專利名稱：Sars冠狀病毒相關多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及SARS冠狀病毒相關多肽及其應用。具體地，本發明使用人工合成的源自SARS病毒核衣殼蛋白(N蛋白)的多肽，以及該多肽免疫動物后產生的抗體(單抗、多抗)，結合酶聯免疫和其他方法檢測人血清樣品中的早期抗SARS抗體IgM或IgG，或直接檢測血清樣品中SARS病原體。
背景技術：
非典型肺炎即嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原體最近已經確認，是一種冠狀病毒。該病毒是一種正鏈RNA病毒，基因組為單鏈RNA，含有Poly(A)，總長接近30kb。病毒表面有約20nm左右的棒狀結構，呈皇冠狀。該病原體具有很強的感染性和傳染性，病毒在患者體內經過早期復制過程后，在肺部引發大規模炎癥反應，最終導致肺部組織損傷。由于臨床缺少有效的治療藥物，所以現階段將感染病人迅速隔離治療是最有效的防治手段。
目前已經發展并使用的診斷方法包括1.RT-PCR檢查病毒。能及時檢查帶毒者，當痊愈后，顯陰性。但受到儀器設備的限制，易產生較多的假陰性和假陽性而導致漏診或誤診。
2.通過臨床癥狀綜合評價診斷。這種方法在疾病的早期，因癥狀不明顯，而無法準確的診斷。在疾病的晚期，雖然可以準確診斷，但延誤了對疾病進行有效的治療。
3.血清免疫檢查病毒抗體(熒光免疫法或ELISA)。抗體產生需要在發病后至少14天，因此，這種方法不能做早期診斷。但是從免疫學角度來說，機體產生病原體特異性抗體IgM較早，選擇合適的抗原與之結合也可以用作診斷參考。
目前正在使用的大多數是前三方法，這些方法在臨床使用過程中，不能簡便、快速、準確的判斷與區分患者與疑似病例。
4.抗原檢測(ELISA)。通過制備病原體特異性的抗體(單抗與多抗)檢測病人血液或組織中病原體，該方法準確率高，操作簡便，適合臨床推廣。但目前缺少病原體的特異性抗體。
因此，本領域迫切需要開發新的更加有效的早期診斷SARS的方法和試劑盒。
發明內容
本發明目的就是提供一種快速、簡便、準確率高的SARS檢測方法和試劑盒。
在本發明的第一方面，提供一種源自SARS病毒的多肽，其氨基酸序列為SEQID NO1、2、或3。這些SARS特異性多肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結合。
在本發明的第二方面，提供了一種多肽偶聯物，所述的偶聯物由多肽、交聯劑、和BSA構成，其中所述的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1、2、或3，所述的交聯劑選自戊二醛或EDAC。
在本發明的第三方面，提供了一種抗體，所述抗體特異性地與本發明的SARS特異性多肽結合。
在一優選例中，所述的抗體是單克隆抗體。
在本發明的第四方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有本發明的SARS特異性多肽、多肽偶聯物、抗本發明多肽的抗體、或其組合。
在本發明的第五方面，提供了一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質接觸本發明的SARS特異性多肽、多肽偶聯物、抗本發明多肽的抗體、或其組合；(b)檢測是否形成抗原-抗體復合物，其中形成復合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
在一優選例中，所述的樣品為血清樣品或痰液。
在另一優選例中，所述的物質是氨基酸序列為SEQ ID NO1、2、或3的多肽。
在另一優選例中，所述的物質是單克隆抗體。
在另一優選例中，步驟(b)的檢測方法是熒光檢測法。
圖1顯示了在SARS病毒感染后，IgG和IgM抗體的產生情況。
圖2顯示了對SARS病毒S蛋白的結構分析。
圖3顯示了純化的重組N蛋白和GST對照蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜(12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。)。其中泳道1低分子量蛋白標準物；泳道2GST對照蛋白；泳道3純化后的重組N蛋白。
