專利名稱：肝癌鑒別診斷用p28的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，是臨床上肝癌病理鑒別診斷中對肝細(xì)胞性肝癌進(jìn)行確認(rèn)的一種新的標(biāo)記物兔抗人p28GANK抗體，使肝細(xì)胞性肝癌與膽管細(xì)胞性或轉(zhuǎn)移性肝癌區(qū)分開來，以便對癥治療。
背景技術(shù)：
肝癌從組織起源上大致可以分為三種類型，即肝細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。由于肝癌的病理學(xué)特點以失去正常的肝小葉結(jié)構(gòu)為特征，因此在組織結(jié)構(gòu)上很難對已被破壞的腫瘤細(xì)胞的來源做出判斷，尤其是中低分化型肝癌。而外科的活檢標(biāo)本因為受到組織視野的限制，也給肝癌的病理診斷帶來困難。目前在肝細(xì)胞性肝癌中常用HepPar1、AFP和CD34作為診斷抗體，而在膽管細(xì)胞性肝癌中常以CK18和CK19作為診斷抗體。實際工作中對目前應(yīng)用的肝癌標(biāo)記物檢出率的報道各有不同。經(jīng)典的AFP標(biāo)記雖然特異性強(qiáng)，但敏感性不高，在肝癌組織中的實際陽性率僅為25％～50％。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)抗原與抗體特異結(jié)合的原理，用從人肝細(xì)胞性肝癌組織中篩選出的p28GANK基因制備的p28GANK蛋白抗原免疫家兔，制備兔抗人p28GANK抗體，由于p28GANK抗體可以特異性識別肝細(xì)胞性肝癌的惡性肝細(xì)胞，因此可將兔抗人p28GANK抗體用于檢測肝細(xì)胞來源的人肝細(xì)胞性肝癌，并將肝細(xì)胞性肝癌與膽管細(xì)胞性肝癌、轉(zhuǎn)移性肝癌區(qū)分開來。
人肝癌高表達(dá)p28GANK基因是2000年Fujita等人應(yīng)用消減雜交法從人肝細(xì)胞性肝癌組織中篩選出的新基因(GenBankD83197)，其開放閱讀框編碼226個氨基酸組成的25kDa的蛋白質(zhì)，其中含有6個重復(fù)ankyrin序列和1個Rb蛋白結(jié)合域(Nature Medicine 2000，696-99.)。其結(jié)構(gòu)見氨基酸序列表1。
一、本發(fā)明兔抗人p28GANK抗體的制備方法如下1.RT-PCR法克隆p28GANK基因1.1合成引物正向引物H15’-gcggatccagtagttgctgggacagc-3’其5’端引入BamHI酶切位點ggatcc反向引物H25’-cgctcgagcttgagtattaaacccagg-3’其5’端引入XhoI酶切位點ctcgag1.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈DNA(采用Gibco/BRL公司的Superscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)反應(yīng)按如下條件進(jìn)行人肝癌組織總RNA(按Life Technologies公司Trizol RNA純化試劑盒操作，制備)(1μg/μ1)2μl，隨機(jī)六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脫氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)處理水2μl，5×第一鏈合成緩沖液4μl，二硫蘇糖醇DTT(0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制劑RNasin 1μl，RNA依賴DNA合成酶Superscript II 1μl，總反應(yīng)體積為20μl，42℃水浴50分鐘，70℃滅活15分鐘后，將所得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
1.3以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增人p28GANK基因cDNA反應(yīng)體系按如下比例逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，脫氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，引物H1(10μmol/L)1μl，引物H2(10μmol/L)1μl，聚合酶Taq polymerase 0.5μl，去離子水36.5μl，總反應(yīng)體積為50μl。PCR程序為94℃變性4分鐘；94℃ 40秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環(huán)；72℃延伸8分鐘。然后按常規(guī)通過瓊脂糖凝膠電泳回收純化PCR產(chǎn)物。
