專利名稱：重組幽門螺桿菌熱休克蛋白60的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組幽門螺桿菌熱休克蛋白60。
背景技術(shù)：
受幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的后果是萎縮性胃炎和消化性潰瘍，粘性、產(chǎn)酸或產(chǎn)胃蛋白酶的胃上皮細(xì)胞變性，被視為癌前期損害。胃癌居全球第二，發(fā)生的全部胃癌中約有60％大概是幽門螺桿菌感染的結(jié)果(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。許多工業(yè)化國家中受到感染的人有20％以上在其一生中患上胃潰瘍或十二指腸潰瘍；這類常見的胃-十二指腸疾病必被視為傳染病并需適當(dāng)治療(Alper，1993)。因此，可以采用防止幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的預(yù)防性療法(例如，免疫接種)以及消除已發(fā)生的幽門螺桿菌感染的療法來治療這類常見的胃-十二指腸疾病。
細(xì)菌從口攝入后，首先到達(dá)極酸的胃腔(pH1-2)中。并借助于腔(pH1-2)和上皮細(xì)胞表面(Ph6-7)之間的pH梯度進(jìn)行自身定向。它們通常生活在竇區(qū)的深腺(deepcrypts)中，在此免受如酸、胃蛋白酶這樣的外界影響，也免受如抗生素這樣的藥物對其進(jìn)行的清除。部分菌群(約20％)與上皮細(xì)胞、特別是產(chǎn)粘液細(xì)胞密切相關(guān)。在胃化生的條件下即在十二指腸中由酸誘發(fā)的胃上皮形成的條件下，十二指腸中的化生區(qū)也被移生；這就產(chǎn)生了十二指腸潰瘍發(fā)展的前提。隨流出的粘液完全排出大概受到其粘附能力的阻礙，這樣細(xì)菌就可以存活幾年、幾十年或者甚至一生(慢性感染)。
用解酸劑或H2-受體拮抗劑進(jìn)行治療的，雖然能抑制胃壁細(xì)胞分泌酸，通常能治愈潰瘍，但卻不能由此消除潰瘍病。
更為常用的潰瘍療法是鉍處理。各種鉍鹽(CBS、BSS)對幽門螺桿菌都有殺菌效果。但僅在8-32％的病例中達(dá)到完全清除細(xì)菌的效果。這種處理表面上造成細(xì)菌的暫時抑制，但停止處理后多數(shù)病例中感染會再次發(fā)作。用高劑量長期治療會導(dǎo)致這些物質(zhì)在肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)中的積累，具有相當(dāng)大的神經(jīng)學(xué)副作用(Malfertheiner，1994)。
也有用抗生素消除病原體。然而，用各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin紅霉素a.o)進(jìn)行單獨治療已被證實并不令人滿意，因為甚至在這種情況下僅有0-15％病例會根除細(xì)菌。目前，把酸阻斷劑(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)結(jié)合使用達(dá)到最成功的治療效果，這種療法使清除率達(dá)80％(Malfertheiner，1994)。不過，用抗生素治療消除幽門螺桿菌并不是有前途的長期治療方案，因為細(xì)菌會迅速產(chǎn)生對抗生素的耐性。
受幽門螺桿菌感染會導(dǎo)致胃粘膜的慢性炎癥反應(yīng)(胃炎)。另外，誘發(fā)對幽門螺桿菌抗原的特異性全身免疫反應(yīng)；不過，分泌性抗體(slgA)在胃中的形成尚未得到無可爭議的闡述。發(fā)炎的結(jié)果是在胃粘膜和亞粘膜中存在多種免疫細(xì)胞，例如多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(Blaser，1992)。此外，幽門螺桿菌在體外激活嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(Mai等，1991)。用特異性抗體和補體進(jìn)行的實驗表明，在體外嗜中性白細(xì)胞使幽門螺桿菌迅速失活。
目前根除HP的主要手段是抗菌療法，但有相當(dāng)?shù)木窒扌?。免疫預(yù)防已成為防治HP感染最有效的方法之一。
在HP的免疫防治研究方面，目前已有以尿素酶B為主的多種HP抗原作為疫苗候選抗原，但效果均不理想。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種運用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌熱休克蛋白60基因，并構(gòu)建載體對其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，免疫原性高的基因重組幽門螺桿菌熱休克蛋白60。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化；及(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列。
除了序列號1所示核苷酸序列和遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)與該序列相應(yīng)的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發(fā)明包括在些洗滌條件下與序列號1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)的相應(yīng)核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA分子最好編碼能粘附到人細(xì)胞上，特別是人胃上皮細(xì)胞上的多肽。此外，本發(fā)明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號1所示核苷酸序列有至少70％、特別優(yōu)選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長度最好至少為45個核苷酸，優(yōu)選至少50個核苷酸。