圖4先生了肽段誘導產生的抗體與SARS冠狀病毒N蛋白親和力檢測(Western印跡實驗)結果。其中，泳道1，3，5純化后的重組N蛋白；泳道2，4，6GST對照蛋白。泳道1，2以肽段N1免疫后兔血清為一抗；泳道3，4以肽段N2免疫后兔血清為一抗；泳道5，6以免疫前兔血清為一抗。蛋白經12％SDS-PAGE電泳后電轉移至PVDF膜。封閉后，加入相應的兔抗血清(1/1000稀釋)，以HRP標記的羊抗兔的IgG為二抗，ECL顯色。
具體實施例方式
本發明通過對SARS病毒潛在抗原蛋白的序列分析，找到了具有很強抗原性的氨基酸序列，通過合成多肽合成這些潛在抗原靶位，再由這些多肽免疫獲得的抗體，研制出一種通過檢測SARS病毒或抗SARS病毒抗體，進行臨床早期SARS診斷的酶聯免疫方法和試劑盒。本發明可顯著提高診斷效率，并且簡便、準確率高。
參見圖1。已有的研究表明病毒在人體內十天左右達到復制高峰，而SARS-IgM抗體在發病10～14天時出現并很快達到高峰，60天時約有1/3的患者仍可檢測到IgM抗體，大部分患者中該抗體基本消失。IgG抗體亦可在10-14天時檢測到，60天時達到高峰，90天時仍維持在高水平。所以采用抗體檢測病原體可以在病人感染后最短時間內作出有效診斷；采用IgM檢測可以在感染后一個星期左右作出診斷；而檢測病人體內IgG則最不理想。
為了獲得檢測SARS病毒所需的相關抗原與抗體，本發明人通過對SARS病毒基因組的分析與比對，結合最近與以往文獻資料，對SARS的潛在抗原蛋白進行分析。
通過與冠狀病毒的分析與比對，本發明人發現，冠狀病毒通過與細胞表面受體結合，隨即與細胞膜發生融合，病毒粒子進入細胞。病毒的生活周期完全在細胞質中進行，不需細胞核參與。SARS病毒本身編碼兩大類蛋白質，結構蛋白和非結構蛋白(a)結構蛋白主要包括結合在病毒膜表面的S(棒狀結構的主要構成成分)，M蛋白，以及與RNA結合構成螺旋狀核衣殼樣結構的N蛋白。
(b)非結構蛋白則是病毒RNA復制密切相關的聚合酶。
在病毒表達的眾多蛋白之中，S、M蛋白構成了病毒最外層的結構，S蛋白是一種十分重要的結構蛋白，眾多的冠狀病毒在這一部分差異很大，這可能和它針對不同的靶細胞有關。
參見圖2。S蛋白分為S1，S2兩部分，其中通過序列分析表明，S1區包括1-668；S2區669-1162。S1蛋白它主要與靶細胞受體結合有關；S2蛋白則介導病毒與細胞的融合。由于S蛋白對于病毒感染的重要性，因此很可能在其中篩選出能夠用于治療的中和性抗體；而且已知的冠狀病毒中和性抗體都是作用于S蛋白區。
因此，本發明選擇SARS的Spike蛋白(S蛋白)作為抗原靶位的主要研究對象，同時考慮到M，N蛋白也有潛在的抗原性，適當的選擇部分抗原決定表位，從臨床的角度來說，這些部位產生的抗體對于疾病的早期診斷可能有些意義。
確定靶蛋白后，本發明使用多種抗原性分析軟件和網站對蛋白完整序列，綜合考慮氨基酸序列的親水性(高親水性)和多級結構(多為α-螺旋，β-折疊)，優先考察那些存在于膜表面部分，剔除包含在膜內的部分，這樣從N蛋白序列中挑選了部分多肽序列(表1)。檢測到N蛋白就表明病毒處于復制期。
如本文所用，“本發明多肽”或“SARS特異性多肽”指氨基酸序列如表1所示的多肽。
本發明多肽可用常規方法人工合成，也可用重組方法生產。
本發明多肽可以直接用于檢測抗SARS的抗體，也可用于與BSA等分子量的蛋白偶聯，從而形成多肽偶聯物。通常，所述的偶聯物由多肽、交聯劑、和BSA構成，其中所述的交聯劑優選戊二醛(當與本發明多肽的N-端偶聯時)、EDAC(當與本發明多肽的C-端偶聯時)。
本發明的偶聯物可用于免疫兔、鼠等動物，從而獲得抗本發明多肽的抗體(“本發明抗體”)。本發明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于SARS病毒、基因產物或片段。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab′或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體、人源化抗體等。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的本發明多肽或偶聯物，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。對于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本發明的多肽、偶聯物和抗體都可用檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體，從而作為早期檢測SARS的有效指標之一。
