專利名稱：克百威速測金標免疫試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用膠體金標記顯色的免疫層析法快速檢測蔬菜瓜果等農產品中的農藥殘留試紙條，尤其是一種克百威速測金標免疫試紙條。屬于農藥殘留的免疫化學速測技術領域。
背景技術：
近年來，由于使用受到有機磷和氨基甲酸酯類農藥污染的蔬菜，而造成急性中毒的事件屢有發生，農產品安全問題已日益受到人們重視。各種農藥速測技術及其產品在中國、韓國、泰國等國家和地區已得到大力推廣，但其中仍有一些明顯的缺陷與不足目前用于有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留檢測的酶抑制紙片產品，只能對果蔬的農藥殘留作粗略的定性鑒別，不能定量分析，方法重現性差，假陽性、假陰性事件層出不窮；此外酶抑制紙片還受到溫度與濕度的局限，容易失效，導致“錯案”時有發生，造成菜農受損失，市民不放心，也給相關的主管部門增添了麻煩。而ELISA試劑盒雖然在準確度和重現性上作了改進，其使用過程中的反復洗滌，使操作顯得繁雜，不能實現真正意義上的一步法現場速測。
經對現有技術的文獻檢索發現中國專利申請號為02139704.x，名稱為“半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的試紙條及生產和使用方法”，該項專利申請的技術方案是這樣描述的本檢測試紙條由底板、玻璃纖維紙、免疫層析復合膜即硝酸纖維或醋酸纖維膜、膠體金標記得鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶合物、鹽酸克倫特羅克隆抗體及吸水紙組成。該項專利申請又稱它是一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反映，用以快速檢測動物各種組織、尿液、體液及飼料中的鹽酸克倫特羅的殘留物的檢測試紙。該項專利申請沒有描述該“檢測試紙條”的具體的結構特征，使得該專利申請的技術不清楚，同時該專利申請的“檢測試紙條”不能用于對克百威農藥殘留進行速測。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種克百威速測金標免疫試紙條。使其成為一種便于現場操作，快速準確，特異性強，靈敏度高的克百威農藥殘留速測試紙條。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括樣品墊、固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、克百威-OVA結合物測試線、羊抗鼠IgG質控線、吸水玻璃纖維膜、塑料底板，其連接方式為塑料底板的兩端分別設置樣品墊和吸水玻璃纖維膜，中間設置硝酸纖維膜，硝酸纖維膜上靠近樣品墊一端噴涂克百威-OVA結合物測試線，靠近吸水玻璃纖維膜一端噴涂羊抗鼠IgG質控線，連接樣品墊和硝酸纖維膜之間噴涂有膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜。
先用Airjet定量噴頭在玻璃纖維膜上噴涂膠體金標記克百威單抗。再用Biojet微定量噴頭在硝酸纖維膜上噴涂兩條平行線。靠近樣品墊一端的線上噴涂克百威-OVA結合物，作為測試線；靠近吸水玻璃纖維膜一端的線上噴涂羊抗鼠IgG，作為質控線。將硝酸纖維膜放入1％牛血清白蛋白(BSA)中包被30分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，37℃干燥3小時。
最后將硝酸纖維膜、固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜、樣品墊自下至上依次粘貼于塑料底板上。硝酸纖維膜與固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜交叉重疊。樣品墊與固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜交叉重疊。將吸水玻璃纖維膜粘貼于塑料底板，并與硝酸纖維膜交叉重疊。
本發明的原理是待測樣品根據層析原理，經試紙條S端，向另一端移動，先后依次經過噴有膠體金標記克百威單克隆抗體的玻璃纖維膜和噴有克百威-OVA結合物測試線及羊抗鼠IgG控制線的硝酸纖維膜。若待測樣品中克百威含量超標，則樣品中的克百威農藥就會和硝酸纖維膜測試線上的克百威-OVA結合物一起競爭性地與玻璃纖維膜上的金標克百威單克隆抗體結合。由于金標克百威單抗受到了樣品中克百威農藥的抑制，無法與測試線上的克百威-OVA結合物反應，從而無法使金顆粒凝集顯色；若樣品中克百威含量不超標，則金標克百威單抗不受競爭性抑制而與測試線上的克百威-OVA結合物反應后，使得金顆粒凝集顯色。硝酸纖維膜上的羊抗鼠IgG控制線是為檢驗金標免疫層析方法本身是否有效而設定的。控制線顯色，則說明試紙條的檢測結果有效；反之，則失效。
本發明具有實質性特點和顯著進步，與市場上現用的速測試紙條相比，本發明具有以下顯著優點檢測速度快完成一次檢測只需10分鐘，能滿足現場速測的需求；雙重保險除了試紙條能檢測農藥殘留外，同時羊抗鼠IgG控制線可檢測速測試紙條本身是否失效，避免了假陽性和假陰性現象的發生；攜帶方便、操作簡便無需專業人員操作。在菜場、超市、食堂、家庭等各場所，普通用戶借助使用說明即能完成現場速測；靈敏度高、特異性強，制備工藝簡單，成本低。