1.4構(gòu)建p28GANK基因誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pProEX-HTb-p28GANK以BamHI和XhoI分別雙酶切6×組氨酸融合表達(dá)載體pProEX-HTb(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)和上述PCR純化產(chǎn)物，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠分離，用QIAGEN公司膠回收DNA試劑盒回收酶切DNA片段。然后將酶切純化后的pProEX-HTb載體和酶切純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物。
1.5構(gòu)建工程菌HT-p28并鑒定重組質(zhì)粒按常規(guī)，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂氨芐青霉素LB平板，37℃孵箱過夜，挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)后抽取質(zhì)粒DNA，用BamHI/XhoI進(jìn)行酶切和DNA測序鑒定。鑒定結(jié)果表明，其重組表達(dá)質(zhì)粒為pProEX-HTb-p28GANK，其相應(yīng)的工程菌為HT-p28。
2.p28GANK蛋白的表達(dá)與純化按常規(guī)將工程菌HT-p28用0.6mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時后，根據(jù)德國QIAGEN公司組氨酸標(biāo)記蛋白純化試劑盒提供的操作說明書純化p28GANK蛋白，得到p28GANK蛋白。
本發(fā)明用H1，H2引物從人肝癌組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴(kuò)增的p28GANK序列是(GenBankD83197)78bp-761bp間的cDNA，其全長684bp，所表達(dá)的p28GANK蛋白含221個氨基酸。結(jié)構(gòu)見氨基酸序列表2。其與氨基酸序列表1所示的由226個氨基酸組成的p28GANK蛋白相比缺少了C端的5個氨基酸，但抗原免疫的效果不變。
3.兔抗人p28GANK抗體的制備、純化與鑒定多克隆抗體的制備按《分子克隆實驗指南》(第二版，薩姆布魯克J.等，科學(xué)出版社，北京，1997，下同)介紹的方法進(jìn)行。
3.1免疫接種取上述p28GANK蛋白2mg溶于1.5ml生理鹽水與等體積的完全弗氏佐劑(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)乳化后，在新西蘭大白兔的背部皮內(nèi)多點注射。首次免疫后3周，對新西蘭大白兔分別進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，每次間隔2周。每次劑量為p28GANK蛋白1mg溶于1.5ml生理鹽水，與等體積的非完全弗氏佐劑(Gibco/BRL，LifeTechnologies，NY)乳化后注射。
3.2制備p28GANK抗體第三次加強(qiáng)免疫后一周，取兔耳緣靜脈血1ml，確定效價達(dá)到1∶32以上。再在第三次加強(qiáng)免疫后第10天進(jìn)行頸動脈插管取血，取盡，將血液置4℃ 24小時，先吸取析出的兔血清，再將余血于4℃，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層血清。將血清分裝后于-80℃保存。按常規(guī)，用固定于硝纖膜上的抗原親和純化兔抗人p28GANK抗體。
3.3鑒定p28GANK抗體用Western blotting鑒定上述純化抗體的特異性，具體按《分子克隆實驗指南》介紹的方法進(jìn)行，將純化的抗體稀釋，稀釋度為1∶50。其能特異性識別p28GANK抗原，也包括能特異性識別真核細(xì)胞裂解液中表達(dá)的p28GANK抗原。鑒定結(jié)果表明其為p28GANK抗體。
二、p28GANK抗體鑒別診斷肝細(xì)胞性肝癌的免疫組織化學(xué)染色實驗1.肝癌切片的免疫組織化學(xué)染色按常規(guī)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測肝癌組織的細(xì)胞來源。免疫組化采用美國DAKO公司生產(chǎn)的試劑盒DAKO EnVision System(DAKO Corporation，carpinteria，USA)。
p28GANK抗體在組織特異性上有較好的肝細(xì)胞特異性染色，其在人肝細(xì)胞肝癌中染色反應(yīng)為陽性；而在人膽管細(xì)胞性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌中，對膽管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、Kuffer氏細(xì)胞和肝間質(zhì)細(xì)胞染色均為陰性。
將肝細(xì)胞性肝癌(HCC)，膽管細(xì)胞性肝癌(ICC)，肝膽管細(xì)胞混合性肝癌(C-HCC-CC)和轉(zhuǎn)移性肝癌(MHC)分別用p28GANK抗體、HepPar1抗體、CK18抗體和AFP抗體分組進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色結(jié)果用Crohn-Mantel-Haentzsel統(tǒng)計法分析，比較結(jié)果見表3。
表3p28GANK，Hep-Par1，CK18和AFP抗體免疫組化染色比較
