專利名稱：一種診斷非典型性肺炎試劑盒的制備方法
技術領域：
本發明涉及診斷非典型性肺炎的試劑盒領域，尤其涉及一種SARS冠狀病毒S蛋白或其部分多肽和前兩者的免疫血清的診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法。
背景技術：
我國稱為非典型肺炎的嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)已經在全世界100多個國家和地區發生。據世界衛生組織13日在瑞士日內瓦公布的全球最新薩斯(非典)疫情報告說，截止6月13日國際標準時間17點整，全球共有薩斯病人和部分疑似病人8454例，其中死亡792例，痊愈6793例。這3個數字分別比前一天的統計數據增加了10例、2例和125例。有疫情的國家和地區的數目仍然是32個。其中中國大陸有病人和疑似病人5327例，343人死亡；中國香港1755例，293人死亡；中國澳門1例；中國臺灣693例，81人死亡；新加坡206例，31人死亡；加拿大242例，32人死亡；越南63例，5人死亡；泰國9例，馬來西亞5例，菲律賓14例，這3個國家的死亡病例都為2人；南非1例，1人死亡。
由于在感染到發病之間存在著長達十天左右的潛伏期，快速大范圍的篩選出已經感染而尚無臨床癥狀的帶病原體者以及疑似病例的確切診斷現得十分重要首先在普通人群中篩選出已經感染而尚無臨床癥狀的帶病原體者，可以阻止非典型肺炎傳給健康人，避免更大范圍的感染；其次，對疑似病例的確切診斷可以區分真正感染者和非感染者，使感染者能夠得到及時而全面的治療，而對未感染者能夠解除隔離，避免國家和個人在時間和經濟上的損失。由此可見對非典型肺炎的早期和準確診斷具有十分重大的意義。但是目前市面上大量使用的非典型肺炎診斷試劑盒不能在非典型肺炎的發病早期對其進行診斷，而且準確率非常低，約為40％，往往病人已經有了明顯的臨床癥狀后，仍然不能用檢測試劑盒檢測出來。目前的非典型肺炎診斷試劑盒的缺陷是由其設計的原理所造成的它是以病毒顆粒或通過基因工程表達的蛋白質作為包被物，檢測人血清中的特異性抗體來判斷。該原理的缺陷在于1.直接將引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒進行包被可能會造成檢測人員感染上非典型肺炎；2.人血清中的特異性抗體的產生必須是在被引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒后的一到兩周后才能產生，而被感染一到兩周后病人已經表現出明顯的臨床癥狀，這使得使用該種原理制成的非典型肺炎診斷試劑盒失去了意義；3.有相當多的非典型肺炎病人在被引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒并未產生對應的特異性抗體，這使得使用該種原理制成的非典型肺炎診斷試劑盒完全不能鑒別出非典型肺炎患者。
發明內容
本發明的目的在于提供一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，制備簡便，方法易行，早期診斷，準確診斷，該試劑盒可檢測全血中引非典型肺炎傳染病的SARS冠狀病毒顆粒及其抗原。
為了實現上述任務，本發明采用以下技術措施本發明涉及SARS冠狀病毒S蛋白和其部分多肽以及免疫哺乳動物所制得的單克隆抗體或多克隆抗體，涉及含有用于所述目的的基因疫苗中的SARS冠狀病毒S蛋白的全長或部分基因片段，涉及以SARS冠狀病毒S蛋白和其部分多肽以及免疫哺乳動物所制得的單克隆抗體或多克隆抗體為材料制成非典型肺炎診斷試劑盒的制備方法。本發明中，構建了若干重組質粒，以便包括編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列。
編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列見序列表，本發明涉及SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列包括序列表所示的完整序列(見表1)和其片段(見表2)。
本發明的實施步驟為1.以基因合成方法或RT-PCR從病人血清擴增的方法得到編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段；2.將1所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段克隆到原核表達載體上；3.將2所得到的帶有編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的重組原核表達載體，通過轉化的方法轉入到大腸桿菌中，并進行誘導表達；4.將3所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白通過蛋白質純化的方法如硫酸氨法或親和層析法得到提純的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白；5.將4所得到的蛋白以單獨形式或與佐劑混合的方式免疫哺乳動物，如小鼠，兔，馬，牛，豬等；
6.收集5所免疫的哺乳動物的血清；7.將6所得到的血清，參照Harlow等人描述的ELISA方法包被到以塑料為材料的96孔板上；并用牛奶或牛血清白蛋白封閉處理。
8.將5所得到的血清，參照Harlow等人描述的ELISA方法標記上同底物反應后能顯色的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，或者標記上熒光基團。
9.將7所得到的包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板和經過8所標記的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體及其現色底物和反應終止液，組成非典型肺炎診斷試劑盒。
本發明所得到的非典型肺炎診斷試劑盒的各組分1.包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板。
2.標記有顯色的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體溶液。
3.20％雙氧水。
