明導電聚合物涂層并且與探針共價結合的本發明電極。或者，把探針共價結合到噻吩單體上后，含有探針8的噻吩單體可以在底物上進行聚合反應，從而得到具有本發明導電聚合物涂層并且與探針共價結合的本發明電極。通過上述方法制備的電極可以用作工作電極4。
可以應用上述本發明的傳感器檢測樣品中有關的靶分子10。當把含有靶分子10的樣品與固定于傳感器工作電極4的探針8接觸時，靶分子10雜交到探針8，如圖1所示，讀取雜交反應的電壓或電流變化，這樣可以鑒定樣品中的靶分子10。
從雜交中出現的電壓或電流變化被認為遵循下列原理(盡管并非絕對如此)。具有某特定還原氧化電位的電流依賴于底物上導電聚合物的離域作用。當靶分子雜交至共價結合于本發明導電聚合物的探針后，導電聚合物的離域度比雜交前要小。因此，當靶金屬雜交至探針時，電流降低。換句話說，當DNA探針與靶DNA雜交后形成雙鏈DNA時，電流變小。因此，可以通過測定當靶分子與探針雜交時氧化還原電位的降低或者測定在靶分子不與探針雜交時氧化還原電位的升高來檢測樣品中的靶分子。
圖2顯示應用本發明導電聚合物的傳感器的另一種實施方案。圖2的傳感器包括工作電極4、反電極12和參比電極14，其中工作電極4具有本發明的導電聚合物涂層。
本發明提供檢測靶分子的方法，包括(a)、在底物上通過電聚合反應提供一種導電聚合物，即一種聚噻吩類物質；(b)、把探針固定于導電聚合物的表面；(c)、接觸含有靶分子的樣品，以便與探針雜交，其中所述靶分子能夠特異性與探針反應；和(d)、通過測定導電聚合物的電壓或電流變化檢測靶分子。
本發明提供另一種檢測本發明靶分子的方法，包括(a)、在底物上通過電聚合反應提供一種與探針結合的導電聚合物，即一種聚噻吩物質；(b)、接觸含有靶分子的樣品，以便與鍵合到所述導電聚合物的探針雜交，其中所述靶分子能夠特異性與探針反應；和(c)、通過測定導電聚合物的電壓或電流變化檢測靶分子。
優選用金或鉑電極作為導電底物。所述探針的優選實例包括DNA、RNA、PNA、抗體、抗原、酶、底物和輔助因子。所述靶分子可以包括能夠特異性結合到探針的任一材料，優選核酸或蛋白質。
下面將參照下列實施例更詳細地描述本發明。下列實施例僅僅用于舉例說明，不能用于限制本發明地范圍。
實施例1N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯的合成按照下列方法合成用于制備本發明導電聚合物的單體的N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯。在N，N′-二環己基碳二亞胺(DCC)的存在下，讓1當量3-噻吩乙酸和1當量3-羥基鄰苯二甲酰亞胺在氯仿中在室溫下反應，如下列反應方案所示。用重結晶方法純化反應產物。經NMR確認得到的純化合物為上述式(III)結構的N-羥基鄰苯二甲酰亞氨基-3-噻吩基乙酸酯。
1HNMR(CDCl3)7.87(m，C6H4，4H)、7.31(m，C4H3SCH2，1H)、7.24(s，C4H3SCH2，1H)、7.11(m，C4H3SCH2，1H)、4.01(s，C4H3SCH2，2H)。 實施例23-噻吩基乙酸-3-五氟苯酚酯的合成按照下列方法合成用于制備本發明導電聚合物的單體的3-五氟苯酚-3-噻吩基乙酸酯。把1當量3-噻吩乙酸和1當量五氟苯酚在DCC存在下在氯仿中在室溫下進行反應。用硅膠柱色譜純化反應產物。經NMR確認得到的純化合物為上述式(IV)化合物3-五氟苯酚-3-噻吩基乙酸酯。
1HNMR(CDCl3)7.82(2H)、7.72(2H)、7.28(1H)、7.26(1H)、7.07(1H)、4.0(2H)。
實施例3、電極上的聚合反應把0.1M在實施例1中合成的上述式(III)所示的N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩乙酸酯溶解于作為摻雜劑的0.1M四丁基氨基六氟磷酸鹽(TBAHFP)在乙腈中的溶液中，應用計時電位分析在鉑電極上誘導單體的聚合反應，如圖3所示。具體地說，把鉑電極置于0.5毫米厚玻璃底物中，以0.4mA的電流誘導單體的聚合反應40秒，在鉑電極上均勻地形成導電聚合物層。