由表3可見，對肝細(xì)胞來源的HCC或C-HCC-CC，AFP抗體染色率較低而p28GANK抗體與HepPar1和CK18抗體一樣都有較好的染色反應(yīng)，但對ICC和MHC，p28GANK抗體均不染色，而HepPar1抗體對MHC和CK18抗體對ICC和MHC則仍有部分染色，說明p28GANK抗體在區(qū)分肝細(xì)胞來源的肝臟腫瘤的鑒別診斷中有實際應(yīng)用價值。
2.肝癌鑒別診斷實驗為了進(jìn)一步評價p28GANK抗體用于臨床肝癌病理鑒別診斷的可能性，將p28GANK抗體與臨床上常用的HepPar1和CK18抗體做比較，采用Golden Standard diagnostic evaluationtest(金指標(biāo)診斷標(biāo)志物評價測試)進(jìn)行分析。評估指標(biāo)有敏感度(sensitivity，簡寫Se)，特異度(specificity，簡寫Sp)，誤診率(mistake diagnostic rate，簡寫α)，漏診率(omissiondiagnostic rate，簡寫β)，陽性預(yù)測值(positive predictive value，簡寫PV+)，陰性預(yù)測值(negative predictive value，簡寫PV-)，準(zhǔn)確率(validity rate，簡寫π)，Younden指數(shù)(YoundenIndex，簡寫YI)。
具體操作為將病理診斷為肝細(xì)胞來源的肝臟腫瘤標(biāo)本歸為診斷陽性組D+，D+＝HCC+C-HCC-CC；病理診斷為非肝細(xì)胞來源的肝臟腫瘤標(biāo)本歸為診斷陰性組D-，D-＝ICC+MHC。用待檢抗體檢出為陽性的歸為T+，T+組中包括病理診斷為肝細(xì)胞來源的標(biāo)本，即用待檢抗體確診的例數(shù)a(確診)，a＝HCC++C-HCC-CC+，也包括病理診斷為非肝細(xì)胞來源的標(biāo)本，即用待檢抗體誤診的例數(shù)b(誤診)，b＝ICC++MHC+；用待檢抗體檢出為陰性的歸為T-，T-組中包括病理診斷為肝細(xì)胞來源的標(biāo)本，即用待檢抗體漏診的例數(shù)c(漏診)，c＝HCC-+C-HCC-CC-，也包括病理診斷為非肝細(xì)胞來源的標(biāo)本，即用待檢抗體作出鑒別診斷的例數(shù)d(鑒別診斷)，d＝ICC-+MHC-。評價結(jié)果如表4所示。
表4金標(biāo)準(zhǔn)測試(Golden Standard Test)評價HepPar1，CK18和p28GANK抗體在40例肝癌鑒別診斷中的表現(xiàn)
HepPar1Se＝0.76 Sp＝0.91，α＝0.09 β＝0.24，π＝0.8000 YI＝0.67，PV+＝0.96 PV-＝0.59CK18Se＝0.85 Sp＝0.64，α＝0.36 β＝0.15，π＝0.7890 YI＝0.49，PV+＝0.85 PV-＝0.64p28GANKSe＝0.70 Sp＝1.00，α＝0.00 β＝0.30，π＝0.8235 YI＝0.70，PV+＝1.00 PV-＝0.70由表4看出，p28GANK抗體在特異度(Sp)、誤診率(α)、準(zhǔn)確率(π)、Younden指數(shù)(YI)、陽性預(yù)測值(PV+)和陰性預(yù)測值(PV-)等指標(biāo)上都優(yōu)于HepPar1和CK18抗體。說明p28GANK抗體應(yīng)用于臨床肝癌病理鑒別診斷的優(yōu)越性。
圖1為本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pProEX-HTb-p28GANK結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明的p28GANK抗原純化后聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。
圖3為本發(fā)明p28GANK抗體的Western blotting鑒定圖。
圖4為本發(fā)明p28GANK抗體在肝細(xì)胞性肝癌組織內(nèi)的免疫組化圖(200×)。
圖5為本發(fā)明p28GANK抗體在肝癌組織內(nèi)的特異性染色圖(200×)。
圖6為本發(fā)明p28GANK抗體在膽管細(xì)胞性肝癌組織內(nèi)的免疫組化圖(200×)。
圖7為本發(fā)明p28GANK抗體在轉(zhuǎn)移性肝癌組織內(nèi)的免疫組化圖(200×)。
具體實施例方式
實施例1制備兔抗人p28GANK抗體1.RT-PCR法從人肝癌中克隆p28GANK基因1.1合成引物正向引物H15’-gcggatccagtagttgctgggacagc-3’其5’端引入BamHI酶切位點ggatcc反向引物H25’-cgctcgagcttgagtattaaacccagg-3’其5’端引入XhoI酶切位點ctcgag1.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈DNA人肝癌組織總RNA(按Life Technologies公司Trizol RNA純化試劑盒操作，1μg/μl)2μl，隨機(jī)六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脫氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)處理水2μl，5×第一鏈合成緩沖液4μl，二硫蘇糖醇DTT(0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制劑RNasin 1μl，RNA依賴DNA合成酶Superscript II1μl，總反應(yīng)體積為20μl，42℃水浴50分鐘，70℃滅活15分鐘后，將所得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