本發(fā)明的又一個目的是含本發(fā)明DNA分子的至少一個拷貝的載體。該載體可以是最好在表達(dá)信號(啟動子、操縱基因、增強子等)控制下本發(fā)明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載以及象質(zhì)粒這樣的染色體外載體，而環(huán)狀質(zhì)粒載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細(xì)胞的載體(例如，質(zhì)粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發(fā)明的又一目的是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是原核細(xì)胞、優(yōu)選革蘭氏陰性的原核細(xì)胞、特別優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。不過，另一方面，本發(fā)明的細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，例如真菌細(xì)胞(如酵母)、動物或植物細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽。該多肽最好能粘附人細(xì)胞，并且包括(a)序列號1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽最好與序列號1所示核苷酸序列有至少90％的同源性，最優(yōu)選至少98％的同源性。
本發(fā)明的多肽最好通過下述方法生產(chǎn)用本發(fā)明的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽形式的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽也可作免疫原來產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明多肽的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質(zhì)的本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體，選擇性地含有常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發(fā)明的藥用組合物可用于診斷幽門螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門螺桿菌感染。對治療應(yīng)用而言，將多肽或其片斷用于產(chǎn)生主動疫苗，或?qū)⒖贵w用于產(chǎn)生被動疫苗。
本發(fā)明具有運用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌熱休克蛋白60基因，并構(gòu)建載體對其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，免疫原性高及具有佐劑作用等優(yōu)點。
在小鼠和人類的分枝桿菌感染模型中，Hsp60的免疫應(yīng)答處于優(yōu)先地位，特別表現(xiàn)在Hsp60成為抗體和T細(xì)胞應(yīng)答的免疫優(yōu)勢靶抗原，HpHsp60是防治Hp的優(yōu)秀商苗候選成分。國內(nèi)尚未見有關(guān)HpHsp60的研究報道。本發(fā)明對Hsp60的目的基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)并研究了其免疫原性。
蛋白電泳分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)相對分子量為60×103量大小一致，凝膠自動掃描分析，其Hsp60重組蛋白占菌體總蛋白的27.2％，其中可溶性表達(dá)占上清的14.7％，純化后的Hsp60純度約達(dá)80％。
動物實驗顯示了幽門螺桿菌Hsp60具有佐劑的作用。在目前以尿素酶B亞單位為主的多種候選抗原防治Hp感染效果的不確定性的情況下，將HpHsp60納入Hp疫苗成分，既可作為多價疫苗，又解決了CT或LT作為佐劑價格昂貴和具有潛在毒性的缺點。
另外，動物實驗也發(fā)現(xiàn)HpHsp60保護(hù)率可達(dá)90％，表明HpHsp60是制備Hp疫苗的種新抗原。
圖1是本發(fā)明的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖2是本發(fā)明的重阻質(zhì)粒PET-22b(+)/Hsp60的雙酶鑒定圖譜，圖3是本發(fā)明的Hsp60重組蛋白的SDS-PAGE分析圖，圖4是序列表。
具體實施例方式
下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的作進(jìn)一步的詳述如圖1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長度至少為45個核苷酸；(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，產(chǎn)生多肽的方法，載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質(zhì)的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用，(d)藥用組合物用于多價疫苗。
利用基因克隆技術(shù)對熱休克蛋白60的基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)并研究了其免疫防治作用。
1材料與方法1.1質(zhì)粒和菌株菌株BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-22b(+)和幽門螺桿菌SS1為第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院消化研究所保存。
1.2工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶NotI、NcoI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購自New EnglandBiolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/EcoR I+Hind III購自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購自Promega公司，測序質(zhì)粒純化試劑盒購自美國Qiagen公司，其它試劑為國產(chǎn)分析純。
1.3 Hp染色體DNA的提取從固體培養(yǎng)基上刮取生長良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見參考文獻(xiàn)[1]。