4.四氯萘酚本發明所得到的非典型肺炎診斷試劑盒的使用方法如下1.取待測者全血150微升，加入到包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板中，溫育30分鐘；2.棄加入的待測者全血，用200微升PBS或PBST洗滌五次，并拍干；3.加入標記上同底物反應后能顯色的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，或者標記上熒光基團的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體，溫育30分鐘；4.棄3所加入的液體，用200微升PBS或PBST洗滌五次，并拍干；5.如3所加入的是標記上同底物反應后能顯色的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，則加入其對應底物，現色15分鐘；用硫酸終止反應；6.測量反應后反應孔的吸光值或熒光強度。如果測量值大于2.1倍陰性對照值，則本次測量結果為陽性，待測者為非典型肺炎患者；如果測量值小于2.1倍陰性對照值，則本次測量結果為陰性，待測者為不是非典型肺炎患者。
與上述現有原理制備非典型肺炎診斷試劑盒相比，本發明使用另一策略來制備非典型肺炎診斷試劑盒，即以引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗體為包被物，檢測人全血中的引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原。一旦引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒入侵人體，就會在機體中存在著引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原，這包含著兩層含義1.可以早期診斷，只要引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒入侵人體，使用本發明所涉及的非典型肺炎診斷試劑盒就能檢測出來；2.可以準確診斷，機體中是否存在著引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原與病人是否患有非典型肺炎存在著必然的聯系a.使用本發明所涉及的非典型肺炎診斷試劑盒檢測出引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原，則該被檢測者必然患有非典型肺炎；b.使用本發明所涉及的非典型肺炎診斷試劑盒不能檢測出引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原，則該被檢測者必然沒有患非典型肺炎。
SARS冠狀病毒S蛋白是介導SARS冠狀病毒識別宿主細胞以及入侵過程中的膜融合過程的關鍵蛋白，與SARS冠狀病毒入侵人體的致病過程密切相關。SARS冠狀病毒S蛋白位于病毒囊膜表面，在病毒入侵時介導病毒與宿主細胞膜表面受體的相互作用，并留在細胞表面，成為受病毒感染細胞的表面標志。因此SARS冠狀病毒S蛋白存在SARS冠狀病毒囊膜表面和受病毒感染細胞的表面，這成為機體是否被感染的重要的判斷標準。
圖1為一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法原理圖。
具體實施例方式
1.構建含SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列的真核表達載體合成SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列，然后通過PCR法以引物對5’ggggaattcgacatggaatcacttacaacaacatcaactgc 3’5’cccggatcctactaagcttgctcctgggatggcacatacg 3’為引物，合成SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列為模板，擴增得到兩端分別加上EcoRI和HindIII限制性酶切位點的在該段核苷酸序列的兩端分別加上EcoRI和HindIII限制性酶切位點的SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列。PCR反應總體積為50μl，反應條件為94℃預變性3分鐘；PCR循環參數94℃60秒，48℃30秒，72℃20秒，最后一次循環在72℃延伸7分鐘。
然后用限制性內切酶EcoRI和HindIII將該PCR產物和真核表達載體pET28a進行雙酶切，使兩者兩端成為粘端。其后于16℃在T4 DNA連接酶的作用下將兩個片段連接起來，連接產物轉化處于感受態的大腸桿菌DH5α。從轉化平皿上挑取單菌落，接種于5mL含100μg/mL Amp的LB液體培養基培養過夜。次日按Sambrook等人描述的小量堿法提取質粒[Sambrook J，et al，1989]。用限制性內切酶EcoRI作酶切鑒定，選出含有片段較大的重組質粒，然后用限制性內切酶EcoRI和HindIII作酶切鑒定，挑出其中能切出SARS S2的重組質粒。按照前述給片段兩端加上EcoRI和HindII]位點的PCR方法進行PCR，對含有SARS S2片段的重組質粒進一步鑒定，將能夠擴增出SARS S2的重組質粒定名為pET-S2。
2.接種BL21(DE3)/pET-S2于5mL含100μg/mLAmp的LB液體培養基，在37℃下250rpm振蕩培養過夜，次日將過夜培養物全部轉種于50mL含100μg/mLAmp的LB液體培養基中，振蕩培養至OD600＝1.0，加入10％乳糖使其終濃度為1％，在37℃下繼續培養5小時后，收集菌體，按5mL/g(濕重)重懸于含1mmol/LEDTA，0.5mmol/L PMSF的PBS(pH8.0)。超聲破菌后，4000rpm離心10分鐘，除去菌體殘渣。上清在4℃下，12000rpm離心15分鐘。上清和沉淀分別上樣進行12％的SDS-PAGE電泳檢測。
3.將表達帶6-His標記的S2蛋白的大腸桿菌離心收集菌體，置冰上15分鐘。以每克菌體2-5ml裂解緩沖液的比例重懸菌體于裂解緩沖液中。加溶菌酶置終濃度1mg/ml，置于冰上30分鐘。在冰上用超聲波破碎菌體。4℃4000g離心10分鐘以去處細胞碎片，保留上清于-20℃。
往4ml大腸桿菌裂解液中加入1ml 50％Ni-NTA漿液，4℃緩慢搖動。將上述混合液倒入底部有蓋子的柱子中。去掉柱子底部的蓋子讓混合液流出。用4ml洗雜液洗柱兩次。用0.5ml洗脫液洗脫四次。
4.將提純后蛋白S2經SDS-PAGE分離，切下目的帶后，在無菌的瓷研缽中破碎使之能夠通過4.5號注射器針頭。取五只昆明系小鼠，按照每只小鼠每次50微克蛋白質的用量皮下免疫小鼠。每兩星期加強免疫一次，第二次加強免疫一周后采血。
