用于檢測或者測定病毒的方法

專利名稱：用于檢測或者測定病毒的方法
技術領域：
本發明涉及檢測或者測定病毒的方法及所用的試劑。
背景技術：
當前，已經利用各種病毒檢測方法來檢測傳染性病毒在血液或者血制品中的存在，并用來確定病毒在患病患者中的存在。然而，盡管敏感性和特異性隨所要檢測的病毒類型而變化，但這些方法并非總是高度敏感或者特異性的。即使當它們具有足夠的敏感性和特異性時，它們也經常是昂貴的，并且如在病毒的培養與分離中需要冗長的過程。作為本發明的背景，C型肝炎(丙型肝炎)將在下面得到詳盡的陳述。
丙型肝炎病毒的病原體長期是未知的，但是，當病毒基因得到克隆(科學，244359-362，1989)，以及經由利用基于所說的基因產生的重組抗原的抗體測定的診斷方法得到發展(科學，244362-364，1989；日本專利出版物(Kohyo)，2(1990)-500880)時，人們發現丙型肝炎是病原體為丙型肝炎病毒(HCV)的傳染病，該病毒通過血液和血制品作為其主要傳染途徑傳播。隨著所謂的第二代抗體檢驗方法(其中的重組核心抗原和重組NS3抗原已得到增加)的產生，現在已有可能通過檢驗他們的血清來事實上確定所有HCV的患者。這已使得在日本根除幾乎所有通過獻血傳播的HCV感染成為可能。
然而，至于其它普通的病毒感染，如通過人免疫缺損病毒(HIV)的病毒感染，在感染之后有一定的時間長度直到抗體出現，或者所謂的窗口時期，其中病毒不可由現有的檢驗方法所檢測。這意味著，在賣血是合法的區域或者在日本的一些地區，第二次感染的風險仍然存在，因為血液傳播的組分不能為抗體檢驗方法所確定。抗體檢驗方法也有弊端，即它不能區別已從感染恢復的人和處于感染活動階段的人，這是由于其檢驗原理所致。
當前，干擾素(IFN)用于丙型肝炎的治療。然而，一些研究者強調，通過僅僅測量HCV的抗體滴度就可以評價治療效果，因為在HCV為IFN消除之后第6個月滴度降低。然而，由于僅僅在抗原刺激降低之后或者在抗原消除之后的幾個月，抗體滴度才開始降低，因此不可能在所需的時間與以所需的準確度，單獨地由抗體檢驗方法確定IFN的施用是否導致HCV的消除。因此，微為了監測治療，除檢測HCV抗體外還需要檢測HCV本身。
困難的是建立直接檢測HCV病毒微粒(病毒抗原)的方法，因為與其它病毒如肝炎B病毒(HBV)相比，該病毒的血液水平非常低，還因為該病毒不能體外傳播或者利用動物等作為宿主。因此，代之以檢測病毒抗原，檢測病毒基因組RNA的方法得到發展，如聚合酶鏈式反應(PCR)方法(科學，2301350-1354，1985)以及支鏈DNA探針方法。但是，與檢測病毒抗原的方法相比，檢測病毒基因組的方法存在幾個問題。
首先，有人已指出，由于所要檢測的物質是在存儲期間極不穩定的RNA，血清的凍結和解凍過程可以造成測量值的降低。因此，所要檢驗的血清樣品必須比當它們用于其它測定方法時更小心地得到存儲。在樣品的運輸過程中也必須給以最大限度的小心。
雖然包含利用PCR方法的檢驗方法對檢測基因片段是最敏感的，但是它們存在一定的問題，即從基因組RNA到模板DNA的逆轉錄經常伴隨著損失，因此這要求好的技巧以便獲得精確的定量值，并且由于擴增是該方法的重要原理，在污染的情況下可能產生高發生率的假陽性，因此同時進行大量樣品的處理是不可能的。再者，即使這些方法(假定其為簡單方法)利用2個或2個多小時來預處理樣品，但是將由于需要離心等等的重復過程而變得復雜化。此外，如此復雜的過程污染的可能性增加，并由此獲得假陽性的結果。另一方面，支鏈DNA探針方法在檢測敏感性方面是低的，此外在獲得檢驗結果之前要花費大約20小時(Igaku toYakugaku[醫學和藥學]31961-970，1994)，因而該方法在敏感性和處理時間方面有待作許多所需的改進。
為了解決上述與病毒基因組檢測方法有關的問題，人們發展了包括直接檢測病毒抗原在內的方法。正如日本未審專利出版物(Kokai)第8號(1996)-29427所顯示的，人們發展了這樣一種方法，即利用核心抗原特異性的單克隆抗體檢測血清中的HCV的核心抗原。正如有關文獻(Tahaka等，肝臟病學雜志23742-745，1995；Fujino等，Igaku to Yakugaku[醫學和藥學]361065-1070，1996)所報道的，檢測血清中的核心抗原的方法如同上述的檢測病毒基因組的方法一樣，已經顯示出有臨床用途。然而，如同檢測病毒基因組的方法一樣，檢測血清中的核心抗原的方法仍然存在幾個需要解決的主要問題。
這樣的問題之一即，與PCR方法相比，檢測病毒基因組的方法的敏感性低，以致它不能用作為血清篩選的最后檢驗方法。Tanaka等(Journalof Hepatology，23742-745，1995)指出其檢測限制為104-105拷貝/ml的HCV RNA。Fujino等(Igaku to Yakugaku[醫學和藥學]361065-1070，1996)報道，對102例已由最敏感的CRT(競爭性逆轉錄)-PCR檢測方法檢測出為RNA陽性的、接受慢性丙型肝炎治療之前的患者血清的檢測顯示，該方法的陽性率為67％。也就是說，就敏感性來說，該方法遠落后于最敏感的CRT-PCR方法。
其次，當該方法用于篩選時，處理測量樣品的復雜過程以及所需的長時間使問題出現。因此，該方法需要多步樣品(血清)處理過程，這些過程包括濃縮病毒微粒和除去血清組分的聚乙烯乙二醇處理(4℃，1小時)；離心(15分鐘)；除去上清液；尿素處理；堿處理(37℃，30分鐘)；加入中和劑等等。此外，利用尿素的分散方法，由于PEG處理而使粘度有所增加的沉淀要求極大的技巧。因此，為了獲得再現性結果，要求極大的技巧，此外，最小為2小時的處理是必需的。此外，諸如離心、上清液除去等方法不適于自動化處理，并且很難同時進行大量樣品的處理。因此，從處理的難易性方面來看，該方法也不適于需要處理大量樣品的應用(如在篩選檢驗中)。
另一方面，在下列幾點上，病毒抗原檢測系統優于高度敏感的PCR方法。由此，它極為耐受污染，因為它在檢測步驟中不包括任何額外擴增過程。此外，因為意在檢測相對穩定的抗原蛋白質而不是很不穩定的RNA，所以樣品存儲過程中不需要給以任何額外關照，它不需要諸如PCR檢測樣品所需的深度冷藏箱之類的特殊設備，并且樣品的運輸也更容易。
這些特性使該方法適于應用于其中需要進行大量樣品測定的檢測中，如在血液工業或者健康檢查檢驗中。然而，正如以上所指出的，由于檢測核心抗原的公開方法不適于自動化，并且其敏感性低，以致它不能在要求高敏感性的應用(如在血液工業中)中作為金標準(goldstandard)，因此，它不能運用于處理大量樣品(如篩選)的檢驗，并且不能最好地利用其優于PCR方法的有利特性。此外，臨床上有用的測定方法常常必須面對敏感性、特異性、再現性、易于處理以及低成本的挑戰，并且需要不斷努力以盡可能地滿足這些挑戰。就不同于HCV的病毒抗原的檢測而論，尤其是用于處理大量樣品的篩選中的病毒抗原檢測，有許多由于它們的低敏感性(與PCR方法相比)或者所需抗原未能充分暴露而未投入實際應用的方法。
發明的說明本發明的目的是提供用于檢測各種病毒抗原的方法，包括用于檢測HCV抗原的方法，該方法適于處理大量樣品，如在血液工業與健康檢查中的篩選。換句話說，本發明的目的是提供用于檢測各種病毒抗原的檢測系統，包括與那些PCR方法具有同等敏感性和特異性的HCV抗原檢測方法，該系統允許進行簡單的預處理，或者無需預處理就可以容易地自動化。下文將主要參照HCV來說明本發明的優選實施方案。
按照本發明的第一實施方案(1)，本發明提供了檢測或者測定HCV的方法，該方法包含破壞病毒微粒，充分暴露病毒抗原，破壞抗病毒抗原的抗體(如果存在的話)，以及檢測或者測定病毒抗原。
因此，本發明提供了(I)用于處理包含病毒的樣品的方法，其特征在于用包含下列組分的處理溶液處理包含病毒的樣品(1)陰離子型表面活性劑和(2)兼性表面活性劑、非離子型表面活性劑或者蛋白質變性劑。
本發明也提供了(II)用于處理包含病毒的樣品的方法，其特征在于用包含下列組分的處理溶液處理包含病毒的樣品(1)陰離子型表面活性劑，(2)兼性表面活性劑，和(3)非離子型表面活性劑或者蛋白質變性劑。
本發明也提供了(III)用于處理包含病毒的樣品的方法，其特征在于用包含下列組分的處理溶液處理包含病毒的樣品(1)陰離子型表面活性劑，(2)兼性表面活性劑，(3)非離子型表面活性劑，和(4)蛋白質變性劑。
本發明也提供了(IV)用于檢測或者定量病毒抗原的存在的病毒測定方法，其特征在于利用按照(I)至(III)之任一的方法處理的樣品，以及使樣品與特異性識別病毒抗原的探針反應。
本發明也提供了用于確定病毒在樣品中存在或者不存在的試劑盒、測定試劑盒或者診斷試劑，其用于上述(IV)的免疫測定方法，并包含陰離子型表面活性劑。
本發明也提供了用于確定病毒在樣品中的存在或者不存在的試劑盒、測定試劑盒或者診斷試劑，其用于上述(IV)的免疫測定方法，并包含下文描述的單克隆抗體。
按照本發明的第一實施方案(2)，本發明提供了檢測或者測定病毒的方法，該方法包含破壞病毒微粒，充分暴露病毒抗原，破壞抗病毒抗原的抗體(如果存在的話)，以及檢測或者測定病毒抗原。
因此，本發明提供了(V)用于處理包含病毒的樣品的方法，其特征在于用包含下列組分的處理溶液處理包含病毒的樣品(1)離液序列高的離子和(2)酸化劑。