1.3以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增人p28GANK基因cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，脫氧核糖核苷酸dNTPs(10mmol/L)1μl，引物H1(10μmol/L)1μl，引物H2(10μmol/L)1μl，聚合酶Taqpolymerase 0.5μl，去離子水36.5μl，總反應(yīng)體積為50μl。PCR程序為94℃變性4分鐘；94℃ 40秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共35個循環(huán)；72℃延伸8分鐘。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化回收PCR產(chǎn)物。
1.4構(gòu)建p28GANK基因誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pProEX-HTb-p28GANK以BamHI和XhoI分別雙酶切6×組氨酸融合表達(dá)載體pProEX-HTb(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)和上述純化的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠分離，用QIAGEN公司膠回收試劑盒回收酶切DNA片段，然后將酶切純化后的pProEX-HTb載體和PCR酶切純化的DNA，以分子數(shù)比為1∶5，加入T4連接酶緩沖液2μl，加T4連接酶2u(5u/μl)，補(bǔ)去離子水至總反應(yīng)體積20μl，置22℃水浴連接過夜，65℃滅活酶10分鐘。
1.5構(gòu)建工程菌HT-p28并鑒定重組質(zhì)粒按常規(guī)，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂氨芐青霉素LB平板，37℃孵箱過夜，挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)后抽取質(zhì)粒DNA，用BamHI/XhoI進(jìn)行酶切，測序鑒定。鑒定結(jié)果所獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒為pProEX-HTb-p28GANK，其相應(yīng)的工程菌為HT-p28。
2.p28GANK蛋白的表達(dá)與純化按常規(guī)將上述工程菌HT-p28用0.6mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時后，按德國QIAGEN公司組氨酸標(biāo)記蛋白純化試劑盒提供的操作說明書純化p28GANK蛋白。簡要步驟如下取少量HT-p28工程菌接種于20ml LB(含氨芐青霉素100mg/ml)培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。按1％的接種量將過夜培養(yǎng)的菌種于1升的LB(含氨芐青霉素100mg/ml)培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至光吸收值OD600nm約0.5～0.7，然后加入終濃度為0.6mM的IPTG，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時后，4℃下6,000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。細(xì)菌沉淀用裂解液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑，10mM β-巰基乙醇，10％甘油，1mg/ml溶菌酶)10ml重懸，在冰浴上超聲10分鐘×3次，再在4℃下13,000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。離心后上清與1ml 50％(V/V)Ni-NTa懸液混合，4℃慢搖1小時，然后將全部液體上純化柱，收集流出液。以沖洗液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，10mM β-巰基乙醇，10％甘油)10ml×3洗柱。最后用洗脫液(50mMNaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑，10mM β-巰基乙醇，10％甘油)1ml×5洗脫六組氨酸融合蛋白，收集蛋白洗脫樣品液。取10μl蛋白樣品液加入10μl上樣緩沖液(100mM Tris-Cl pH6.8，200mM二硫蘇糖醇，4％十二烷基硫酸鈉，0.2％溴酚蘭，20％甘油)，100℃變性3分鐘，上樣10％聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。電泳圖譜如圖2所示，其中標(biāo)號1為細(xì)菌裂解液；2為上柱流出液；3為洗柱液；4～7為蛋白依次洗脫液。由圖2看出，純化的p28GANK蛋白條帶位置正確，純度較高，得率也能滿足下一步免疫家兔所需用量。
