專利名稱：重組幽門螺桿菌血型抗原粘附素的制作方法
技術領域：
本發明涉及幽門螺桿菌粘附素，特別是一種重組幽門螺桿菌血型抗原粘附素。
背景技術：
長期以來，人們已知人胃粘膜中存在螺形菌(Bizzozero，1893)。不過，直到Marshall和Warren從胃潰瘍患者的胃粘膜中成功地分離出并培養這種細菌時，人們才認識到它們是致病性細菌這一事實(Warren和Marshall，1983；Marshall等，1984)。最初的分析表明，分離出的微生物是革蘭氏陰性螺形菌，它具有極高的游動性和能在強酸性條件下(約達pH1.5)存活的非凡能力。這些最初被稱為幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori)的細菌最終根據生化和形態特征歸入新確立的“螺桿菌(Helicobacter)”屬(Goodwin等，1989)。
幾年來，從Taylor和Blaser(1991)所做的流行病學研究表明，幽門螺桿菌感染在全球范圍內發生，約有50％人口受到這種細菌感染，發展中國家比工業化國家的感染率更高。并隨年齡的提高，慢性幽門螺桿菌感染的概率急劇增大。因此，慢性幽門螺桿菌感染是人類最常見的慢性細菌感染之一。
目前已經知道，這種感染不可避免地導致人類細菌性胃炎(B型胃炎)的誘發。另外，還假設幽門螺桿菌在胃潰瘍和十二指腸潰瘍以及某些形式的胃癌(腺癌)的發展中起誘因作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。更少見被視為免疫系統B細胞瘤的先兆的胃MALT(粘膜相關淋巴組織)淋巴瘤大概也是幽門螺桿菌感染的結果。對這類病人進行的能成功根除幽門螺桿菌的抗菌治療導致胃潰瘍和低級MALT淋巴瘤的治愈(Spponen和Hyvarinen，1993；Isaacson和Spencer，1993；Stolte和Eidt，1993)。
長期受幽門螺桿菌感染的一個后果是萎縮性胃炎，粘性、產酸或產胃蛋白酶的胃上皮細胞變性，被視為癌前期損害。根據1980年對全球最常見癌癥類型的統計結果，胃癌位居第二，但有下降趨勢(Parkin等，1988)。研究表明了幽門螺桿菌感染和胃癌發生(腸型)之間的統計學顯著相關性；兩者得出的結論都是，發生的全部胃癌中約有60％大概是幽門螺桿菌感染的結果(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。Sipponen(1992)所做的進一步研究表明，許多工業化國家中受到感染的人有20％以上在其一生中患上胃潰瘍或十二指腸潰瘍；而對胃粘膜正常的人而言，這種危險性小得可以忽略。這類常見的胃-十二指腸疾病必被視為傳染病并需適當治療(Alper，1993)。消除已發生的慢性幽門螺桿菌門螺桿菌感染的一項療法會治愈胃炎、胃潰瘍或十二指腸潰瘍或者MALT淋巴瘤。因此，可以采用防止幽門螺桿菌感染的預防性療法(例如，免疫接種)以及消除已發生的幽門螺桿菌感染的療法來治療這類常見的胃-十二指腸疾病。
細菌從口攝入后，首先到達極酸的胃腔(pH1-2)中。在此，通過產生脲酶這種酶使細菌可能存活，所述脲酶造成已有脲的分解，從而引起胃中酸性pH值的局部中和。借助趨化定向和依賴于鞭毛的游動性，微生物再移動到胃竇區的碳酸氫鹽緩沖的粘膜層，它們在此處于獨特的生態小境中，由于酸性屏障作用，只有幾種競爭性細菌能進入該生態環境。為到達上皮，微生物大概借助于腔(pH1-2)和上皮細胞表面(Ph6-7)之間的pH梯度進行自身定向。由于其螺形、其在粘膜的游動性、粘膜修飾酶的產生及其微需氧的生活方式，這些細菌最佳地適應了該棲所中的生活條件。
它們通常生活在竇區的深腺(deep crypts)中，在此免受如酸、胃蛋白酶這樣的外界影響，也免受如抗生素這樣的藥物對其進行的清除。部分菌群(約20％)與上皮細胞、特別是產粘液細胞密切相關。在胃化生的條件下即在十二指腸中由酸誘發的胃上皮形成的條件下，十二指腸中的化生區也被移生；這就產生了十二指腸潰瘍發展的前提。隨流出的粘液完全排出大概受到其粘附能力的阻礙，這樣細菌就可以存活幾年、幾十年或者甚至一生(慢性感染)。
在知道幽門螺桿菌的存在和其對潰瘍病的意義之前，是用所謂的解酸劑或H2-受體拮抗劑進行治療的。雖然能抑制胃壁細胞分泌酸，通常能治愈潰瘍，但卻不能由此消除潰瘍病。
更為常用的潰瘍療法是鉍處理。各種鉍鹽(CBS、BSS)對幽門螺桿菌都有殺菌效果。但僅在8-32％的病例中達到完全清除細菌的效果。這種處理表面上造成細菌的暫時抑制，但停止處理后多數病例中感染會再次發作。用高劑量長期治療會導致這些物質在肝、腎和神經系統中的積累，具有相當大的神經學副作用(Malfertheiner，1994)。
受幽門螺桿菌感染會導致胃粘膜的慢性炎癥反應(胃炎)。另外，誘發對幽門螺桿菌抗原的特異性全身免疫反應，發炎的結果是在胃粘膜和亞粘膜中存在多種免疫細胞，例如多形核白細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞(Blaser，1992)。此外，幽門螺桿菌在體外激活嗜中性白細胞、單核細胞和巨噬細胞(Mai等，1991)。用特異性抗體和補體進行的實驗表明，在體外嗜中性白細胞使幽門螺桿菌迅速失活。
發明內容
本發明的目的就是針對上述現有技術的不足之處，提供一種運用PCR技術克隆幽門螺桿菌血型抗原基因并構建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞的重組幽門螺桿菌血型抗原粘附素。
本發明的目的是這樣實現的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)它編碼一種能粘附人細胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉化；及(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發生免疫交叉反應的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細胞。