本發明還提供了(VI)用于處理包含病毒的樣品的方法，其特征在于用包含下列組分的處理溶液處理包含病毒的樣品(1)離液序列高的離子，(2)酸化劑和(3)非離子型表面活性劑。
本發明還提供了(VII)用于檢測或者定量病毒抗原的存在的病毒測定方法，其特征在于利用按照上述(V)和(VI)處理方法，并使樣品與特異性地識別病毒抗原的探針反應。
本發明還提供了用于測定病毒在樣品中的存在或者不存在的試劑盒、測定試劑盒或者診斷試劑，其用于上述(VII)方法中并包含離液序列高的試劑。
本發明還提供了用于測定HCV在樣品中的存在或者不存在的試劑盒、測定試劑盒或者診斷試劑，其用于上述(VII)方法中，并包含由雜交瘤HC11-14(FERM BP-6006)、HC11-10(FERM BP-6004)或HC11-11(FERM-BP-6005)產生的單克隆抗體。
按照本發明的第二實施方案，本發明提供了在窗口期間(其中抗上述病毒的抗體還沒有產生)檢測或者測定病毒抗原的方法。在這一方法中，暴露病毒抗原的病毒微粒的破壞是足夠的，并且不需要破壞抗血液中的病毒抗原的抗體。
因此，本發明提供了病毒測定方法，其特征在于在具有10個或多個碳原子的烷基以及仲銨、叔銨或季銨的表面活性劑或者具有12-14的親水/親脂平衡值(HLB)的非離子型表面活性劑存在或者二者都存在的條件下，基于它與探針的結合來測量病毒抗原。
本發明還提供了雜交瘤細胞系，該細胞系選自由HC11-11(FERM-BP-6005)、HC11-14(FERM BP-6006)、HC11-10(FERM BP-6004)、HC11-3(FERM-BP-6002)以及HC11-7(FERM-BP-6003)組成的組中。
本發明也提供了由雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體，該細胞系選自由HC11-11(FERM BP-6005)、HC11-14(FERM BP-6006)、HC11-10(FERMBP-6004)、HC11-3(FERM BP-6002)以及HC11-7(FERM BP-6003)組成的組中。
此外，作為RNA病毒的HCV以及作為DNA病毒的HBV，都是形成病毒顆粒的病毒，所說顆粒具有包含被囊化基因組RNA或DNA的結構蛋白和圍繞它的膜蛋白或脂質膜的結構。在任何實施方案中，通過利用本發明的處理方法，本發明提供了病毒的檢測或者測定方法，該方法的特點是不僅破壞HCV或HBV的病毒微粒，而且也破壞具有類似結構的病毒的病毒微粒，充分暴露病毒抗原，以及檢測或者測定所說的抗原。
附圖簡要描述

圖1顯示的是所加入的SDS的濃度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者(正常)的血清和HCV-RNA-陽性組血清13以及50。
圖2顯示的是所加入的CHAMPS的濃度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者(正常)的血清和HCV-RNA-陽性組血清13以及50。
圖3顯示的是所加入的尿素的濃度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者(正常)的血清和HCV-RNA-陽性組血清13、44以及50。
圖4顯示的是所加入的Triton X100的溫度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者(正常)的血清和HCV-RNA-陽性組血清13、44以及50。
圖5是顯示樣品處理期間的溫度的作用圖。使用了得自正常健康人受試者(正常)的血清和HCV-RNA-陽性組血清13、44以及50。
圖6是顯示夾心免疫測定系統的稀釋標準曲線和檢測限的圖，其中對標準組血清50(定義為1U/ml)進行系列稀釋，并對其實施樣品處理方法，然后利用本發明的單克隆抗體測量之。
圖7是顯示夾心免疫測定系統的標準曲線和檢測限的圖，其中對標準組血清50(定義為1U/ml)進行系列稀釋，并對其實施樣品處理方法，然后測量之。
圖8顯示所獲得組分中的核心抗原的免疫活性，該組分由血清組13的凝膠過濾柱分級分離獲得，其中該血清組已為樣品處理方法處理過。IgG和白蛋白的分子量分別為大約150kD和大約68kD。
圖9是顯示所釋放的核心抗原的活性與利用PCR-陽性樣品的Amplicore HCV監測器(PCR方法)測定的HCV-RNA數量之間的相互關系的圖，其中該樣品已用本發明的樣品處理方法處理過。
圖10是顯示所加入的氯化胍的濃度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者的血清(正常)和HCV-RNA-陽性組血清13和50。
圖11是顯示所加入的Triton X100的濃度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者的血清(正常)和HCV-RNA-陽性組血清13和50。
圖12是顯示所加入的Tween 20的濃度對樣品處理的影響圖。使用了得自正常健康人受試者的血清(正常)和HCV-RNA-陽性組血清13和50。
圖13是顯示樣品處理期間的溫度的影響的圖。使用了得自正常健康人受試者的血清(正常)和HCV-RNA-陽性組血清13和50。
圖14是顯示夾心免疫測定系統標準曲線和的檢測限的圖，其中對標準組血清50(定義為1U/ml)進行系列稀釋，并對其實施樣品處理方法，然后測量之。
圖15顯示所獲得組分中的核心抗原的免疫活性，該組分由利用血清組13的凝膠過濾柱分級分離獲得，其中該血清已為樣品處理方法處理過。IgG和白蛋白的分子量分別為大約150kD和大約68kD。
圖16是顯示所釋放的核心抗原的活性與利用PCR-陽性樣品的Amplicore HCV監測器(PCR方法)測定的HCV-RNA數量之間的相互關系的圖，其中該樣品已用本發明的樣品處理方法處理過，并已為Amplicore HCV監測器(PCR方法)檢驗為陽性。
圖17顯示按照本發明通過測定重組乙型肝炎病毒(HBY)核心抗原而獲得的標準曲線。
優選實施方案的詳盡描述本發明的目標病毒是形成病毒微粒的病毒，所說的顆粒具有包含被囊化基因組RNA或DNA的結構蛋白和圍繞它的膜蛋白或脂質膜的結構。
具有基因組RNA的上述病毒的代表性例子包括丙型肝炎病毒(HCV)和與HCV有關的病毒。
與HCV有關的病毒包括丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、G型肝炎病毒、手-足-口病病毒、黃病病毒(黃熱病病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒)、披膜病毒(α-病毒、風疹病毒屬病毒、動脈炎病毒、風疹病毒)、瘟病毒屬(豬霍亂病毒、牛腹瀉病毒)、副粘病病毒(副流感病毒1、2、3、4，犬溫病病毒，新城病病毒，RS病毒，牛瘟病毒，猿副流感病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒)、正粘病毒(人流感病毒、鳥流感病毒、馬流感病毒、豬流感病毒)、彈狀病毒(狂犬病病毒、水泡性口炎病毒)、小RNA病毒(脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、歐可病毒、牛腸道病毒、豬腸道病毒、猿腸道病毒、小鼠腦炎病毒、人鼻病毒、牛鼻病毒、馬鼻病毒、足及口病病毒、甲型肝炎病毒)、冠狀病毒(人冠狀病毒、鳥傳染性支氣管炎病毒、小鼠肝炎病毒、豬可傳遞胃腸炎病毒)、沙粒病毒(淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、拉薩病毒、朝鮮出血熱病毒)、逆轉錄病毒(HTLV成年人白血病病毒，HIV獲得性免疫缺損綜合癥病毒、貓白血病肉瘤病毒、牛白血病病毒、魯斯氏肉瘤病毒)、呼腸病毒(輪狀病毒)、杯狀病毒(諾沃克病毒)、布尼病毒(腎部綜合征出血熱病毒)、葉病毒(埃博拉病毒)、馬堡病毒等等。
上述具有基因組DNA的病毒的代表性例子包括乙型肝炎病毒HBV和與HBV有關的病毒。與HBV有關的病毒包括痘病毒(痘苗病毒、類天花病毒、牛痘病毒、天花病毒)、小DNA病毒(人小DNA病毒、豬小DNA病毒、牛小DNA病毒、狗小DNA病毒、貓白細胞減少癥病毒、阿留中貂病病毒)、乳多空病毒(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)、腺病毒、皰疹病毒(單純性皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘性帶狀皰疹病毒、EB病毒、馬皰疹病毒、貓皰疹病毒、馬萊克氏病病毒)、非洲豬霍亂病毒等等。
除上述病毒外，還有許多已知的致病病毒和許多現存的未知病毒。很明顯，如果這樣的病毒具有上述結構，即被囊化基因組RNA或DNA的包含結構蛋白和圍繞它的膜蛋白或者脂質膜，那么可以利用本發明的樣品處理方法以適于免疫測定的形式將它們釋放出來。
下面參照HCV，說明用于實現本發明的實施方案。由于HCV的血液水平為102-106拷貝/ml，該水平低于HBV的血液水平(109拷貝/ml)，因此要求檢測病毒抗原的測定法具有很高的敏感性。