除了用于檢測，本發明的SARS特異性多肽還可在體內與病毒競爭受體，阻止病毒與膜融合，抑制病毒感染正常細胞。此外，本發明的多肽和偶聯物還可用于制備治療性的藥物組合物或預防性的疫苗組合物。
因此，另一方面，本發明還提供了一種組合物，它含有(a)安全有效量的本發明多肽、偶聯物或其組合物；以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。本發明的組合物可通過常規方法進行制備。以本發明多肽計，其用量例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
本發明的主要優點在于(a)因為本發明的SARS特異性多肽、多肽偶聯物與抗SARS病毒抗體的親和力高，本發明抗體與SARS病毒的親和力高，因此，本發明的檢測方法靈敏、簡便、準確率高。
(b)本發明的SARS特異性多肽還可在體內與病毒競爭受體，阻止病毒與膜融合，抑制病毒感染正常細胞，所以本發明具有很高的臨床應用價值。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1多肽的人工合成按表1所示的氨基酸序列，在多肽合成儀上用合成多肽。合成后經質譜法驗證，證明合成的多肽與設計相符。
表1本發明多肽的氨基酸序列
實施例2抗原多肽的與載體的連接(偶聯物的制備)對于實施例1合成的各多肽，先用PBS溶解(對某些不溶的多肽，可以先用半量PBS溶解，若不溶則用1M NaOH調節PH使之全溶)，取0.5ml多肽(濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml)與15mg BSA(1.5ml)混勻，然后加入交聯劑(針對交聯方向的不同，選擇不同的交聯劑，N-端交聯加入戊二醛，C-端加入EDAC)，混合后于室溫反應5小時，避光不斷搖晃；交聯結束后，放入透析袋中，對PBS 4℃透析過夜；量體積，以BSA計算濃度，于-20℃保存備用。
實施例3抗原多肽免疫動物制備抗體取實施例2制備的偶聯物約0.5ml(偶聯物含量分別為0.1mg、0.5mg)，加入PBS 1.5ml后與CFA(完全弗氏佐劑)混合，在三通管中反復推打，直至感覺費力，放置3-5分鐘后，無兩相分離即可。
將經過佐劑乳化處理的抗原免疫兔子和小鼠；每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠則注射0.8ml/只。分別皮下注射動物兩足墊、頸部、背部多點注射(每點0.2ml)。
初次免疫三周后，取同樣劑量多肽抗原、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐劑)，乳化后對動物進行加強免疫，注射劑量不變。
三周后對動物取血，收集抗血清。使用BSA包被的層析柱，清除針對BSA的抗體。
挑選抗體滴度較高的抗原多肽，制備單克隆抗體。
實施例4檢測應用(1)抗原多肽檢測病人血清樣品使用經過處理的實施例1制備的抗原多肽包被，與病人血清混合反應，結果本發明的抗原肽段可以識別病人血清中早期針對SARS的特異性抗體，并與之結合，洗滌后加入HRP酶連二抗反應；最后加入顯色底物，進行檢測。
結果表明，本發明的多肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結合。
(2)抗體(單抗與多抗)檢測病原體對于實施例3獲得的獲得的抗體(多抗和單抗)，用ELISA法與病人血清反應，檢測病人組織液、血液中的病毒結合，對病原體進行檢測。
結果表明，本發明的多抗和單抗可特異性地與SARS病毒結合。
實施例5免疫印跡實驗在本實施例中，所用抗體分別為免疫前血清，N1-抗血清、N2-抗血清和N3-抗血清(免疫兔后的血清中抗體，未純化)。