除了序列號1所示核苷酸序列和在遺傳密碼簡并性范圍內與該序列相應的核苷酸序列之外，本發明還包括在嚴格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發明包括在些洗滌條件下與序列號1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡并性范圍內的相應核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發明的DNA分子最好編碼能粘附到人細胞上、特別是人胃上皮細胞上的多肽。此外，本發明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號1所示核苷酸序列有至少70％、特別優選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長度最好至少為45個核苷酸，優選至少50個核苷酸。
本發明的又一個目的是含本發明DNA分子的至少一個拷貝的載體。該載體可以是最好在表達信號(啟動子、操縱基因、增強子等)控制下本發明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載體以及象質粒這樣的染色體外載體，而環狀質粒載體是特別優選的。
本發明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細胞的載體(例如，質粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發明的又一目的是用本發明載體轉化的細胞。在一優選實施方案中，該細胞是原核細胞、優選革蘭氏陰性的原核細胞、特別優選大腸桿菌細胞。不過，另一方面，本發明的細胞也可以是真核細胞，例如真菌細胞(如酵母)、動物或植物細胞。
本發明還涉及由本發明DNA分子編碼的多肽。該多肽最好能粘附人細胞，并且包括(a)序列號1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發生免疫交叉反應的氨基酸序列。
本發明的多肽最好與序列號1所示核苷酸序列有至少90％的同源性，最優選至少98％的同源性。
本發明的多肽最好通過下述方法生產用本發明的DNA分子或載體轉化一種細胞，在多肽能得以表達的條件下培養轉化的細胞，從細胞或/和培養物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽以及非融合多肽形式的本發明多肽。
本發明的多肽也可用作免疫原來產生抗體。因此，本發明還涉及抗本發明多肽的抗體。
本發明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質的本發明的DNA分子、本發明的多肽或本發明的抗體，選擇性地含有常見藥用輔助物質、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發明的藥用組合物可用于診斷幽門螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門螺桿菌感染。對治療應用而言，將多肽或其片斷用于產生主動疫苗，或將抗體用于產生被動疫苗。
蛋白電泳分析結果發現，經誘導后高效表達相對分子量為78 000的蛋白，凝膠自動掃描分析，其重組黏附素血型抗原蛋白占菌體總蛋白的34.8％，其中分泌表達占周質總蛋白的22.7％，可溶性表達占上清的15.0％，包涵體占沉淀的86.7％。
動物實驗表明重組黏附素血型抗原蛋白是制備Hp疫苗的一種新抗原。同時，體外黏附實驗證實重組黏附素血型抗原的抗血清可阻止幽門螺桿菌黏附于胃黏膜上皮細胞。
本發明具有運用PCR技術克隆幽門螺桿菌血型抗原基因，并構建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞和提高免疫原性等優點。
圖1是本發明的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖2是本發明的重阻質粒PET-22b(+)/血型抗原粘附素的雙酶鑒定圖譜，圖3是本發明的血型抗原粘附素重組蛋白的SDS-PAGE分析圖，圖4是序列表。
具體實施例方式
下面將結合附圖和實施例對本發明的作進一步的詳述如圖1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長度至少為45個核苷酸；(a)它編碼一種能粘附人細胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發生免疫交叉反應的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細胞。產生多肽的方法，載體轉化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養轉化的細胞，并從細胞或/和培養物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產生抗體的應用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應用，(c)藥用組合物用于生產防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應用。
利用基因克隆技術對血型抗原黏附素的基因進行了克隆和表達并研究了其免疫防治作用。
1材料與方法1.1質粒和菌株菌株BL21(DE3)、質粒pET-22b(+)和幽門螺桿菌SS1為第一軍醫大學南方醫院消化研究所保存。
1.2工具酶及試劑限制性內切酶NotI、NocI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購自New EnglandBiolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準λDNA/EcoR I+Hind III購自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購自Promega公司，測序質粒純化試劑盒購自美國Qiagen公司，其它試劑為國產分析純。
1.3Hp染色體DNA的提取從固定培養基上刮取生長良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見參考文獻[1]。
1.4質粒的提取及純化質粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見參考文獻[2]。
1.5目的基因的PCR擴增設計引物，在其5’端加上合適的限制性酶切位點，由博亞公司合成。