一般地，在由利用抗體作為探針的免疫學方法代表的檢測方法中，提高檢測敏感性的可能方法包括I)增加所要檢測的抗原分子的數量，II)增加與抗原結合的探針(如抗體)的分子數量，III)減少限制檢測敏感性的非特異性反應，該敏感性限制由探針(如抗體)與不同于抗原的其它物質的結合所致，以及IV)增加用于檢測的標記的檢測限，并且這些方法的適當結合將能夠使敏感性增加。
作為增加抗原分子數量的方法之一，I-1)樣品量的增加是最容易構想的。但是，由于所加入的、用于反應系統中的最大總量(如96-孔免疫平板)不能超過大約300μl，I-1)，因此增加所要加入至反應系統中的分子數量的濃縮方法得到應用。
為了增加探針的數量，例如與抗原結合的抗體分子的數量，最容易構想的方法包括II-1)增加利用若干探針例如抗體識別的抗原決定簇數量，例II-2)通過增加探針(例如抗體)與抗原的親和性(親和性和親合力)增加每單位時間內結合的抗體數量。偶然地，用以提高例如，抗體親和性的可能的方法包括改變反應系統中的緩沖液的組成的方法，改變探針的方法，以及這些相結合的方法。II-3)還構想這樣的方法，其中通過把大量抗體結合到有一個寬的表面區域的載體(例如珠粒，磁性的微粒等)上俘獲許多抗原，來擴大有限量的抗原的反應面積。
在傳染病的情況下，預期有結合到抗原上的高親和性的人類抗體存在于樣品中。因此，可以預期這些抗體的抗原決定簇與用于檢測的探針(如抗體)重疊，這將導致用于檢測的抗體的數量上減少的競爭性反應。因此，可以預測樣品中這些干擾抗體的減少將導致用于檢測的結合到抗原上的抗體分子數量上的增加(II-3)。
籠統講減少非特異性反應的方法確實困難，但是可以構想減少非特異性反應的策略III-1)通過改變緩沖液的組成增加探針(例如抗體)與抗原的親和性(親和性和親合力)減少非特異性反應，III-2)除去非特異性反應的病原體等。
提高檢測敏感性的可能的方法包括IV-1)使用有高的檢測敏感性的標記(放射性同位素等)；IV-2)通過使用酶或者催化劑作為標記來擴增信號；IV-3)把酶底物變成有更高的敏感性的物質；IV-4)通過電學或力學手段來擴增酶促反應或者化學反應的信號；IV-5)增加每個抗體標記的數量；IV-6)提高用于信號檢測的儀器的敏感性等。
在公開的用于檢測HCV核心抗原的方法中對預處理步驟的分析揭示這種方法包含了通過向樣品中加入聚乙二醇然后離心獲得HCV沉淀(I-2)，并且同時除去一部分血清組分(II-2)的抗原濃縮步驟，其后為重懸沉淀在包含尿素和堿試劑的溶液中以滅活其中的人抗體，借此從HCV釋放核心的抗原(II-3)的步驟，以及加入包含非離子型表面活性劑(TritonX100)和中和試劑以準備與單克隆抗體進行反應的溶液的步驟。
如上所述，沉淀的離心和重懸是程序上復雜的步驟，并且要求高的技巧。這樣，本發明的一個目的是解決有關上述程序問題的核心抗原檢測系統。
HCV本身的性質目前還沒有被闡明。但是，基于基因組的結構，與病毒微粒相關的結構，以及關于病毒的一般信息，估計HCV顆粒有被包裝在核心抗原之內的基因組RNA，其依次包被在包含E1和E2/NS1抗原的外被蛋白內，所說抗原錨定在上述包被周圍的脂質膜上。
因此，為了檢測核心抗原必須除去包被物從而允許對探針的結合，所說的探針例如用于所說的核心抗原的檢測的抗體。此外，據報道，血液中的病毒微粒呈現復雜的結構，其中顆粒被LDL(低密度脂蛋白)包圍等等，并且，由于對抗外被蛋白質的抗體也存在，估計病毒微粒可以作為帶有抗包被蛋白質抗體的免疫復合物存在。這樣，為了增加要檢測的抗原分子的數量，有效地從病毒微粒除去圍繞病毒微粒的包被和污染物并且有效地釋放核心抗原分子是重要的。
對于不同于HCV的病毒情況也如此，病毒的結構蛋白質必須有效地被釋放。
這樣，本發明涉及一種處理的方法，這種處理方法能將樣品(血清)中的病毒抗原變成一種適合于用探針檢測的狀態，且這種處理方法不用通過一個復雜的過程諸如離心濃縮抗原。
此外，如上所述，由于人抗體可以以與探針(如抗體)競爭結合的高滴度存在，因此除去所說的抗體的過程對于提高敏感性是重要的。
這樣，本發明的一個方面涉及一種處理方法，這種處理方法在樣品中容易釋放病毒抗原，同時滅活在樣品中可能存在的人體抗體。
通過利用本發明的處理方法，樣品中的病毒抗原以適合于與探針(如抗體)形成免疫復合物的形式從病毒微粒或者免疫復合物中釋放，并且同時滅活樣品中干擾檢測反應的人抗體，一種高度敏感的檢測可以由利用探針(諸如抗體)的免疫測定容易達到。
按照本發明的第一實施方案(1)，用于檢測的探針(諸如抗體)可以是任何探針，只要它與病毒抗原以特異性的形式結合，它有一定的高親和性，同時當把它加入反應系統中時不引起非特異性反應。例如，象在實施例4中所描述的在HCV核心抗原的檢測中，用于主要反應的探針之一優選地含有可以識別和結合HCV核心抗原的C端的探針。這里所用的核心抗原的C端是指在SEQ ID No2中顯示的81至160的序列或者它的一部分。它還可以含有HCV核心抗原的N端的探針。這里所用的核心抗原的N端是指在SEQ ID No2中顯示的10至70的序列或者它的一部分。
按照本發明的第一實施方案(2)，用于檢測的探針(諸如抗體)可以是任何探針，只要它與病毒抗原以特異性的形式結合，它有一定的高親和性，同時當把它加入反應系統中時不引起非特異性反應。例如，在HCV核心抗原的檢測中，用于主要反應的探針之一優選地含有可以識別和結合HCV核心抗原的N端的探針。這里所用的核心抗原的N端是指在SEQ IDNo2中顯示的10至70的序列或者它的一部分。它還可以含有HCV核心抗原的C端的探針。這里所用的核心抗原的C端是指在SEQ ID No2中顯示的81至160的序列或者它的一部分。
在上述任何實施方案中，對核心抗原有高特異性和親和性的任何分子可以用作探針，包括通過使實驗動物(例如小鼠，兔，小雞，山羊，綿羊，牛，等等)免疫所獲得的單克隆抗體，由骨髓瘤細胞與脾細胞的融合獲得的雜交瘤產生的單克隆抗體，這些細胞是從免疫個體分離的，由脾細胞或者由EB病毒無限增殖化的血液中的白細胞產生的單克隆抗體，及以HCV感染的人或者黑猩猩產生的抗體；由重組抗體基因轉化的細胞產生的重組抗體，這種重組抗體基因由組合從小鼠、人等的免疫球蛋白的cDNA或者染色體DNA獲得的可變區基因片段，通過把免疫球蛋白的cDNA或者染色體DNA的一部分與一種人工所構建的序列相結合所構建的可變區基因片段，利用人工基因序列所構建的可變區基因片段，或者利用上述作為構件通過基因重組技術構建的可變區基因片段，與免疫球蛋白恒定區的基因片段所產生；由上述可變區的基因片段與結構蛋白(例如噬菌體的)融合產生的噬菌體抗體，重組體抗體基因(通過上述可變區域的基因片段與另一合適的基因片段(例如myc基因)組合產生)轉化的細胞產生重組抗體，通過把一個可變區人工引入胰蛋白酶基因產生的探針，通過人工改變特異地結合到蛋白質(例如受體)的分子獲得的探針，通過組合化學技術等構建的探針。
本發明進一步提供了利用處理溶液處理樣品的步驟，這種處理溶液能夠從病毒顆粒或者免疫復合物中釋放病毒抗原，同時能夠滅活樣品中干擾檢測反應的抗體(即使是人抗體)以產生一種適合于從包含病毒抗原的樣品中形成上述病毒抗原和它的探針(如抗體)的免疫復合物的狀態，提供了通過利用探針(如抗體)進行免疫測定的檢測與定量釋放的核心抗原的測定方法和測定試劑盒。
本發明提供的樣品處理溶液和樣品處理方法這里所用的樣品包括生物學液體如全血，血漿，血清，尿，唾液，腦脊液，肝組織等。
按照本發明，最重要的需要是病毒抗原(例如樣品中核心抗原)的處理方法，以便不需要經過樣品的復雜的加工產生一種適合于與探針(例如單克隆抗體)結合反應的狀態。這樣，為了增加抗原分子的數量，有效地釋放病毒抗原(如在病毒顆粒中所包含的核心抗原)是重要的。
正如就十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)已知的，大多數蛋白質在SDS的存在的情況下通過熱處理會變性，同時除了共價鍵分子結合的那些分子會轉變成為單體。這樣，加入包含陰離子型表面活性劑(如SDS)這樣的處理劑，造成病毒的破裂及對抗樣品中病毒抗原(如核心抗原)的抗體的變性，使能夠釋放樣品中病毒抗原(如核心抗原)。對HCV核心抗原來說，正如在實施例7中顯示的那樣，這一點也已經被確認，即，當在HCV感染的樣品中的核心抗原用包含SDS的處理劑處理，利用凝膠過濾進行分子量分析時，在理論上被預料為單體的位置檢測它。
據Kashiwakuma等人在免疫學方法雜志19079-89，1996上的報道，當對利用SDS-PAGE從包含細胞表達重組HCV的抽提物的樣品分離的核心抗原通過Western印跡分析進行檢測時，在被認為是單體的位置檢測到了免疫學活性。對于本領域技術人員來說，在樣品中加入包含SDS變性劑會造成抗原的有效的釋放和抗原分子在數量上的增加，這一點容易理解。
然而，眾所周知，陰離子型表面活性劑(如SDS)有一種很強的蛋白質變性作用，因此當在與抗體形成免疫復合物的反應中加入它們時，它們也使抗體變性并且因此破壞其功能，從而導致在敏感性上的降低。我們也知道，通過陰離子型表面活性劑處理的抗原決定簇的結構的破壞造成與抗體結合鍵的削弱與敏感性的降低。為了除去造成在敏感性上降低的因素，SDS處理的變性作用需要用某種方法或其它方式來削弱。
我們知道，包含陰離子型表面活性劑的表面活性劑可以通過以下手段除去，透析，超濾，凝膠過濾，電泳，離子交換，沉淀，膜轉換，等等。如上所述，抗原可以用Western印跡法或者凝膠過濾法檢測的事實表明在SDS處理后利用一個特定的過程可以完成抗原-抗體反應。然而，這些方法需要時間和復雜的過程，這不適合于本發明的目的。