免疫印跡實驗流程如下1.SDS-PAGE樣品SARS病毒感染的細胞裂解液上樣量100ul上層膠3.5％，下層膠7％，上層膠100V 1小時，下層膠200V 15小時2.轉膜電流1.0mA/cm2，2小時3.封閉5％脫脂奶粉封閉6小時4.雜交一抗，1∶100稀釋在TBS-Tween中，4度雜交過夜二抗(goat-anti-rabbit-HRP，購自Santa Cruze公司)1∶4000稀釋，雜交1小時顯色ECL-Plus(購自Amersham公司)結果表明，抗N1、N2和N3抗體特異性地與SARS病毒的N蛋白結合。
實施例6酶聯免疫吸附實驗(ELISA)用BSA-N1、BSA-N2交聯產物包被96孔板，4℃過夜。封閉液(3％Gelatin，0.1％吐溫20溶于PBS)封閉后，加入倍比稀釋的免疫后兔血清，37℃孵育2小時，洗滌后加入HRP標記的羊抗兔的IgG，37℃孵育1小時，充分洗滌后加入底物顯色并測定450nm處光吸收值。采集9例臨床診斷SARS病人及4例正常人血清，以病毒裂解液為抗原通過ELISA和免疫熒光分析的方法確定其IgG陽性。抗血清對合成的肽段(N1、N2)的反應性通過ELISA方法檢測。大致過程同上。血清稀釋度為1∶10，HRP標記的羊抗人的IgG作為二抗。所有用到病人血清的實驗均在三級生物安全實驗室操作。
結果如表2表2 ELISA法測定肽段N1、N2免疫后兔血清中抗體滴度
實施例7肽段N1能與SARS病人血清中的IgG結合既然肽段N1是SARS冠狀病毒N蛋白的一個很好的表位，那么它能否與SARS病人血清中的IgG結合呢？為了回答這個問題，在本實施例中，采集9例臨床診斷SARS病人及4例正常人血清，用肽段N1、N2作為抗原進行篩選。
結果發現33％SARS病人對肽段N1呈陽性反應而所有血清對肽段N2呈陰性反應。同時，4例正常人血清對兩者都呈陰性(表3)。
表3 ELISA法測定SARS病人及正常人血清中針對肽段N1、N2特異性的抗體檢測
血清稀釋度1∶10+陽性 -陰性實施例8SARS冠狀病毒N蛋白原核表達及純化在本實施例中，將SARS冠狀病毒N蛋白的全長基因克隆(Genbank 登錄號NC_004718)至原核表達載體pQE30中(Qiagen公司)的多克隆位點。將重組質粒轉化大腸桿菌M15誘導表達蛋白。挑單克隆在相應的抗性培養液中培養過夜后，以1∶10比例接種至相同抗性的培養液中振蕩培養至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L誘導表達蛋白。重組的N蛋白按照操作手冊經Ni-NTA親和層析純化后，SDS-PAGE檢測。
Western 印跡純化后的N蛋白經12％ SDS-PAGE電泳后電轉移至PVDF膜。用封閉液(3％Gelatin)封閉后，加入免疫后兔抗血清(1/1000稀釋)，37℃孵育1小時，洗滌后加入HRP標記的羊抗兔的IgG(H+L)，37℃孵育1小時，充分洗滌后ECL顯色。
結果肽段N1誘導產生的抗體對原核表達的SARS冠狀病毒N蛋白有較高親和力為了驗證肽段N1、N2誘導產生的抗體是否能與SARS冠狀病毒N蛋白結合，本實施例中用原核系統表達了全長的N蛋白(422氨基酸)，通過Western印跡的方法來驗證其親和力的強弱。純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳，結果顯示在47kD處有一條清晰的蛋白條帶(圖3)。
Western印跡結果(圖4)顯示肽段N1免疫后兔血清對原核表達的SARS冠狀病毒N蛋白有較高親和力，而N2較弱。而對照GST(無關蛋白)及正常兔血清均無反應。這些數據再次表明肽段N1是SARS冠狀病毒N蛋白的一個很好的表位且其誘導產生的抗體能夠與表達的N蛋白結合。
討論本發明首次證明了SARS冠狀病毒N蛋白的表位(如N1等)有助于進一步研究N蛋白的功能。
首先，通過計算機軟件分析從SARS冠狀病毒N蛋白中選出兩個肽段N1、N2。理論上，基于其抗原性指數兩者均有較好的抗原性。從免疫后兔抗血清中抗體的滴度分析來看，兩者類似。
其次，本發明合成的肽段是否能夠模擬天然狀態的N蛋白是肽段應用的一個關鍵。實驗結果顯示肽段N1誘導產生的抗體對原核表達的SARS冠狀病毒N蛋白有較高親和力，提示肽段N1是SARS冠狀病毒N蛋白的一個很好的表位。而且肽段N1誘導產生的抗體將有助于對N蛋白的研究。另外，僅用合成的肽段可以誘導產生高滴度的抗體且此抗體能與天然狀態的蛋白結合。
