一種測定鱟試劑靈敏度的方法

專利名稱：一種測定鱟試劑靈敏度的方法
技術領域：
本發明涉及細菌內毒素的檢測，具體地說是一種測定鱟試劑靈敏度的方法。
背景技術：
細菌內毒素(Bacterial Endotoxin)是革蘭氏陰性細菌所產生的具有各種生物活性的大分子物質，其主要化學成分為脂多糖(LPS)；內毒素是注射劑藥品(原料等)中的主要污染物質。
細菌內毒素的檢測方法有家兔試驗法、鱟試驗法。鱟試驗法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL，或Tachypleus Amebocyte Lysate，TAL)是利用鱟試劑與內毒素發生凝集反應的機理，以定性或定量檢測藥品或機體血液中的感染細菌內毒素的一種體外檢測方法。采用產色或產螢光的肽型化合物，用于分析內毒素，化合物結構R1-A1-A2-A3-A4-B-R2，R2代表產色或產螢光基團；內毒素激活LAL的酶，酶水解肽型化合物生成顏色[文獻1.美國專利名稱為Peptide-type substrates useful in the quantitative determination ofendotoxin.專利號為US4510241]；利用內毒素的脂多糖與多粘菌素或八肽或類似的環肽的相互作用來測定內毒素，環肽或脂多糖上標記酶以供進一步檢測[文獻2.歐洲專利名稱為Endotoxin assay.專利號為EP0265127]；用于鱟試劑測定用的肽型化合物，結構X-A1-A2-A3-B-R，A1-A2-A3是氨基酸，B是酰胺混合物，R與鱟試劑反應釋放后產生氨基，進一步形成可見顏色[文獻3.歐洲專利名稱為Peptide substrates and method for thequantitative assay ofendotoxin.專利號為EP0228666]；一種用鱟血液變形細胞溶解物的試劑，及其測定含絲氨酸蛋白酶樣品中內毒素的方法[文獻4.中國專利名稱為用于內毒素測定的試劑以及使用該試劑進行測定的方法，專利號為ZL94103286.8]；用于內毒素特異性鑒別的含有鱟變形細胞溶解物試劑和烷基葡糖苷的試劑，及使用該試劑特異性鑒別樣品中內毒素的方法[文獻5.中國專利名稱為用于內毒素特異性鑒別的試劑，專利號為ZL94117898.6]；一種鱟試劑細菌內毒素快檢盒及使用方法，是按細菌內毒素檢查法所需的鱟試劑、內毒素、溶解液、移液滴管等有關用具經特殊處理后，分套包裝成試劑盒，簡化實驗操作[文獻6.中國專利名稱為鱟試劑細菌內毒素快檢盒及使用方法，專利號為ZL95115774.4]；一種鱟試劑的活性定向生產工藝，制得鱟試劑不易受污染，靈敏度高，自身空白陰性觀察時間長，產品穩定性高[文獻7.中國專利專利號為ZL95105652.2]；一種通過鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應實現對水中細菌毒素含量進行限量測定的儀器[文獻8.中國專利名稱為一種細菌內毒素測定儀，專利號為ZL95216488.4]，它具有結構簡單、成本低廉、操作方便、檢測判定結果可靠以及符合藥典規定等諸多優點。