通過用過量的反應溶液稀釋，將變性作用減少到可以忽略的水平，在這種水平下不影響反應，這一點確實可能，但是這種方法不能運用于包括利用微量孔(如免疫測定)的方法，因為在其中要加入樣品的量會受到限制。很明顯，在這一點上這些方法不適合于本發明的目的。
這樣，本發明的發明人在本發明的第一實施方案中曾研究了，包含陰離子型表面活性劑與一些添加劑的處理劑的加入是否能將陰離子型表面活性劑的變性作用降低到一種探針(如抗體)不受影響的水平，并且，同時提高陰離子型表面活性劑對核心抗原釋放的作用。
本發明的發明人已經發現包含除了陰離子型表面活性劑(如SDS)之外的表面活性劑的處理劑可以削弱SDS對固定化抗體的變性作用，并且，結果是與加入只包含SDS的處理劑相比，可以提高敏感性。發明人還發現，當能削弱氫離子鍵的試劑(例如除了SDS和尿素外的表面活性劑)，加入到包含陰離子型表面活性劑(如SDS)的處理劑中時，觀察到了類似的作用，并且樣品中病毒顆粒上核心抗原的釋放和抗核心抗原的抗體的滅活得到提高，結果是核心抗原的釋放進一步被提高。發明人還發現在加入包含SDS和其它表面活性劑的處理劑后通過熱處理能使核心抗原的檢測具有更高的敏感性，并且已經完成了本發明。
可以用于處理樣品的非SDS陰離子表面活性劑包括十六烷基硫酸鈉或者其它烷基硫酸酯，烷基磺酸鹽如十二烷基磺酸鈉，烷基烯丙基磺酸鹽等。可以添加的非陰離子表面活性劑的表面活性劑包括兩性表面活性劑，例如CHAPS(3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]-1-丙烷磺酸鹽，CHAPSO(3-[膽酰氨基丙基(二甲基銨)]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽，十二烷基-N-甜菜堿，3-(十二烷基二甲基銨)-1-丙烷磺酸鹽；非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯異辛基苯基醚(如Triton X100)，聚氧乙烯壬基苯基醚(如NP40)，聚氧乙烯山梨醇酯(如吐溫80)，聚氧乙烯十二烷基醚(如Brij 58)，以及辛基葡糖苷，兩性表面活性劑(如CHAPS)和非離子型表面活性劑(如Triton X100)是優選的。加入破壞蛋白質高級結構的試劑(蛋白質變性劑)如尿素、硫脲等是有利的。
優選地用于處理的濃度對于SDS是0.5％或者更大；對于CHAPS是0.1％或者更大；對于尿素是1M或者更大；對于Triton X100是0.1％或者更大和0.75％或者更小。
用于處理樣品的溫度可以是實驗室常用的任何溫度，即在4℃和100℃之間，但是，當加入非離子型表面活性劑應該注意它的濁點。優選地，應用37℃或者更高的溫度，常用于血清滅活的50-60℃用于處理是更有效的。
血紅蛋白的干擾的除去當血清等用作樣品進行測量時，所說的樣品中的血紅細胞在上述預處理期間經歷溶血作用且血紅蛋白被釋放，同時變性血紅蛋白能通過結合到病毒抗原(如HCV核心)上干擾測量。這樣，在本發明的第一實施方案中，優選的是通過俘獲在血紅蛋白中的血紅素除去干擾。作為這一目的的添加劑，我們已經發現優選的是加入尿素和包含咪唑環的化合物中至少一種。
作為含咪唑環的化合物，可提到咪唑，組氨酸，咪唑丙烯酸，咪唑羧基乙醛，咪唑羧酰胺，咪唑二酮，咪唑二硫代羧酸，咪唑二羧酸，咪唑甲醇，咪唑啉硫酮，咪唑啉酮，組胺，咪唑并吡啶等。
作為含吲哚環的化合物，可提到色氨酸，吲哚丙烯酸，吲哚，吲哚乙酸，吲哚乙酰肼，吲哚乙酸甲酯，吲哚丁酸，吲哚乙腈，吲哚原醇，吲哚羧基乙醛，吲哚羧酸，吲哚乙醇，吲哚乳酸，吲哚甲醇，吲哚丙酸，吲哚丙酮酸，吲哚甲基酮，吲哚毒素，吲哚丙酮，吲哚美辛，吲哚洛芬，吲哚胺等。
優選地，加入的量對于尿素是0.5M-5M，對于吲哚丙烯酸是5mM-50mM，對于其它的添加劑是0.05M-0.5M。
另一方面，如HCV外被蛋白質的膜蛋白不會自發溶解，除非它們被處理到最后。為了使有疏水部分的蛋白質溶解在水中，眾所周知的方法是把疏水部分通過表面活性劑轉化成為親水部分。然而，我們知道，某些鹽如氯化胍具有將難溶性蛋白質變成水溶性的屬性。具有上述屬性的鹽(離液序列高的試劑)所產生的離子稱為離液序列高的離子，已知的有陰離子，胍離子，硫氰酸鹽離子，碘離子，高碘酸鹽離子，高氯酸鹽離子等。產生這些離子的鹽已經被用于難溶性蛋白質的增溶作用。有人預計離液序列高的離子具有使抗原從病毒顆粒有效地釋放的功能。
然而，當加入離液序列高的離子時，蛋白質的二級結構被破壞，造成對表位結構的破壞。這樣，在離液序列高的離子存在的情況下，當探針(如抗體)加入形成免疫復合物的反應中時，與抗體的結合將削弱，敏感性將降低，這被認為是一個嚴重的問題。
另一方面，離液序列高的離子的變性作用通常可逆，因此通過透析或者稀釋降低離子強度使變性結構臨時回到原來的結構。這就出現了另一個與處理劑(如離液序列高的離子)的利用相關的問題。即，按照本發明所需的處理方法，不僅存在于樣品中的病毒顆粒有效地被釋放，而且結合到存在于樣品中的抗原上的高親和性抗體必須同時被滅活。這樣，離液序列高的離子的增溶作用并不能對存在于樣品中的高親和性抗體提供充分的滅活，并且，人們相信，抗體相反的會影響敏感性。
這樣，使用離液序列高的離子的處理方法有兩個沖突的問題在離液序列高的離子能破壞其結構的條件下，抗原抗體反應被抑制，并且另一方面單獨的離液序列高的離子的影響不足以滅活在樣品中干擾反應的抗體，且在抗原抗體反應不被抑制的條件下，污染的抗體可以抑制反應。
為了解決這些沖突的問題，有必要找到一種條件，在這種條件下抗原的抗原決定簇被破壞是可逆的，同時在樣品中污染抗體的功能被破壞是不可逆的。
就抗體被滅活的條件而言，已知的處理方法有堿處理，酸處理等。血清的酸處理可以造成假陽性的結果，因為這種處理不可逆地使一部分血清蛋白變性，導致在大多數情況下樣品處理后因阻礙移液管吸收而形成沉淀，且被變性蛋白質吞沒的沉淀在測量時被吸附到固相上，因此可以以一種密度來檢測。此外，出現了另一個問題，因為，目的抗原非特異性地被沉淀吞沒，與探針進行反應的抗原的數量減少從而導致敏感性的降低。
本發明的發明人已經發現胍處理與酸處理結合可以解決與酸處理有關的問題(例如沉淀的形成)及與胍處理相關的沖突問題，同時由此完成了本發明。我們還發現向包含離液序列高的離子的處理劑(如胍和酸化劑)中加入表面活性劑是進一步優選的。作為酸化劑，優選的是鹽酸，硫酸，乙酸，三氟乙酸，三氯乙酸等。
作為表面活性劑，優選的是兩性表面活性劑(如例如CHAPS(3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]-1-丙烷磺酸鹽，CHAPSO(3-[膽酰氨基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽，十二烷基-N-甜菜堿，3-(十二烷基二甲基銨)-1-丙烷磺酸鹽等，及非離子型表面活性劑，(例如聚氧乙烯異辛基苯基醚，如Triton X100；聚氧乙烯壬基苯基醚如NP40；聚氧乙烯山梨醇酯，如Tween20，聚氧乙烯十二烷基醚，如Brij58，辛基葡糖苷等。另外，通過削弱氫離子鍵部分破壞蛋白質的高級結構的試劑(如尿素)可以加入其中。
尤其是，更優選的是在4-45℃下以2M或者更高濃度利用鹽酸胍，以2％或者更高濃度利用Triton X100，以0.02％或者更高濃度利用Tween20。
在任何實施方案中，很明顯，通過利用本發明的處理方法，病毒抗原可以用探針的形式，從包含有類似于HCV或者HBV的結構的病毒顆粒的樣品釋放，即適合于利用抗體作為探針的所謂的免疫測定的狀態。本文所使用的有類似于HCV或者HBV的結構的病毒是形成病毒顆粒的病毒，所說的顆粒具有由蛋白質組成的結構，其中基因組RNA或者DNA已被包裝并且膜蛋白或者脂質膜圍繞著它。這種病毒包括，例如，與HCV有關的黃病病毒，反錄病毒如人類免疫缺損病毒(HIV)等。此外，象HBV一樣，那些有作為基因組的DNA的病毒，當它們有類似的結構時，也被包括在內。
病毒抗原的暴露按照涉及在窗口時期所收集的樣品中檢測病毒抗原的方法的本發明的第二實施方案，病毒抗原的抗體還沒有形成，因此為暴露病毒抗原的病毒顆粒的破裂就足夠，沒必要破壞存在于樣品中的抗體。這樣，以上所描述的樣品的預處理就不必要了，同時破裂病毒顆粒的試劑的存在對于暴露病毒顆粒已足夠。尤其是，破裂病毒顆粒的試劑對存在于病毒顆粒中的病毒抗原來說是必需的。
人們相信，一般的病毒顆粒有一種結構，其中作為基因組的核酸和核心抗原形成一種復合物，這種復合物形成一種微粒，所說的微粒被包含脂質膜和包膜蛋白質的外被所包被。人們還相信，在血液中它們以具有低密度脂蛋白，病毒的抗體等的復合物的形式出現。這樣，探針不能識別或者結合病毒抗原，特別是病毒顆粒中的抗原。因此，為了檢測病毒抗原，它們必須被處理，通過例如，除去這些圍繞病毒顆粒的結構以便使探針能識別病毒顆粒。
這樣，本發明還提供了一種反應條件(在這種反應條件下，為了使探針能識別病毒顆粒，暴露在樣品中所包含的病毒顆粒中的病毒抗原以便使探針能識別)，和反應的方法(包括完成反應的系統，以及完成反應的系統的試劑)。
本發明提供的適合于系統中抗原檢測的反應系統該系統包括一種條件，這種條件很溫和足以保持對抗病毒抗原中抗原決定簇的抗體的功能，但是這種條件可以從存在于樣品中具有復雜結構的病毒顆粒充分暴露抗原被抗體(識別病毒抗原的探針)識別的面積。