序列如下血型抗原黏附素15’ -TG GCC ATG GAT AAA AAA CAC ATC CTT TCA-3’NcoI血型抗原黏附素25’ -AG TGC GGC CGC ATA AGC GAA CAC ATA G-3’NotI熱啟動法進行PCR，95℃變性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35個循環后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。
1.6DNA片段的酶切、連接、轉化和陽性克隆的鑒定質粒和目的基因DNA經NotI和NotI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。
1.7序列測定及分析堿裂解法大量抽提經雙酶切鑒定的重組克隆質粒，用自動測序儀進行序列分析。
1.8誘導表達和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳血型抗原黏附素陽性克隆經IPTG誘導表達后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9動物實驗對已經感染幽門螺桿菌的小鼠通過黏膜途徑給予血型抗原黏附素，觀察治療作用。對未感染幽門螺桿菌的小鼠先通過黏膜途徑給予血型抗原黏附素，然后再用幽門螺桿菌進行攻擊，觀察保護作用。
1.10光鏡定量計數法測定粘附活性MGC-803細胞接種于帶蓋玻片的6孔板中培養至形成單細胞層，取出蓋玻片，PBS漂洗1次后將陽性克隆株或空載體克隆株懸液(109CFU/ml)滴至蓋玻片上，37℃濕盒內孵育40min，用PBS漂洗6次以去除未粘附細菌，自然干燥，固定，Gram染色，油鏡下觀察MGC-803與細菌的粘附作用，計算每個細胞周圍粘附的細菌數，重復3次，取平均值，每份標本共隨機計數30個細胞，結果以均數±標準差表示。
1.11統計學處理采用SPSS7.0軟件中的獨立樣t檢驗。P＜0.01為差異有顯著性意義。
2結果2.1血型抗原黏附素基因的擴增
PCR結果電泳分析發現在2200bp左右有一條帶，大小與預計相符，結果見圖1。
2.2重組質粒的構建及酶切鑒定將PCR產物經NotI和NocI雙酶切后，定向插入經同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質粒命名為pET-22b(+)/血型抗原黏附素。經NotI和NocI雙酶切后的重組質粒電泳，結果見圖2。
2.3血型抗原黏附素基因片段的序列分析直接以重組質粒pET-22b(+)/血型抗原黏附素為模板進行測序，得到了克隆片段的DNA序列，自動測序儀序列分析結果見后(圖4)。
2.4血型抗原黏附素基因在大腸桿菌中的表達將血型抗原黏附素陽性克隆株在LB培養液(含100ug/ml氨芐表霉素)中37℃過夜培養，然后按1％mmol/L，誘導表達3h，離心收集菌體，取其周質的滲透休克液、菌體超聲后的上清以及沉淀進行10％SDS-PAGE電泳分析(圖3)。結果發現，經誘導后高效表達相對分子量為78kD的蛋白，與預期分子量大小一致，凝膠自動掃描分析，其重組血型抗原黏附素蛋白占菌體總蛋白的34.8％，其中分泌表達占周質總蛋白的22.7％，可溶性表達占上清的15.0％，包涵體占沉淀的86.7％。
2.5動物實驗血型抗原黏附素的治療和保護有效率均為100％。
2.6光鏡黏附實驗結構與空載體克隆株處理組相比，陽性克隆株處理組細胞周圍細菌數明顯增多(p<0.01>，其差異具有顯著性。光鏡黏附實驗結果表明血型抗原黏附素具有黏附作用。
參考文獻[1]Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manual[M].
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Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.顏子穎，王海林澤。精編分子生物學指南[M]。
北京科學出版社，199839。
權利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.權利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長度至少為45個核苷酸。
4.權利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)它編碼一種能粘附人細胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉化。
5.多肽，其特征在于它由權利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.權利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發生免疫交叉反應的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細胞。
7.產生權利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權利要求1～3之一的DNA分子或權利要求4的載體轉化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養轉化的細胞，并從細胞或/和培養物上清液中分離出多肽。
8.權利要求5～6之一的多肽作為免疫原產生抗體的應用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質的權利要求1～3之一的DNA分子、權利要求5～6之一的多肽或者權利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應用，(c)藥用組合物用于生產防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應用。
全文摘要
重組幽門螺桿菌血型抗原粘附素，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發明具有運用PCR技術克隆幽門螺桿菌血型抗原基因并構建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞的優點。
文檔編號G01N33/68GK1654471SQ03109888
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月17日 優先權日2002年4月11日
發明者張振書, 張亞歷, 白楊, 王繼德, 陳燁, 賴卓勝, 林煥健, 周殿元 申請人:南方醫院