利用動態比濁法和動態比色法原理，可以采用儀器來定量測定內毒素的濃度C，即在鱟試劑反應過程中，觀察其濁度變化曲線或產色物質的顏色變化曲線，預設一個吸光度OD值如OD0.02或拐點，以反應曲線從開始上升到該預設值時經歷的時間作為反應時間(T(OD0.02)或T50，秒)，該反應時間的對數與內毒素濃度的對數呈線性關系，即標準曲線為LogT(OD0.02)＝a+b LogC或者Log T50＝a+b LogC，通過與標準曲線的比較來計算樣品中的內毒素濃度。國內外常用的相應的檢測儀器有美國LAL-5000型、日本和光Toxinometer ET-201系列、國內金山川EDS-98，MB-80系列檢測系統及天大BET-32系列檢測系統。
采用鱟試驗法，不管是定性還是定量測定內毒素的含量，鱟試劑靈敏度的準確性是至關重要的；常規的鱟試劑靈敏度的測定方法是限量法分別進行預測定和正式測定，需要將細菌內毒素工作標準品等比稀釋為至少4個濃度，每個濃度做4個管，所用標準品多，試驗準備耗時長；反應保溫時間為60±2分鐘，反應時間長；觀察結果用目測法，容易出現人為誤差；內毒素的回收率在50-200％之間，范圍寬。

發明內容
本發明的目的是，提供一種測定鱟試劑靈敏度的方法，以準確、快速地測定鱟試劑的靈敏度，解決了測定鱟試劑靈敏度的方法穩定性問題。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為1)采用同一個濃度的標準內毒素，在內毒素測定儀上，分別對不同靈敏度的標準鱟試劑進行重復試驗，得到相應的特征反應時間的均值和標準差；2)待測靈敏度的鱟試劑，與同一個濃度的標準內毒素反應并得到相應的特征反應時間，將該反應時間與不同靈敏度的標準鱟試劑的反應時間的均值和標準差進行比較，判斷并得到待測鱟試劑的靈敏度。
內毒素測定儀是采用動態比濁法或動態比色法定量測定內毒素，得到相應的不同靈敏度鱟試劑的相應的反應時間的均值和標準差；所述動態比濁法為OD限值法、透光率限值法或T50歸一化法；標準鱟試劑靈敏度范圍最好為0.01～0.5EU/ml；未知鱟試劑的靈敏度范圍最好在0.01～0.5EU/ml；待測靈敏度的鱟試劑，與一個或多個濃度的標準內毒素反應，得到相應的反應時間，該反應時間為200～8000秒；最好為470～3600秒。
本發明具有如下優點1.快速。本發明采用定量法來測定鱟試劑的靈敏度，由于利用其定量測定的原理，采用同一個濃度的標準內毒素，在內毒素測定儀上，分別對不同靈敏度的標準鱟試劑進行重復試驗，得到相應的反應時間的均值和標準差，然后采用同一濃度的內毒素標準即可完成鱟試劑靈敏度的測定，試驗準備耗時短。另外，在內毒素測定儀器上，采用鱟試劑直接測定內毒素，最少試驗10分鐘即可得到相應的數據，用于鱟試劑靈敏度的計算，反應時間短。
2.準確。本發明可以利用已有的內毒素測定儀器，實現鱟試劑靈敏度的準確、定量化測定，計算的鱟試劑的靈敏度精確。觀察結果用儀器測定吸光度法，結果客觀、準確。
3.應用范圍廣。本發明可應用于動態比濁法和動態比色法，可望應用于科研、藥品生產檢驗、鱟試劑的生產過程監控和質量控制等，為藥品中內毒素的測定提供更科學、客觀的方法。


圖1為采用7.3EU/ml的內毒素標準品，分別與不同靈敏度的鱟試劑反應特征反應時間結果示意圖。
圖2為采用不同的內毒素標準品，分別與0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑反應特征反應時間結果示意圖。
具體實施例方式
實施例1.