圖1本發明結構示意圖具體實施方式
如圖1所示，本發明包括樣品墊1、固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜2、硝酸纖維膜3、克百威-OVA結合物測試線4、羊抗鼠IgG質控線5、吸水玻璃纖維膜6、塑料底板7，其連接方式為塑料底板7的兩端分別設置樣品墊1和吸水玻璃纖維膜6，中間設置硝酸纖維膜3，硝酸纖維膜3上靠近樣品墊1一端噴涂克百威-OVA結合物測試線4，靠近吸水玻璃纖維膜6一端噴涂羊抗鼠IgG質控線5，連接樣品墊1和硝酸纖維膜3之間噴涂有膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜2。
將硝酸纖維膜3、固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜2、樣品墊1自下至上依次粘貼于塑料底板7(5×60mm)上。硝酸纖維膜3與固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜2交叉重疊2mm。樣品墊1與固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜2交叉重疊4mm。將吸水玻璃纖維膜6粘貼于塑料底板7，并與硝酸纖維膜3交叉重疊2mm。
以下提供應用實例應用實例一將3條試紙條S端分別插入5mg/L、0.5mg/L和0.05mg/L的克百威農藥標準樣品中，停留5秒后取出平放，或用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液體樣品，10分鐘后觀察試紙條顏色變化。結果測試克百威濃度為5mg/L和0.5mg/L的試紙條上測試線不顯色，控制線上出現紫紅色條帶，表示陽性；而測試克百威濃度為0.05mg/L的試紙條的測試線和控制線上均出現紫紅色條帶，表示陰性。
應用實例二將采集大棚中施有過量克百威農藥的生菜葉片，剪成1cm2的碎片，放入提取緩沖液中震蕩5分鐘。把試紙條樣品墊浸入緩沖液中達5秒鐘后取出平放，10分鐘后觀察結果，只有控制線呈紫紅色條帶，測試線不顯色，表示測試結果為陽性。
應用實例三采集蔬菜種植基地的土壤樣品，放入提取緩沖液中，劇烈震蕩5分鐘，測定方法如實施例二，若試紙條上出現二條紫紅色條帶，則結果為陰性；若只有控制線上出現紫紅色條帶，則結果為陽性。
權利要求
1.一種克百威速測金標免疫試紙條，包括樣品墊(1)、硝酸纖維膜(3)、吸水玻璃纖維膜(6)、塑料底板(7)，其特征在于，還包括固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)、克百威-OVA結合物測試線(4)、羊抗鼠IgG質控線(5)，其連接方式為塑料底板(7)的兩端分別設置樣品墊(1)和吸水玻璃纖維膜(6)，中間設置硝酸纖維膜(3)，硝酸纖維膜(3)上靠近樣品墊(1)一端噴涂克百威-OVA結合物測試線(4)，靠近吸水玻璃纖維膜(6)一端噴涂羊抗鼠IgG質控線(5)，連接樣品墊(1)和硝酸纖維膜(3)之間噴涂有膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)。
2.根據權利要求1所述的克百威速測金標免疫試紙條，其特征是將硝酸纖維膜(3)、固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)、樣品墊(1)自下至上依次粘貼于塑料底板(7)上。
3.根據權利要求1所述的克百威速測金標免疫試紙條，其特征是硝酸纖維膜(3)與固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)交叉重疊。
4.根據權利要求1所述的克百威速測金標免疫試紙條，其特征是樣品墊(1)與固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)交叉重疊。
5.根據權利要求1所述的克百威速測金標免疫試紙條，其特征是將吸水玻璃纖維膜(6)粘貼于塑料底板(7)，并與硝酸纖維膜(3)交叉重疊。
全文摘要
一種克百威速測金標免疫試紙條。屬于農藥殘留的免疫化學速測技術領域。本發明包括樣品墊、固載膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、克百威－OVA結合物測試線、羊抗鼠IgG質控線、吸水玻璃纖維膜、塑料底板，其連接方式為塑料底板的兩端分別設置樣品墊和吸水玻璃纖維膜，中間設置硝酸纖維膜，硝酸纖維膜上靠近樣品墊一端噴涂克百威－OVA結合物測試線，靠近吸水玻璃纖維膜一端噴涂羊抗鼠IgG質控線，連接樣品墊和硝酸纖維膜之間噴涂有膠體金標記克百威單抗的玻璃纖維膜。本發明具有實質性特點和顯著進步，檢測速度快，具有雙重保險，攜帶方便、操作簡便。靈敏度高、特異性強，制備工藝簡單，成本低。
文檔編號G01N33/531GK1445547SQ0311669
公開日2003年10月1日 申請日期2003年4月29日 優先權日2003年4月29日
發明者周培, 陸貽通, 李斌, 周軍 申請人:上海交通大學