對于HCV，已經證明，核心抗原通過處理超離心分離的病毒顆粒可以被檢測到(Takahashi等.，1992，普通病毒學雜志73667-672)，并且HCV微粒可利用非離子型表面活性劑(如吐溫80或Triton X100)與聚乙二醇通過聚集作用沉淀(Kashiwakuma等.，1996，免疫學方法雜志，19079-89)。然而，在前者中，檢測敏感性不夠高并且仍然留下了抗原是否充分被暴露的問題。在后者中，曾通過加入另一種處理劑滅活抗體，并且沒有論及各種表面活性劑的影響。
按照本發明，首先研究的條件集中在表面活性劑上。由此發現，通過利用基于表面活性劑的組合物，不使用任何預處理的過程(如離心或者加熱)，僅僅通過稀釋在反應溶液中的樣品，實現了病毒顆粒中抗原的有效檢測。
從病毒顆粒中有效地抽提病毒抗原，并且抑制與血清中各種物質的相互作用是必要的，由此提供了一種條件，在這種條件下探針可以有效地與抗原進行反應。作為在這種情況下使用的有效的表面活性劑，可以提到在一個分子中同時具有一個含有10個或更多碳原子的烷基以及仲銨，叔銨，或季銨的表面活性劑，或者非離子型表面活性劑。
在上述有一個烷基以及仲銨，叔銨，或季銨的表面活性劑中，優選的烷基是直鏈烷基，同時其中的碳原子的數量是10或者更多，更優選地是10-20，作為胺，叔銨或者季銨(銨)是優選的。具體的表面活性劑包括十二烷基-N-肌氨酸，十二烷基三甲基銨，十六烷基三甲基銨，3-(十二烷基二甲基銨)-1-丙烷磺酸鹽，3-(十四烷基二甲基銨)-1-丙烷磺酸鹽，十二烷基吡啶翁，鯨蠟基吡啶翁，癸酰-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)，十二烷基-N-甜菜堿等。十二烷基-N-肌氨酸和十二烷基三甲基銨是優選的。
作為上面提到的非離子型表面活性劑，有在12-14之間的親水-親脂平衡值的那些是優選的，同時聚氧乙烯異辛苯基醚(如Triton X100和TritonX114)，或者聚氧乙烯壬基苯基醚(如Nonidet P40，TritonN101和Nikkol NP)是優選的。
按照本發明，上述兩種類型的表面活性劑可以單獨地使用，但是組合使用它們更優越和可以由組合使用獲得協同作用。
可以加入能改變含水的環境的附加組分(如尿素)。
在本發明中作為探針的單克隆抗體本文所使用的HCV的結構蛋白的基因片段是指包含HCV結構蛋白核心區和具有編碼包含HCV的N端的1-160的氨基酸序列的多肽的至少有一個堿基序列的DNA片段的基因片段。具體地說，它是包含編碼SEQ ID No2的氨基酸序列的堿基序列的基因片段。
有本文所使用的具有HCV抗原活性的多肽是指在免疫學上與抗HCV抗體進行反應的融合多肽或者多肽，并且可以用作構建本發明的雜交瘤和由此獲得的單克隆抗體的抗原。具體地說，它是具有包含SEQ ID No1的氨基酸序列的HCV抗原活性的多肽或者具有包含SEQ ID No1的部分氨基酸序列的HCV抗原活性的多肽，或者具有附加到它的N端或者C端上的額外的氨基酸序列的多肽。
抗上述具有SEQ ID No3-6中顯示的氨基酸序列的融合多肽和多肽的本發明的單克隆抗體可以由本領域技術人員容易地構建。雜交瘤產生單克隆抗體是眾所周知的。例如，BALB/c小鼠周期性地以上述融合多肽或者多肽(下文中稱為本發明的抗原)作為單一抗原或者與BSA，KLH等的組合抗原單獨地或與佐劑(例如Freund完全佐劑)混合腹膜內或者皮下免疫。當在血清中的抗體滴度增加時，本發明的抗原作為加強劑被用于尾靜脈中。在無菌分離脾之后，將它與合適的骨髓瘤細胞系融合以便獲得雜交瘤。這一方法可以按照Kohler和Milstein的方法(自然，256495-497，1975)進行。
用上述方法所獲得的雜交瘤細胞系可以在合適的培養液中培養，產生顯示與本發明的抗原發生特異性反應的抗體的雜交瘤細胞系被選擇和克隆。對于產生抗體的雜交瘤的克隆，除了有限的抗體的稀釋法之外，可以使用軟瓊脂方法(歐洲免疫學雜志.6511-5198，1976)。這樣產生的單克隆抗體通過利用蛋白質A的柱層析之類的方法純化。
除上述單克隆抗體之外，可以產生用作探針的分子。例如，重組抗體在Hoogenboon的綜述中作了詳盡的描述(生物技術動向，1562-70，1997)。
利用探針的檢測系統按照本發明產生的單克隆抗體在以下測定中被用作HCV結構蛋白的檢測和定量的檢驗試劑；酶聯免疫吸附測定，酶免疫測定，酶免疫印跡測定，放射免疫測定，基于聚集作用的測定，或者其它已知的免疫測定。當標記抗體用于檢測時，熒光化合物，化學發光化合物，酶，產色物質等，可以用作標記化合物。
例如，當基于夾心反應系統的方法被用于檢測樣品(血清)中病毒抗原時，所利用的診斷試劑盒包含涂在固相支持體(例如，微滴板孔的內壁)上的一種或多種單克隆抗體。結合至標記物質上的一種或多種單克隆抗體或者片段。任何固定化在固相支持體上的單克隆抗體和標記的單克隆抗體都可以使用，并且可選擇提供高敏感性的組合。
能被利用的固相支持體包括，例如，微量滴定板，試管，和由聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯，或者聚乙烯制造的毛細管，小珠(膠乳小珠，血紅細胞，金屬化合物等等)，膜(脂質體等等)，濾器等。
本發明的效果依據本發明的方法，利用抗體作為探針，在適合于進行檢測的免疫測定的狀態下，病毒抗原從病毒顆粒中可以方便地被釋放。此外，依據本發明通過處理含有病毒顆粒的樣品，病毒抗原的簡單和敏感的檢測和定量可以通過免疫測定來進行，其中抗原利用抗體作為探針檢測。還可能制備試劑盒，測定試劑盒以及診斷試劑，其確定病毒存在或者不存在。采用使用本發明的樣品處理方法的免疫測定法定量樣品中的病毒也是可能的。
實施例下列實施例說明本發明，但是不應該將它們理解為對本發明范圍的限制。
實施例1.HCV來說的多肽的表達和純化(A)表達質粒的構建對應于HCV的核心區的質粒被構建如下將通過把C11-C21克隆和C10-E12克隆分別整合進pUC119所獲得的質粒pUC.C11-C21和pUC.C10-E12(日本未審專利出版物(Kokai)6號(1994)-38765)的DNA各1微克，在20μl限制酶反應溶液[50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15單位EcoRI以及15單位ClaI酶]，以及限制酶反應溶液[10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，50mMNaCl，15單位ClaI以及15單位KpnI]中在37℃下消化1小時，然后進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳以純化大約380bp的EcoRI-ClaI片段以及大約920bp的ClaI-KpnI片段。
將通過以EcoRI和KpnI消化pUC119所獲得的兩個DNA片段和載體加入至5μl 10X連接酶緩沖溶液[660mM Tris-HCl，pH7.5，66mM MgCl2，100mM二硫蘇糖醇，1 mMATP]中，加入1μl T4的連接酶(350單位/μl)，以及水使總體積達到50μl，然后于16℃溫育過夜以便進行連接反應。利用這一質粒，轉化大腸桿菌JM109以獲得質粒pUC·C21-E12。
質粒pUC·C21-E12的一納克DNA，利用兩引物進行PCR5′-GAATTCATGGGCACGAATCCTAAA-3′(SEQ ID No7)，及5′-TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC-3′(SEQ ID No8)。利用GeneAmpTM實施PCR，(DNA擴增試劑盒，由Perkin Elmer Cetus制造)其條件是在95℃下DNA變性1.5min，在50℃變性2min，在70℃下DNA合成3分鐘。這樣獲得的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上分離，并且用玻璃粉法(Gene Clean)純化。
另一方面，pUC19以SmaI消化，同時由PCR獲得的DNA片段加入至5μl 10X連接酶緩沖液[660mM Tris-HCl，pH7.5，66mM MgCl2，100mM二硫蘇糖醇，1mMATP]中，加1μl T4連接酶(350 units/μl)，及水達到總體積50μl，然后在16℃下培養過夜以進行連接反應。利用這一質粒，轉化大腸桿菌JM109以獲得質粒pUC·C21-E12·SmaI。將這一質粒DNA一微克在20μl限制酶反應溶液[150mM NaCl，6mM Tris-HCl，pH7.5，6mM MgCl2，15單位EcoRI以及15單位BamHI酶]中消化，然后進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳以分離大約490bp的EcoRI-BamHI片段，其通過玻璃粉法純化。
然后，將表達載體Trp·TrpE的1μg DNA(日本未審專利出版物(Kokai)5號(1993)-84085)在20μl限制酶反應溶液[150mM NaCl，6mM Tris-HCl，pH7.5，6mM MgCl2，15單位EcoRI以及15單位BamHI酶]中在37℃下消化1小時。向反應混合物加入39μl的水，并且在70℃下加熱5分鐘。此后，加入1μl的細菌堿性磷酸酶(BAP)，在37℃下溫育1小時。