應用掃描電子顯微鏡觀察到聚(N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯)的導電聚合物層。其結果如圖4所示。
為了測定聚(N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯)的導電聚合物層的再現性，在乙腈/TBAHFP中鉑電極上施加電壓以恒定掃描速率測定循環伏安圖5次。結果如圖5所示。如圖5所示，本發明的聚(N-羥基鄰苯二甲酰亞胺基3-噻吩基乙酸酯)涂層在1.0V處具有一個幾乎可逆的氧化峰，從而證實了聚合物層的高電活性。顯然，電極上的聚合反應是能夠高度再現的。
為了測定聚(N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩基乙酸酯)涂層的導電性，在鉑電極上施加電壓以三種不同的掃描速率測定循環伏安圖。結果如圖6A所示。圖6B是掃描速率對峰電流的關系曲線，其是基于圖6A循環伏安圖獲得的。如圖6B所示，本發明聚合物涂層的峰電流與掃描速率呈正線性相關，從而表明聚合物層具有良好的導電性。
實施例4DNA探針固定及其與靶DNA雜交的證實1、DNA探針的固定把DNA探針固定于實施例3聚合的導電聚合物層上。把100μM在5′-末端具有氨基的探針DNA(5′-NH2-GTTCTTCTCATCATC-3′；序列號1)施加在導電層上，反應約12小時。通過用DNA探針的5′-末端氨基取代導電聚合物的羥基鄰苯二甲酰亞氨基使DNA探針固定。可以用賴氨酸殘基的氨基取代導電聚合物的羥基鄰苯二甲酰亞氨基使蛋白質探針固定。
2、與靶DNA的雜交把100μM互補靶DNA(5′-NH2-GATGATGAGAAGAAC-3′；序列號2)施加于單鏈DNA探針，其中該單鏈DNA探針固定于本發明的導電聚合物層，使其在40℃下進行雜交反應3小時。圖7顯示了互補靶DNA雜交至固定的探針DNA。作為對照組，在同樣條件下，把該單鏈DNA探針在沒有互補靶DNA存在下進行反應。在雜交反應后，應用循環電位滴定法測定峰電流，以確認雜交反應的進行。結果如圖8所示。
圖8是在具有本發明導電聚合物涂層的電極上兩點的循環伏安圖，一點是關于非雜交探針DNA(單鏈；ss)，另一點是關于用靶DNA雜交的探針DNA(雙鏈；ds)，測定的目的在于檢測是否發生雜交反應，如圖8所示，當DNA雜交(ds DNA)發生時，同樣電壓下的電流大大降低，這種導電聚合物的電流的降低被認為是由于雜交引起接枝的大官能團所致。
為了測定具有本發明導電聚合物涂層的電極的敏感性，在用不同濃度的互補靶DNA雜交探針DNA后，測定循環伏安圖。基于此循環伏安圖，計算出靶DNA濃度與峰電流之間的相關性。結果如圖9所示。
根據圖9中X＝0處的斜率計算出具有本發明導電聚合物涂層的電極的敏感性。電極的敏感度計算為0.62μA/nmole。該結果表明用具有本發明導電聚合物涂層的電極的傳感器可以檢測樣品中約1nmole限度的靶DNA。
實施例4靶DNA與單堿基錯配的雜交為了對探針DNA與完全配對的靶DNA和單個堿基錯配的靶DNA的雜交進行比較，當把DNA探針(5′-NH2-GTTCTTCTCATCATC-3′，序列號1)固定于以實施例3合成的導電聚合物涂層的電極上后，把不同序列的靶DNA雜交至電極的固定DNA，所用的靶DNA包括一種完全配對(“PM”)的DNA，即5′-GATGATGAGAAGAAC-3′(序列號2)，其與DNA探針完全配對；和兩種單個堿基錯配的DNA，即5′-GATGATGGGAAGAAC-3′(序列號3，“TG”)和5′-GATGATGCGAAGAAC-3′(序列號4，“TC”)，這兩種DNA在DNA探針序列上有一個不互補的堿基。從樣品的循環伏安圖上測定本發明電極檢測單個堿基錯配具有怎樣的敏感性和選擇性。作為對照組，測定非雜交DNA探針的循環伏安圖。根據循環伏安圖計算出各個樣品峰電流與對照組的比例即，lp(ds)/lp(ss)。結果如圖10所示。
如圖10所示，對于完全配對的靶DNA，其lp(ds)/lp(ss)比值為52％，對于單堿基錯配的TG，其lp(ds)/lp(ss)比值為29.3％，對于單堿基錯配的TC，其lp(ds)/lp(ss)比值為24.3％。與完全配對的靶DNA相比，單個堿基錯配的靶DNA的lp(ds)/lp(ss)比值要小得多。該結果表明具有本發明導電聚合物涂層的電極能夠準確地檢測出雜交至固定于導電聚合物上探針DNA的單堿基錯配DNA和完全配對靶DNA。