1.4質(zhì)粒的提取及純化質(zhì)粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見參考文獻(xiàn)[2]。
1.5目的基因的PCR擴(kuò)增設(shè)計引物，在其5′端加上合適的限制性酶切位點，由博亞公司合成。序列如下熱休克蛋白6015′-TG GCC ATG GAT GGG CCA AGA GGC AGG AAT-3′NcoI熱休克蛋白6025′-AG TGC GGC CGCCAT CAT GCC GCC CAT G-3′NotI熱啟動法進(jìn)行PCR，95℃變性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。
1.6DNA片段的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定質(zhì)粒和目的基因DNA經(jīng)NotI和NcoI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。
1.7序列測定及分析堿裂解法大量抽提經(jīng)雙酶切鑒定的重組克隆質(zhì)粒，用自動測序儀進(jìn)行序列分析。
1.8誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳熱休克蛋白60陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9動物實驗對已經(jīng)感染幽門螺桿菌的小鼠通過黏膜途徑給予熱休克蛋白60，觀察治療作用。對未感染幽門螺桿菌的小鼠先通過黏膜途徑給予熱休克蛋白60，然后再用幽門螺桿菌進(jìn)行攻擊，觀察保護(hù)作用。
2結(jié)果2.1熱休克蛋白60基因的擴(kuò)增PCR結(jié)果電泳分析發(fā)現(xiàn)在1500bp左右有一條帶，大小與預(yù)計相符，結(jié)果見圖1。
2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)NotI和NcoI雙酶切后，定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質(zhì)粒命名為pET-22b(+)/熱休克蛋白60。經(jīng)NotI和NcoI雙酶切后的重組質(zhì)粒電泳，結(jié)果見圖2。
2.3熱休克蛋白60基因片段的序列分析直接以重組質(zhì)粒pET-22b(+)/熱休克蛋白60為模板進(jìn)行測序，得到了克隆片段的DNA序列，自動測序儀序列分析結(jié)果見后(圖4)。
2.4熱休克蛋白60基因在大腸桿菌中的表達(dá)熱休克蛋白60陽性克隆株在LB培養(yǎng)液(含100ug/ml氨芐青霉素)中37℃過夜培養(yǎng)，然后按1％轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值為0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心收集菌體，取其周質(zhì)的滲透休克液、菌體超聲后的上清以及沉淀進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)相對分子量為60×103白60重組蛋白占菌體總蛋白的27.2％，其中可溶性表達(dá)占上清的14.7％，包涵體部分占沉淀的76.6％。
2.5動物實驗熱休克蛋白60的治療和保護(hù)有效率均為100％。
參考文獻(xiàn)[1]Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manua 1.2nded.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.35。
Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.顏子穎，王海林譯。精編分子生物學(xué)指南。北京科學(xué)出版社，1998.39。
權(quán)利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1號所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.如權(quán)利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長度至少為45個核苷酸。
4.如權(quán)利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化。
5.多肽，其特征在于它由權(quán)利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.如權(quán)利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列。
7.產(chǎn)生權(quán)利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權(quán)利要求1～3之一的DNA分子或權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。
8.權(quán)利要求5～6之一的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質(zhì)的權(quán)利要求1～3之一的DNA分子、權(quán)利要求5～6之一的多肽或者權(quán)利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用，(d)藥用組合物用于多價疫苗。
全文摘要
重組幽門螺桿菌熱休克蛋白60，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明具有運用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌熱休克蛋白60基因，并構(gòu)建載體對其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，免疫原性高的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK1654474SQ0310989
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
發(fā)明者張亞歷, 王繼德, 但漢雷, 白楊, 張振書, 周殿元 申請人:南方醫(yī)院