為了進行苯酚抽提，向反應混合物中加入苯酚。這樣獲得的水層以乙醇沉淀，將獲得的沉淀干燥。將一微克獲得的EcoRI-BamHI處理過的載體的DNA和上述核心140片段加入到5μl的10X連接酶緩沖液[660mM Tris-HCl，pH7.5，66mM MgCl2，100mM二硫蘇糖醇，1mMATP]中，加入1μl T4連接酶(350 units/μl)，及水達到總體積50μl，然后在16℃下溫育過夜以便進行連接酶反應。
利用10μl的這一反應混合物，轉化大腸桿菌菌株HB101。用于轉化的敏感大腸桿菌菌株可以由氯化鈣方法構建[Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學雜志.，53，159-162(1970)]。將轉化了的大腸桿菌涂在包含25μg/ml氨芐青霉素的LB平板上(1％色氨酸，0.5％NaCl，1.5％瓊脂)，并且在37℃下培養過夜。利用接種環將在平板上形成的一鉑環量的細菌菌落轉移到包含25μg/ml氨芐青霉素的LB培養介質上并在37℃下培養過夜。將1.5ml的細菌培養物離心，收集細胞，然后將質粒DNA利用堿法進行小量制備[Manniatis等.，分子克隆實驗室手冊(1982)]。
然后，將這樣獲得的質粒DNA的1μg DNA在20μl限制酶反應溶液[150mMNaCl，6mM Tris-HCl，pH7.5，6mM MgCl2，15單位EcoRI以及15單位BamHI酶]中在37℃下消化1小時，然后進行瓊脂糖凝膠電泳中。選擇產生大約490bp EcoRI-BamHI片段的Trp·TrpE核心160表達質粒。
(B)由克隆核心160編碼的多肽的表達和純化將具有Trp·TrpE核心160表達質粒的大腸桿菌菌株HB101接種到3ml包含50μg/ml氨芐青霉素的2YT上(1.6％胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，在37℃下培養9小時。將1ml的培養物轉移到包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml M9-CA培養基(0.6％Na2HPO4，0.5％KH2PO4，0.5％NaCl，0.1％NH4Cl，0.1mM CaCl2，2mMMgSO4，0.5％酪蛋白氨基酸，0.2％葡萄糖)上，并在37℃下培養。在OD600＝0.3時以最終濃度40mg/l加入吲哚丙烯酸酯，并且培養16小時以上。離心培養物收集細胞。
向收集的細胞中加入20ml緩沖液A[50mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，30mM NaCl]以使細胞懸浮。再一次離心懸浮液獲得2.6g表達細胞。將這樣獲得的細胞懸浮在10ml的緩沖液中。在用超聲處理破壞大腸桿菌的膜之后，將它離心獲得包含由HCV cDNA和TrpE編碼的多肽的融合多肽的不能溶解的組分。向該組分中加入包含6M尿素的10ml緩沖液A且抽提融合多肽。將增溶的抽提物進行利用S-瓊脂糖凝膠的離子交換柱層析，以純化融合多肽。
實施例2.構建雜交瘤的方法將上述方法所制備的融合多肽(TrpC11)溶解在6M尿素中，然后用10mM磷酸緩沖液(pH7.3，包含0.15M NaCl且最終濃度介于0.2-1.0mg/ml之間)稀釋，并且與相等量的佐劑(Titermax)混合以便使TrpC11懸浮。向4-6周齡的BALB/c小鼠的腹膜內注入所制備的濃度在0.1-0.5mg/ml之間的TrpC11的懸浮液。類似的免疫每兩周進行一次，在超過兩周以后，通過尾靜脈施用溶解在生理鹽水中的10μg的TrpC11。
在最后一次注射三天之后，從免疫的動物的身上無菌分離脾，并且利用剪刀剪成碎片，然后弄碎成單個細胞并用RPMI-1640介質洗滌三次。在洗滌之后，小鼠骨髓瘤細胞系SP2/OAg14在以上描述的對數生長期，將2.56×107個所說的細胞和1.64×108個脾細胞在50ml離心管中混合。混合物在200×g下離心5分鐘，除去上清液，同時向沉淀中加入1ml包含50％聚乙二醇(PEG)4000(由Merck制造)的RPMI-1640介質，并且進一步加入10ml RPMI-1640介質以便進行細胞融合。
在PEG由離心(200×g，5分鐘)除去之后，所融合的細胞在包含10％牛血清，次黃嘌呤，氨基蝶呤，以及胸苷(以下指HAT)的RPMI-1640介質中在96-孔平板上培養10天來僅僅培育雜交瘤。然后，產生興趣抗體的克隆用ELISA方法檢測，以便獲得產生具有本發明所需的反應特異性的單克隆抗體的雜交瘤。
這樣獲得的雜交瘤按照常規有限稀釋法進行單克隆，并且所獲得的雜交瘤被稱作HC11-11，HC11-14，HC11-10，及HC11-3和HC11-7。所說的四種雜交瘤分別以FERM BP-6005，FERM BP-6006，FERM BP-6004，FERMBP-6002以及FERM BP-6003于1997年7月4日保藏于工業科學和技術機構國家生物科學和人類技術研究所。
實施例3.單克隆抗體的構建以實施例2的方法所獲得的雜交瘤接種到利用去甲植烷等處理的小鼠的腹腔中，同時在腹水中收集單克隆抗體。單克隆抗體通過利用蛋白質A-結合的瓊脂糖凝膠柱分離IgG組分來純化。
通過利用兔抗鼠Ig同形抗體(由Eymed制造)的免疫測定發現由上述五種雜交瘤所產生的C11-14，C11-11，C11-10，C11-7和C11-3的每個單克隆抗體的同種型，分別地對于C11-10，C11-7是IgG2及對于C11-11，C11-14，C11-3是IgG1。對于獲得的五種單克隆抗體，利用合成多肽實施表位分析，這種合成多肽是按照從HCV核心區來源的序列由20個合成氨基酸組成的。如表1中顯示的結果，它們是特異性地識別部分核心區的單克隆抗體。
表1

實施例4.樣品處理條件的研究1)SDS濃度向100μl正常人血清與HCV-RNA-陽性血清中加入包含不同濃度的SDS和0.6％CHAPS的100μl處理溶液。然后將混合物放置在56℃的溫箱中，處理30分鐘，并且每種所處理的混合物的80μl用作為樣品。利用下述的測定方法獲得的結果以處理時間時SDS的濃度作為橫坐標在圖1中顯示。
2)CHAPS的濃度向100μl正常人血清與HCV-RNA-陽性血清中加入包含不同濃度的CHAPS和SDS5％的100μl處理溶液。然后將混合物放置在56℃的溫箱中，處理30分鐘，并且每種所處理的混合物的80μl用作為樣品。利用下述的測定方法獲得的結果以處理時間時CHAPS的濃度作為橫坐標在圖2中顯示。
3)尿素濃度向100μl正常人血清與HCV-RNA-陽性血清中加入包含不同濃度的尿素的100μl處理溶液(5％SDS，0.6％CHAPS)。然后將混合物放置在56℃的溫箱中，處理30分鐘，并且每種所處理的混合物的80μl用作為樣品。利用下述的測定方法獲得的結果以處理時間時尿素的濃度作為橫坐標在圖3中顯示。
4)Triton X100的濃度向100μl正常人血清與HCV-RNA-陽性血清中加入包含不同濃度的Triton X100的100μl處理溶液(5％SDS，0.6％CHAPS 6M尿素)。然后將混合物放置在56℃的溫箱中，處理30分鐘，并且每種所處理的混合物的80μl用作為樣品。利用下述的測定方法獲得的結果以處理時間時Triton X100的濃度作為橫坐標在圖4中顯示。
5)反應溫度向100μl正常人血清與HCV-RNA-陽性血清中加入100μl的處理溶液(5％SDS，0.6％CHAPS 6M尿素0.75％Triton)。然后將混合物置于4℃，室溫(23℃)，37℃，45℃，56℃及70℃下處理30分鐘，并且每種所處理的混合物的80μl用作為樣品。利用下述的測定方法獲得的結果在圖5中顯示。
測定方法利用如下所描述的各種測定方法對在血清處理條件的研究中所獲得的樣品進行逐一評價。這樣，將抗-HCV核心抗原的單克隆抗體(相等量的抗體C11-3和C11-7的混合物)在0.1M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液中稀釋成最終濃度為6μg/ml，同時100μl每種稀釋液被分配在96-孔微量滴定板(由Nunc制造)的每個孔上。平板在4℃下溫育過夜之后，以0.35ml pH7.3，包含0.15M NaCl的10mM磷酸鈉的緩沖液洗滌兩次。然后，加入0.35ml pH7.35，包含0.5％酪蛋白鈉(在下文稱作封閉溶液)的磷酸鈉緩沖液，同時平板在室溫下進一步溫育2小時。
在除去封閉溶液之后，將160μl pH7.3，包含0.15M NaCl，1％BSA，0.5％的酪蛋白鈉及0.05％的Tween 20的100mM磷酸鈉的緩沖液，以及用血清處理方法獲得的待測樣品同時加入各自的孔。平板在室溫下進一步溫育2小時，用300μl洗滌液洗滌五次。然后，加入100μl過氧化物酶(POD)標記的單克隆抗體(相等量的抗體C11-10和C11-14的混合物)并在室溫下溫育30分鐘。在溫育結束之后，平板用上述洗滌液300μl洗滌五次。向平板中加入一百微升底物(鄰亞苯基二胺，在下文稱作OPD)溶液，同時在加入100μl 2N硫酸溶液之后將平板在室溫下溫育30分鐘。以在630nm處的吸收作為參比測量在波長492nm處的吸收(OD492)。