1)單一濃度標準內毒素對不同鱟試劑的試驗采用標準內毒素濃度30EU/ml，分別對靈敏度為0.01EU/ml的標準鱟試劑進行三次重復試驗，得到相應的反應時間T(OD0.02)的均值及其標準差(1)350±80(秒)；采用標準內毒素濃度4.4EU/ml，分別對靈敏度為0.06EU/ml的標準鱟試劑進行五次重復試驗，得到相應的反應時間T(OD0.02)的均值及其標準差(2)775±50(秒)；采用標準內毒素濃度2.2EU/ml，分別對靈敏度為0.125EU/ml的標準鱟試劑進行三次重復試驗，得到相應的反應時間T(OD0.02)的均值及其標準差(3)1035±120(秒)；采用標準內毒素濃度4.4EU/ml，分別對靈敏度為0.25EU/ml的標準鱟試劑進行二次重復試驗，得到相應的反應時間T(OD0.02)的均值及其標準差(4)1100±71(秒)；采用標準內毒素濃度2.2EU/ml，分別對靈敏度為0.5EU/ml的標準鱟試劑進行七次重復試驗，得到相應的反應時間T(OD0.02)的均值及其標準差(5)1450±180(秒)；采用7.3EU/ml的內毒素標準品，分別與0.01、0.06、0.125、0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑反應，重復三次，得到特征反應時間，其平均值和標準差(秒)分別為480±14；590±20；637±12；937±21；(見圖1所示)采用22、7.3、3.7、1.8EU/ml EU/ml的內毒素標準品，分別與0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑反應，重復三次，得到特征反應時間，其平均值和標準差(秒)分別為450±20；590±20；877±15；1193±51；(見圖2所示)2)鱟試劑的靈敏度測定采用標準內毒素濃度4.4EU/ml，對待測鱟試劑1進行試驗，得到反應時間T(OD0.02)值為820秒，在(2)的反應時間范圍內，所以鱟試劑1的靈敏度是0.06EU/ml。
比較例1.
常規的鱟試劑靈敏度的測定方法是限量法，需要進行預測定和正式測定，需要將細菌內毒素工作標準品以2倍等比稀釋，選擇能出現陽性和陰性結果的4個邊界稀釋液，每一稀釋液作4個管，且其最高濃度的4個管應均為陽性、最低濃度的4個管應均為陰性，輕輕振動上述試管混勻內容物，封閉管口，置37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘觀察結果并按要求計算本批鱟試劑靈敏度(λ)，內毒素的回收率在50～200％之間；即將不同濃度的標準內毒素與鱟試劑在37℃保溫反應1小時，根據目測是否出現凝膠來判斷、計算鱟試劑靈敏度。
權利要求
1.一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于1)采用同一個濃度的標準內毒素，在內毒素測定儀上，分別對不同靈敏度的標準鱟試劑進行重復試驗，得到相應的特征反應時間的均值和標準差；2)待測靈敏度的鱟試劑，與同一個濃度的標準內毒素反應并得到相應的特征反應時間，將該反應時間與不同靈敏度的標準鱟試劑的反應時間的均值和標準差進行比較，判斷并得到待測鱟試劑的靈敏度。
2.按照權利要求1所述的一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于內毒素測定儀是采用動態比濁法或動態比色法定量測定內毒素，得到相應的不同靈敏度鱟試劑的相應的反應時間的均值和標準差。
3.按照權利要求2所述的一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于所述動態比濁法為OD限值法、透光率限值法或T50歸一化法。
4.按照權利要求1所述的一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于標準鱟試劑靈敏度范圍為0.01～0.5EU/ml。
5.按照權利要求1所述的一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于未知鱟試劑的靈敏度范圍在0.01～0.5EU/ml。
6.按照權利要求1所述的一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于待測靈敏度的鱟試劑，與一個或多個濃度的標準內毒素反應，得到相應的反應時間，該反應時間為200～8000秒。
7.按照權利要求6所述的一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于所述反應時間為470～3600秒。
全文摘要
本發明涉及細菌內毒素的檢測，具體地說是一種測定鱟試劑的靈敏度的方法，1)采用同一個濃度的標準內毒素，在內毒素測定儀上，分別對不同靈敏度的標準鱟試劑進行重復試驗，得到相應的特征反應時間的均值和標準差；2)待測靈敏度的鱟試劑，與同一個濃度的標準內毒素反應并得到相應的特征反應時間，將該反應時間與不同靈敏度的標準鱟試劑的反應時間的均值和標準差進行比較，判斷并得到待測鱟試劑的靈敏度。本發明的優點是快速、準確、應用范圍廣。
文檔編號G01N33/52GK1536364SQ03111399
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月9日 優先權日2003年4月9日
發明者李京華, 邵英光, 王俊德 申請人:中國科學院大連化學物理研究所