3.p28GANK多克隆抗體的制備、純化與鑒定多克隆抗體的制備按《分子克隆實驗指南》介紹的方法進(jìn)行。取上述p28GANK蛋白2mg溶于1.5ml生理鹽水，與等體積的完全弗氏佐劑(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)乳化后，在新西蘭大白兔的背部皮內(nèi)選擇5個點分點注射。首次免疫后3周，對新西蘭大白兔分別進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，每次間隔2周。每次劑量為p28GANK蛋白1mg溶于1.5ml生理鹽水，與等體積的非完全弗氏佐劑(Gibco/BRL，Life Technologies，NY)乳化后注射。第三次加強(qiáng)免疫后一周，取兔耳緣靜脈血1ml，確定效價達(dá)到1∶32以上。再在第三次加強(qiáng)免疫后第10天進(jìn)行頸動脈插管取血，取盡，將血液置4℃ 24小時，先吸取析出的兔血清，再將余血于4℃，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層血清。將血清分裝后，-80℃保存。
利用固定于硝纖膜上的抗原親和純化p28GANK特異性抗體，具體步驟如下p28GANK抗原樣品100μg上樣10％SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素NC膜，麗春紅染色，標(biāo)出p28GANK抗原帶位置。剪下抗原帶，1×TBS洗去染料，以5％脫脂奶粉(1×TBS配制)封閉2小時后，與兔抗血清(1∶20稀釋)室溫孵育3小時，轉(zhuǎn)入1×PBS(1％Tween-20)中漂洗10分鐘×3次，再用1×PBS漂洗10分鐘×2次。取一塑料平皿，在底部平鋪parafilm膜，將NC膜放于其上，在NC膜上滴加洗脫緩沖液(0.2mol/L甘氨酸pH2.8，1mmol/L EGTA)200μl，置于濕盒中，室溫20分鐘。收集全部洗脫液置1.5ml離心管，加入1/10體積1mol/LTris堿(pH10)，1/10體積10×PBS，1/10體積2％BSA，1/100體積4％疊氮鈉。換新鮮抗血清繼續(xù)上述操作，分次收集洗脫抗體。
用Western blotting鑒定純化抗體的特異性，按《分子克隆實驗指南》介紹的方法進(jìn)行，純化p28GANK抗體稀釋度為1∶50。結(jié)果見圖3，其中各抗原分別為，1BSA抗原，24His-p28GANK抗原，5SK-Hep1細(xì)胞裂解液，6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的HEK293細(xì)胞系裂解液，7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Myc-p28GANK的HEK293細(xì)胞系裂解液。所用抗體分別為，1，2，5～7用p28GANK抗體(1∶50)；3用預(yù)先與His-p28GANK抗原孵育后的p28GANK抗體；4用預(yù)先與BSA抗原孵育后的p28GANK抗體。p28GANK抗體能特異性識別p28GANK抗原，這種特異性反應(yīng)可以被p28GANK抗原的預(yù)先結(jié)合而中止。p28GANK抗體也能特異性識別真核細(xì)胞裂解液中表達(dá)的p28GANK抗原。
實施例2p28GANK抗體鑒別診斷肝細(xì)胞性肝癌免疫組化采用美國DAKO公司生產(chǎn)的試劑盒DAKO EnVision System(DAKOCorporation，carpinteria，USA)，按常規(guī)操作進(jìn)行，具體步驟如下1.制作肝癌組織免疫組化所用切片取人肝癌組織塊1cm×1cm×1cm，按常規(guī)石蠟包埋，以5μm厚度切片。石蠟切片60℃烤箱過夜后，按以下流程脫蠟入水，二甲苯(1)10分鐘→二甲苯(2)10分鐘→二甲苯(3)10分鐘→100％乙醇5分鐘→95％乙醇5分鐘→85％乙醇5分鐘→75％乙醇5分鐘→雙蒸水5分鐘。
2.免疫組化染色切片用3％H2O2甲醇液處理，室溫放置20分鐘后，用雙蒸水洗5分鐘×3次。行抗原修復(fù)，切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液中煮沸5分鐘，?；?0分鐘，再煮沸5分鐘，自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5分鐘×3次。37℃下用1％牛血清白蛋白(BSA)封閉30分鐘，甩去封閉液，不洗，直接加本發(fā)明p28GANK抗體(一抗，1∶10)，置濕盒中37℃30分鐘，然后置4℃冰箱16小時。取出后，室溫復(fù)溫15分鐘，然后用0.01mol/L PBS洗5分鐘×3次。滴加DAKO羊抗兔二抗(DAKOCorporation，carpinteria，USA)，37℃45分鐘，用0.01mol/L PBS洗5分鐘×4次，DAB顯色2～10分鐘后，用0.01mol/L PBS洗1次，蘇木素復(fù)染10秒，置自來水返藍(lán)，置蒸餾水浸泡。切片脫水透明，中性樹膠封片，蓋玻片覆蓋。