為了進一步證實兩個肽段誘導產生的抗體與表達蛋白的結合是否真實的反映了它們在體內的免疫原性的異同，本發明人通過ELISA的方法來檢測了兩種肽段與SARS病人血清的反應性。結果表明肽段N1是一個能在SARS病人體內誘導產生抗體的很好的抗原表位。盡管只有33％的病人呈陽性，但是可以解釋的。因為用完整的N蛋白作為抗原來檢測也只有40％的臨床診斷SARS病人呈陽性。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>SARS冠狀病毒相關多肽及其應用<130>033332<150>CN 03128831.6<151>2003-05-26<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)<400>1Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala1 5 10 15Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln20<210>2<211>23<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)<400>2Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn1 5 10 15Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu20
<210>3<211>24<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)<400>3Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala1 5 10 15Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys20
權利要求
1.一種多肽，其特征在于，其氨基酸序列為SEQ ID NO1、2、或3。
2.一種多肽偶聯物，其特征在于，所述的偶聯物由多肽、交聯劑、和BSA構成，其中所述的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1、2、或3，所述的交聯劑選自戊二醛或EDAC。
3.一種抗體，其特征在于，所述的抗體特異性地與權利要求1所述的多肽結合。
4.如權利要求3所述的抗體，其特征在于，所述的抗體是單克隆抗體。
5.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有權利要求1所述的多肽、權利要求2所述的多肽偶聯物、權利要求3所述的抗體、或其組合。
6.一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，其特征在于，包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質接觸權利要求1所述的多肽、權利要求2所述的多肽偶聯物、權利要求3所述的抗體、或其組合；(b)檢測是否形成抗原-抗體復合物，其中形成復合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的樣品為血清或痰液。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物質是氨基酸序列為SEQID NO1、2、或3的多肽。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物質是權利要求3所述的抗體，且所述抗體是單克隆抗體。
10.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(b)的檢測方法是熒光檢測法。
全文摘要
本發明涉及SARS冠狀病毒相關多肽及其應用。具體地，本發明使用人工合成的源自SARS病毒N蛋白的多肽作為抗原，以及該多肽免疫動物后產生的抗體(單抗、多抗)，結合酶聯免疫和其他方法檢測人血清樣品中的早期抗SARS抗體IgM或IgG，或直接檢測血清樣品中SARS病原體。
文檔編號G01N33/569GK1572798SQ03129289
公開日2005年2月2日 申請日期2003年6月13日 優先權日2003年5月26日
發明者孫兵, 吳家睿, 裴鋼, 李亦學, 石鐵流, 楊瑞馥, 何有裕, 施木德, 呂偉, 季永鏞 申請人:中國科學院上海生命科學研究院