正如在圖1至圖4中顯示的那樣對每一個處理條件進行優化。在未處理樣品中檢測核心抗原是困難的，但是這樣一種簡單的處理卻使核心抗原的檢測成為可能。尤其是，結果顯示，核心抗原通過應用下列條件SDS在0.5％或者更大，CHAPS在0.1％或者更大，尿素在1M或者更大，以及TritonX100在0.1％-0.75％以及4℃-70℃的溫度范圍可以滿意地檢測核心抗原。
實施例5.在結構區中的核心抗原的檢測與測定方法(1)向100μl血清中加入100μl的處理溶液(5％SDS，0.6％CHAPS 6M尿素0.75％Triton)。然后將混合物置于在56℃下處理30分鐘，并且每種所處理的混合物的120μl用作為樣品。
將抗-HCV核心抗原的單克隆抗體(相等量的抗體C11-3和C11-7的混合物)在0.1M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液中稀釋成最終濃度為6μg/ml，同時100μl每種稀釋液被分配在96-孔微量滴定板的每個孔上(由Nunc制造)。平板在4℃下溫育過夜之后，以0.35ml pH7.3，包含0.15M NaCl的10mM磷酸鈉的緩沖液洗滌兩次。然后，加入0.35ml封閉溶液，同時平板在室溫下進一步溫育2小時。
在除去封閉溶液之后，將120μl反應緩沖液以及在上述處理方法中獲得的待測樣品同時加入各自的孔，同時平板在室溫下溫育2小時。平板用300μl洗滌液洗滌五次，然后，向平板中加入100μl過氧化物酶(POD)標記的單克隆抗體(相等量的抗體C11-10和C11-14的混合物)并在室溫下培養30分鐘。平板用洗滌液300μl洗滌五次并向平板中加入100μl(OPD)底物溶液，同時在加入100μl 2N硫酸溶液之后將平板在室溫下溫育45分鐘。以630nm處的吸收作為參比測量在波長492nm處的吸收(OD492)。作為一種標準的血清，血清組50，被定義作1U/ml，用包含1％的BSA pH 7.3的10mM磷酸鈉緩沖液系列稀釋。這種標準血清進行同樣的處理和測定。
圖6顯示了用作標準的血清的血清組50的一條稀釋線。樣品中的核心抗原以劑量依賴性方式測定，并且能檢測到大約0.5mU/ml的水平。因此，證明了通過將本發明的十分簡單的樣品處理方法和單克隆抗體結合，可以檢測或者定量HCV核心抗原。
實施例6.HCV核心抗原的檢測和定量(2)利用堿性磷酸酶標記的單克隆抗體的方法96-孔黑色微量滴定板(Nunc)作為固相載體，堿性磷酸酶標記的單克隆抗體作為標記抗體，以及CDPstar(Emerald II作為敏化劑)作為底物被利用。用作標準的血清的血清組50的一條稀釋線在圖7中顯示，其中樣品中的核心抗原以劑量依賴性方式測定，并且能檢測到大約0.5mU/ml的水平。因此，證明了利用堿性磷酸酶標記的單克隆抗體的方法也可以檢測或者定量HCV核心抗原。
實施例7.在溶血血清中抑制敏感性降低的添加劑的研究當試驗血清組分對敏感性的作用時發現血紅蛋白的加入極大地降低了敏感性。有人認為，降低是由從變性血紅蛋白中釋放的血紅素所造成的，這種血紅蛋白是利用包含SDS，CHAPS，或者Triton X100的預處理試劑進行預處理時產生的。這樣，能減少變性血紅蛋白作用的添加劑可以通過將它們加入到預處理試劑中進行試驗。
加入尿素的影響通過將尿素加入模型樣品中并且按照實施例6通過測定核心抗原進行研究，而這種模型樣品是通過將高濃度的血紅蛋白(由Kokusai ShiyakuKansho Check制造)加入到HCV核心抗原的陽性血清中制成的(血清組3號)。在430mg/dl血紅蛋白加入組相對于100％無血紅蛋白加入組(作為對照)的核心抗原的活性水平在表2中顯示。當不加入尿素時，在血紅蛋白加入組中的核心抗原的活性水平降低30％，并且通過增加加入的尿素的量，血紅蛋白加入組的核心抗原的活性水平就升高且受血紅蛋白的干擾降低，這一點已經被證實。
表2.尿素對血紅蛋白干擾的抑制作用

另一方面，由于有各種氨基酸與血紅素相互作用的可能性的，及氨基和羧基基團的緩沖作用，加入各種氨基酸并檢驗其影響程度。結果顯示在表3中。
表3各種氨基酸對血紅蛋白干擾的抑制作用

色氨酸和組氨酸顯示了對干擾的最有力的抑制作用。研究了對干擾的抑制作用的劑量依賴性，結果顯示在表4中。
表4.組氨酸和色氨酸對血紅蛋白添加劑干擾的抑制作用

由于在血紅蛋白中血紅素由側鏈配位，并且保留在血紅蛋白中，所以說明該作用歸因于側鏈。因此，研究組氨酸的側鏈中咪唑，色氨酸側鏈中含吲哚環的吲哚丙烯酸的作用，結果如表5中所示。
表5.咪唑和吲哚丙烯酸對血紅蛋白干擾的抑制作用

當將吲哚或者吲哚丙烯酸加至反應物中時，觀察到的對血紅蛋白干擾的劑量依賴性抑制作用，類同于加入氨基酸觀察到的結果。這一現象表明通過給反應物加入含咪唑環的物質，例如組氨酸，或者含吲哚環的物質，例如色氨酸，即使是含血紅蛋白的樣品，也可進行核心抗原的敏感檢測。
研究添加劑的組合效應，結果如表8中所示。通過組氨酸和色氨酸的組合，活性恢復90％或更大，加入尿素可進一步增加檢測敏感性。
表6

實施例8.分析在血清處理和測定方法中識別的分子形式用每一種血清處理方法來處理0.25ml血清組13。在凝膠過濾柱(Superdex 200HR)上分級分離所處理的血清，同時測定組分中的抗核心免疫活性。結果如表8中所示。數據說明可識別分子量約為20-30kDa的分子，在上述預處理后的血清中，通過病毒的破裂和抗核心抗體的失活已經釋放出病毒中核心抗原。
實施例9.測定血清中HCV結構域中核心抗原的方法通過上述方法，將由AmpliCore HCV監測試劑盒(Roche)測定的含有103-107拷貝數/ml HCV-RNA的血清，PCR方法，以及正常人血清用來定量血清中HCV核心抗原。
作為標準血清的血清組50(被定義為1U/ml)，用10mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.3，包含1％BSA)系列稀釋，并用類似的方法處理。結果如表7中所示。在所有的試驗樣品中，正常人血清中的核心抗原均在檢測限度以下，在所有的PCR-陽性樣品中均可檢測到。圖9顯示其相互關系，揭示了其與PCR方法的相互關系值高達0.8或更大。
表7.HCV-RNA和核心抗原水平

N.D.未檢測出實施例10.研究樣品處理的條件及處理方法的條件1)鹽酸胍濃度向100μl正常人血清與HCV-RNA-陽性血清中，加入100μl含不同濃度鹽酸胍和0.5N HCl的處理液。在室溫下處理混合物30分鐘，80μl每種處理混合物用作樣品。用下述測定方法獲得的結果如圖10中所示，以不同處理時間時的鹽酸胍濃度作為橫坐標。
2)Triton X100濃度向100μl正常人血清和HCV-RNA-陽性血清中，加入100μl含不同濃度Triton X100(6M鹽酸胍，0.5 NHCl)的處理液。在室溫下處理混合物30分鐘，80μl每種處理混合物用作樣品。用下述測定方法獲得的結果如圖11中所示，以不同處理時間時的Triton X100濃度作為橫坐標。
3)Tween 20濃度向100μl正常人血清和HCV-RNA-陽性血清中，加入100μl含不同濃度Triton X100(6M鹽酸胍，0.5 NHCl，12.5％Triton X100)的處理液。在室溫下處理混合物30分鐘，80μl每種處理混合物用作樣品。用下述測定方法獲得的結果如圖12中所示，以不同處理時間時的Tween 20濃度作為橫坐標。
4)反應溫度向100μl正常人血清和HCV-RNA-陽性血清中，加入100μl含不同濃度Triton X100(6M鹽酸胍，0.5 NHCl，12.5％Triton X100，0.75％Tween 20)的處理液。分別在4℃、室溫(23℃)、37℃和45℃條件下處理混合物30分鐘，80μl每種處理混合物用作樣品。用下述測定方法獲得的結果如圖13中所示。
測定方法處理血清條件下的研究中所獲得的每一份樣品，用如下所述的各種分析方法進行測定。這樣，稀釋抗-HCV核心抗原單克隆抗體(等量抗體C11-14和C11-11的混合物)，使其在pH為9.6的0.1M碳酸鹽緩沖液中的最后總濃度為6μg/ml，將每100μl的稀釋液分布在96-孔的微量滴定板上(Nunc制造)。在4℃條件下過夜溫育該平板后，用0.35ml的10mM磷酸鈉緩沖液洗滌兩次(pH7.3，含0.15M NaCl)。然后，加入0.35ml pH為7.35，含0.5％酪蛋白鈉(在此之后稱之為封閉溶液)的10mM磷酸鈉緩沖液，進一步在室溫下溫育平板2小時。
除去封閉溶液之后，將160μl混合物(由140μl的pH為7.3，含0.15MNaCl，1％BSA，0.5％酪蛋白鈉和0.05％Tween 20的100mM磷酸鈉緩沖液，和20μl的1M Tris(在此之后稱之為反應緩沖液)組成)以及用上述血清處理方法獲得的待測樣品加入到各自的板孔，并在室溫下溫育2小時，用300μl的洗滌液洗滌五次，然后加入100μl的過氧化物酶(POD)-標記的單克隆抗體(C11-10)，在室溫下溫育30分鐘。溫育結束后，用300μl的上述洗滌液洗滌平板五次。將一百微升底物(鄰甲苯基亞二胺，在此之后稱之OPD)溶液加到平板上，并將平板在室溫下溫育30分鐘，其后再加入100μl 2N的硫酸溶液。以底物在630nm波長處的吸光值作為參比值，測定其在492nm(OD492)波長處的吸光值。