3.觀察結(jié)果(1)肝細(xì)胞性肝癌癌組織和相應(yīng)癌旁組織的免疫組化染色結(jié)果見圖4。圖4顯示染色陽性區(qū)域集中在肝細(xì)胞胞漿，間質(zhì)淋巴細(xì)胞為陰性。癌組織(HCC)染色強(qiáng)度較同一病例癌旁組織(Para-HCC)為強(qiáng)。
(2)肝細(xì)胞性肝癌的免疫組化與伊紅-蘇木素染色對照結(jié)果見圖5。由圖5看出，左圖為肝細(xì)胞染色陽性，膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、Kuffer氏細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞染色陰性。右圖為同一標(biāo)本連續(xù)性切片的伊紅-蘇木素(H&E)染色。
(3)膽管細(xì)胞性肝癌的免疫組化染色結(jié)果見圖6。顯示為陰性染色。
(4)轉(zhuǎn)移性肝癌的免疫組化染色結(jié)果見圖7。圖中顯示來自結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移灶染色陰性，癌旁肝組織染色陽性。
上述結(jié)果說明，p28GANK抗體在人肝細(xì)胞肝癌中染色陽性，而在人膽管細(xì)胞性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌中的表達(dá)皆為陰性。在組織特異性上有較好的肝細(xì)胞特異性染色，而膽管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、Kuffer氏細(xì)胞和肝間質(zhì)細(xì)胞染色均為陰性。
本發(fā)明p28GANK抗體能較好地識別肝細(xì)胞來源的肝細(xì)胞性或肝膽管細(xì)胞混合性肝癌，并將它們與膽管細(xì)胞性或轉(zhuǎn)移性肝癌區(qū)分開來。在臨床肝癌的病理診斷中有實際應(yīng)用價值，也可以和其它肝癌標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，提高肝癌診斷的準(zhǔn)確率，以便針對相應(yīng)的肝癌類型制定合適的治療方案。
表1p28GANK蛋白氨基酸序列表MEGCVSNLMVCNLAYSGKLEELKESILADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTEIVEFLLQLGVPVNDKDDAGWSPLHIAASAGRDEIVKALLGKGAQVNAVNQNGCTPLHYAASKNRHELAVMLLEGGANPDAKDHYEATAMHRAAAKGNLKMIHILLYYKASTNIQDTEGNTPLHLACDEERVEEAKLLVSQGASIYIENKEEKTPLQVAKGGLGLILKRMVEG表2p28GANK蛋白抗原氨基酸序列表MEGCVSNLMVCNLAYSGKLEELKESILADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTEIVEFLLQLGVPVNDKDDAGWSPLHIAASAGRDEIVKALLGKGAQVNAVNQNGCTPLHYAASKNRHEIAVMLLEGGANPDAKDHYEATAMHRAAAKGNLKMIHILLYYKASTNIQDTEGNTPLHLACDEERVEEAKLLVSQGASIYIENKEEKTPLQVAKGGLGLILK
權(quán)利要求
1.一種兔抗人p28GANK抗體的制備方法，包括如下步驟(1)合成引物正向引物H15’-gcggatccagtagttgctgggacagc-3’反向引物H25’-cgctcgagcttgagtattaaacccagg-3’(2)用人肝癌組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈DNA；(3)以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物H1和H2PCR擴(kuò)增人p28GANK基因cDNA；(4)構(gòu)建p28GANK基因誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pProex-HTb-p28GANK；(5)構(gòu)建工程菌HT-P28；(6)用工程菌HT-P28表達(dá)并純化p28GANK蛋白；(7)用p28GANK蛋白免疫家兔，使產(chǎn)生兔抗人p28GANK抗體；(8)由免疫兔血清制備兔抗人p28GANK抗體。
2.權(quán)利要求1所述制備方法所制得的兔抗人p28GANK抗體。
3.權(quán)利要求2所述兔抗人p28GANK抗體用于制備肝癌鑒別診斷試劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，是臨床上肝癌病理鑒別診斷中對肝細(xì)胞性肝癌進(jìn)行確認(rèn)的一種新的檢記物兔抗人p28
文檔編號G01N33/574GK1513876SQ0311682
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者王紅陽, 傅驍勇, 譚璐, 劉淑琴, 吳孟超 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)