可以應用本發明的單體合成高導電聚合物。本發明的導電聚合物能夠有效地用于那些檢測雜交至探針的靶分子的傳感器。根據本發明，具有本發明導電聚合物涂層的電極的傳感器具有高的氧化還原電位，其能夠高敏感性地檢測出靶分子與探針的雜交。應用本發明的方法，能夠高度敏感性地快速檢測出靶分子。
上面已經通過實施例方案具體說明和記載了本發明，本領域技術人員應該理解在不偏離本申請權利要求書限定的范圍和精神內，可以在具體形式和細節方面作出各種變化。
序列表<110>三星電子株式會社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)<120>新型導電聚合物、應用所述聚合物的傳感器和應用該傳感器檢測靶分子的方法<130>SI004142<150>KR10-2002-0012729<151>2002-0309<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針DNA<400>1gttcttctca tcatc 15<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與探針DNA(SEQ ID No.1)完全互補的靶DNA<400>2gatgatgaga agaac15<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>除1個堿基外與探針DNA(SEQ ID No.1)互補的靶DNA<400>3gatgatggga agaac 15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>除1個堿基外與探針DNA(SEQ ID No.1)完全互補的靶DNA<400>4gatgatgcga agaac 1權利要求
1.一種下式(I)的導電聚合物 其中m為1、2或3；R為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基或五氟苯酚基；n為0或整數。
2.一種下式(II)的導電聚合物 其中m為1、2或3；R′為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基、五氟苯酚基或探針基團，其中至少有一個R′為探針基團，n為0或整數。
3.權利要求2的導電聚合物，其中探針基團為核酸或蛋白質。
4.權利要求3的導電聚合物，其中探針基團選自DNA、RNA、PNA、抗體、抗原、酶、底物和輔助因子。
5.N-羥基鄰苯二甲酰亞氨-3-噻吩乙酸酯或3-五氟苯酚-3-噻吩基乙酸酯。
6.一種涂有權利要求1或2的導電聚合物的電極。
7.一種應用涂有權利要求1或2的導電聚合物的電極的傳感器。
8.一種檢測靶分子的方法，包括(a)通過在底物上進行電聚合反應提供權利要求1的導電聚合物，(b)把探針固定于導電聚合物表面；(c)接觸含有靶分子的樣品，使之與探針雜交，其中所述樣品能與探針進行特異性反應，和(d)通過測定導電聚合物的電壓或電流變化檢測靶分子。
9.一種檢測靶分子的方法，包括(a)在底物上通過電聚合反應提供權利要求2的導電聚合物；(b)接觸含有靶分子的樣品，使之與鍵合到所述導電聚合物的探針雜交，其中所述靶分子能夠特異性與探針反應；和(c)通過測定導電聚合物的電壓或電流變化檢測靶分子。
10.權利要求8或9的方法，其中導電底物為金電極或鉑電極。
11.權利要求8或9的方法，其中探針選自DNA、RNA、PNA、抗體、抗原、酶、底物和輔助因子。
12.權利要求8或9的方法，其中靶分子為核酸或蛋白質。
全文摘要
本發明提供新型導電聚合物、應用導電聚合物的傳感器、檢測雜交至探針的靶分子的方法和所述敏感器的應用。所述導電聚合物具有下式結構其中m為1、2或3；R為羥基琥珀酰亞氨基、羥基鄰苯二甲酰亞氨基或五氟苯酚基；n為0或整數。
文檔編號G01N27/12GK1454908SQ0313078
公開日2003年11月12日 申請日期2003年3月9日 優先權日2002年3月9日
發明者車俊會, 崔英, 韓程任, 林根培 申請人:三星電子株式會社