最后一次免疫后采用小鼠眼眶取血法采全血。采血前小鼠應禁食6小時。血樣收集在無菌的離心管中，放于37℃30～60分鐘使之凝聚。用無菌的槍頭將凝塊與管壁分離，4℃放置過夜。次日從離心管中吸出血清，4℃下離心(1000g，10分鐘)去除不溶物。
5.以戊二醛法將4所得到的抗體標記上辣根過氧化物酶。
6.參照Harlow等人描述的ELISA方法將4所得到的血清用包被緩沖液稀釋至1ng/μL，往酶標板每孔加入200μL，4℃包被過夜。次日，洗滌液洗滌一次，用封閉液于37℃封閉2小時。洗滌液洗滌，共重復5次，倒置于37℃烘干。
7.將5和6所得到的產品與四氯萘酚和雙氧水組成非典型肺炎診斷試劑盒按照前述本非典型肺炎診斷試劑盒的使用雙盲法檢測83例血清，準確率為96.39％，其中陽性符合率為97.62％；陰性符合率為95.12％，遠遠高于目前市面上所用的產品。
SEQUENCE LISTING表1 SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因序列表<110>武漢大學<120>一種診斷非典型性肺炎試劑盒的制備方法<130>一種診斷非典型性肺炎試劑盒的制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3768<212>DNA<213>SARS coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(3768)<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg 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of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(411)<400>1gaatcactta caacaacatc aactgcattg ggcaagctgc aagacgttgt taaccagaat 60gctcaagcat taaacacact tgttaaacaa cttagctcta attttggtgc aatttcaagt120gtgctaaatg atatcctttc gcgacttgat aaagtcgagg cggaggtaca aattgacagg180ttaattacag gcagacttca aagccttcaa acctatgtaa cacaacaact aatcagggct240gctgaaatca gggcttctgc taatcttgct gctactaaaa tgtctgagtg tgttcttgga300caatcaaaaa gagttgactt ttgtggaaag ggctaccacc ttatgtcctt cccacaagca360gccccgcatg gtgttgtctt cctacatgtc acgtatgtgc catcccagga g 41權利要求
1.一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，包括下列步驟A、以基因合成方法或RT-PCR方法得到編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段；B、將A所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段克隆到原核表達載體上；C、將B所得到的帶有編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的重組原核表達載體，通過轉化的方法轉入到大腸桿菌中，并進行誘導表達；D、將C所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白通過蛋白質純化的方法得到提純的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白；E、將D所得到的蛋白以單獨形式或與佐劑混合的方式免疫哺乳動物；F、收集E所免疫的哺乳動物的血清；G、將F所得到的血清，按Harlow描述的ELISA方法包被到以塑料為材料的96孔板上，并用牛奶或牛血清白蛋白封閉處理；H、將E所得到的血清，按Harlow描述的ELISA方法標記上同底物反應后能顯色的酶；I、將G所得到的包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板和經過H所標記的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體及其現色底物和反應終止液，組成非典型肺炎診斷試劑盒。
2.根據權利要求1所述的一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，其特征在于SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列是atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt2760acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat3360gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat3420catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768
全文摘要
本發明公開了一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，其步驟是提供一種早期診斷非典型性肺炎的診斷試劑盒，為早期診斷患有由SARS冠狀病毒所引起的非典型性肺炎傳染病的病人提供了一種快速，準確的診斷試劑盒。該診斷試劑盒由包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板和標記有顯色的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體溶液。以及顯色液所組成。該診斷試劑盒可檢測全血中引起非典型性肺炎傳染病的SARS冠狀病毒顆粒及其抗原。
文檔編號G01N33/563GK1482461SQ0312825
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月1日 優先權日2003年7月1日
發明者葉凱, 丁虹, 葉 凱 申請人:武漢大學