如圖10-13中所顯示的，優化每一處理條件。檢測未處理樣品中的核心抗原十分困難，但經這樣一種簡單的處理后就能夠檢測到核心抗原。在任何情況下，在健康的人體中觀察不到加強信號。這也表明在鹽酸胍濃度為2M或者更大及Triton X100濃度為0.2％或更大時，溫度范圍為4-45℃的條件下，可明顯地檢測到核心抗原。
實施例11.檢測與測定核心抗原的方法向100μl血清加入100μl的處理液(6M鹽酸胍，0.5 NHCl，12.5％TritonX100，0.75％Tween 20)。在室溫下處理30分鐘，100μl每種處理混合物用作為樣品。
稀釋抗-HCV核心抗原單克隆抗體(等量抗體C11-14和C11-11的混合物)，使其在pH為9.6的0.1M碳酸鹽緩沖液中的最后總濃度為6μg/ml，將每100μl的稀釋混合物分布在96-孔的微量滴定板(Nunc制造)上。
在4℃條件下過夜溫育該平板后，用0.35ml 10mM磷酸鈉緩沖液洗滌兩次(pH 7.3，含0.15M NaCl)。然后，加入0.35ml的封閉溶液，進一步在室溫下溫育平板2小時。除去封閉溶液之后，將150μl的反應緩沖液和以上述處理方法獲得的測量樣品加入到各自的孔中，在室溫下溫育2小時。
用300μl的洗滌液洗滌平板五次，隨后將100μl的過氧化物酶(POD)-標記的單克隆抗體(C11-10)加到平板上，在室溫下溫育30分鐘。用300μl的洗滌液洗滌平板五次，加入100μl的底物溶液(OPD)。室溫下溫育平板45分鐘后，再加入100μl 2N的硫酸溶液。以底物在630nm波長處的吸光值作為參比值，測定其在492nm(OD492)波長處的吸光值。作為標準血清的血清組50，定義為1U/ml，用pH為7.3，含1％BSA的10mM磷酸鈉緩沖液中系列稀釋，其也經過類似的處理和測定過程。
圖14顯示作為標準血清的血清組50的稀釋線。通過劑量依賴性方式確定樣品中核心抗原含量，可檢測低至大約0.5mU/ml水平的抗原。因此，該實施例證明了將本發明的十分簡單的樣品處理方法和單克隆抗體結合起來，可以檢測或定量HCV核心抗原。
實施例12.分析血清處理和測定方法中識別的分子形式每一種處理血清的方法都用來處理0.25ml血清組13。用凝膠過濾柱(Superdex 200HR，1×30)分級分離所處理的血清，測定各組分的抗-核心免疫活性。結果如表15中所示。數據表明分子量大約為20-30 kDa的分子可被識別，在以上的提到的預處理過的血清中，病毒中的核心抗原由于病毒的破裂和血清中抗核心抗體的滅活已從各種相互作用中釋放出來。
實施例13.測定血清中核心抗原的方法通過上述方法，將由AmpliCore HCV監測試劑盒(Roche)測定的具有103-107拷貝/ml HCV-RNA的血清，PCR方法，以及正常人血清用來定量血清中的HCV核心抗原。
作為標準血清的血清組50(被定義為1U/ml)，用10mM的磷酸鈉緩沖液(pH 7.3，包含1％BSA)系列稀釋，并用類似的方法處理。結果如表8中所示。在所有的試驗樣品中，正常人血清中的核心抗原均在檢測限度以下，在所有的PCR-陽性樣品中均可檢測到。圖16顯示其相互關系，揭示了與PCR方法的相關值高達0.8或更大。
表8.HCV-RNA和核心抗原水平

N.D.未檢測出實施例14.檢測乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原迄今為止，我們已經解釋了檢測HCV核心抗原的方法。我們也曾研究了這一處理方法是否適用于對其它病毒中結構蛋白的檢測。
HBV核心抗原的單克隆抗體(Tokushu Menneki Kenkyuusho[特殊免疫學研究學院])用pH為9.6的0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋成，濃度為3μg/ml，并且分散成100μl的小份。在4℃條件下過夜溫育后，用磷酸緩沖液洗滌平板，并將一份350μl的1％BSA溶液分布于平板上。在放置在室溫下2小時后，吸出1％的BSA溶液，同時加入200μl的反應溶液。
以重組HBV核心抗原作為標準，將五位經檢測HBe呈陽性、抗-HBe抗體呈陰性的患者血清及十位正常人血清作為樣品。，向100μl樣品加入50μl處理試劑(7.5％SDS，0.75％CHAPS，0.15％Triton X100，2M尿素，0.1M組氨酸，0.1M色氨酸)，在56℃下處理30分鐘。在進行處理之后，將其中的50μl加至充有反應溶液的板孔，并且在室溫下溫育90分鐘。
作為對照(沒有經過預處理)，每一種樣品各100μl，以50μl純水稀釋，并將50μl的稀釋樣品用于進行反應。用洗滌溶液洗滌五次之后，加入生物素標記的抗-HBV核心單克隆抗體(等量HBc-2，HBc-5，HBc-14的混合物)，在室溫下溫育30分鐘。再用洗滌溶液洗滌五次之后，加入抗生物素蛋白標記的的堿性磷酸酶，同時使混合物在室溫下反應30分鐘。
用洗滌溶液洗滌五次之后，加入CDPstar(Emerald II作為敏化劑)，在室溫下反應15分鐘，并測定其相對化學發光性。連續稀釋重組HBV核心抗原的標準曲線如圖17中所示，所測定樣品中核心抗原的數量如表9中所示。檢測限是21ng/ml。當定義核心抗原陽性與陰性的界限值為60ng/ml時，所有10種正常人的血清，無論經過或未經過預處理，均顯示核心抗原陰性，而攜帶乙型肝炎病毒的患者血清，在未經過預處理情況下檢測不到核心抗原，經過預處理的血清，所有試驗的血清核心抗原均呈陽性。
可以認為在攜帶乙型肝炎病毒的患者血清中，預處理破壞了病毒顆粒并且滅活了抗-HBc抗體，所以能夠檢測出核心抗原。以上所述內容證明了這種樣品處理方法對檢測除HCV之外的病毒的結構蛋白十分有用，如有作為基因組的DNA的HBV。不必說，該方法同樣適合于與HCV有關的病毒，象黃熱病毒和逆轉錄病毒，例如HIV。
表9.

實施例15.檢測未經預處理抗原的有效方法將含HCV顆粒的樣品用加有表面活性劑的反應溶液稀釋，研究檢測HCV抗原的有效性。
檢測HCV核心抗原可利用HCV核心抗原的單克隆抗體通過酶免疫分析法(EIA)進行。在實施例3中獲得的單克隆抗體中，C11-3和C11-7用作捕獲核心抗原的抗體，C11-10和C11-14用作檢測所捕獲的核心抗原的抗體。
EIA基本上在以下條件下進行。將單克隆抗體C11-3和C11-7的溶液，各用乙酸鹽緩沖液稀釋至濃度為4μg/ml，加至微量滴定板上，在4℃下溫育一整夜。用磷酸緩沖液洗滌之后，加入含1％BSA的磷酸緩沖液以進行封閉。往平板上加100μl反應溶液和100μl樣品。然后在室溫下攪拌和溫育平板1.5小時。通過用磷酸緩沖液洗滌除去未反應物質，并向底物加入低濃度的表面活性劑。然后再加入堿性磷酸鹽標記的單克隆抗體C11-10與C11-14，在室溫下反應30分鐘。反應結束之后，通過用磷酸緩沖液洗滌除去未反應物質，加入低濃度的表面活性劑。然后加入底物溶液(CDP-Star/Emeraldll)，在室溫下反應20分鐘。測量其發光值。
對于上述反應，加入各種表面活性劑以研究它們的作用。通過利用HCV-陽性血清，其中對HCV的抗體滴度在檢測限之下，并且實際上不包含任何對HCV的抗體，基于發光值的核心抗原的活性，按相對于正常人血清發光值(定義為1.0)的比來表示。結果如表10和11所示。
表10.相對正常人血清的反應性(S/N比)

表11.相對正常人血清的反應性(S/N比)

結果揭示加入含有12-14 HLB的非離子型表面活性劑，例如作為其代表物的Triton X100，引起發光值的增加，因而使得HCV-陽性血清的檢測敏感性較正常人的血清有所提高。類似地，其也說明如十二烷基-N-肌氨酸鈉和十二烷基三甲氨酸所代表的，加入結構中具有直鏈烷基團(該烷基同時具有十個或更多個碳原子和仲胺、叔胺或季胺)的表面活性劑引起HCV-陽性血清的檢測敏感性增加。加入具有不超過8個碳原子的直鏈烷基的表面活性劑(氯化正辛基三甲基銨)，觀察不到敏感性的增加。同時也發現，通過混合和加入這兩種表面活性劑(如表11中所示，將2％十二烷基-N-肌氨酸鈉和2％Triton X100混合)，可進一步提高HCV-陽性血清的檢測敏感性。
實施例16.檢測HCV感染之后和抗-HCV抗體出現之前時段(窗口期間)內樣品中的核心抗原通過加入2％的Triton X100和2％十二烷基-N-肌氨酸鈉至主要反應溶液中，按照實施例15的方法測量市售的血清轉化組PHV905(B.B.I公司)。當用抗-HCV抗體(Ortho EIA 3.0)試驗測定時，使用的PHV905組在開始觀察21天之后轉變為陽性(血清號PHV905-7)。在試驗過程中，抗體滴度以截止指標(S/CO)表示，其值為1.0或更大時判斷為陽性。HCV核心抗原活性以相對于正常人血清的反應性表示，定義正常人血清反應性值為1.0。
如圖12中所示的，抗-HCV抗體出現之前觀察核心抗原的活性，加入表面活性劑，使核心抗原從病毒顆粒暴露出來，其與固定化的單克隆抗體進行反應，由此進行核心抗原的檢測。
表12

基于2004年4月28日 申請日期1998年8月4日 優先權日1997年8月4日
發明者青柳克己, 大植千春, 飯田久美子, 村木達治, 八木慎太郎, 太郎, 春, 治, 美子 申請人:株式會社先端生命科學研究所