專利名稱：一種檢測環境內分泌干擾物的試劑盒與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測環境內分泌干擾物的試劑盒與應用，特別涉及鯽魚卵黃蛋白原ELISA試劑盒與其在環境內分泌干擾物檢測中的應用。
背景技術：
當前，環境當中的內分泌干擾物所引起的生物異常現象已經引起了人們的廣泛重視。經過近年的調查、研究證實，目前的環境激素主要包括農藥類、重金屬、二噁英、多氯聯苯、多環芳烴等人工合成的，本身或其代謝物具有雌激素效應的化學物質和天然激素兩大類。根據研究狀況，可將其分成已知的內分泌干擾物、未知的內分泌干擾物和可疑的內分泌干擾物。在作用對象方面，內分泌干擾物分別會對生物體的雌激素、雄激素、甲狀腺激素、胰島素、糖皮質激素、腎上腺皮質激素等正常激素的分泌以及它們在機體內的作用產生干擾，從而直接干擾或損害生物體的代謝、神經、生殖、免疫系統，使得生物體的免疫能力降低、生殖出現異常以及引發代謝酶失活，從而使代謝發生阻礙、內分泌發生紊亂，進一步影響生物體的個體健康和導致環境當中存在的生物種群發生變動，最終威脅到人類的本身生存。在作用機理方面，環境內分泌干擾物主要通過以下四種途徑干擾生物體的正常內分泌系統，使生物體正常代謝發生紊亂1)與生物體內激素受體結合；2)影響激素的正常代謝；3)改變生物體內的激素受體的數目；4)影響生物體內激素的合成、貯存、釋放、運輸與分解。當前的工農業生產中產生的大量人工合成的化學物質，具有使用量大、暴露途徑多樣、在環境中難降解等特點，在各主要的內分泌干擾物質研究中，均已將人工合成化學物質列入優先檢測對象。但是在生產中卻未對其可能具有的內分泌干擾作用進行檢測，對環境的潛在威脅性非常大。
從化學物質中篩選出具有內分泌干擾作用的物質，檢測環境中是否存在這些內分泌干擾物質，這些物質的污染對水生生物造成什么樣的影響等都是目前科學家們比較關心的問題。內分泌干擾物質的篩選和檢測方法包括儀器檢測和生物檢測。儀器檢測是非常準確可靠的手段，具有十分有效的選擇性，并且靈敏度非常高。例如當前在環境檢測中應用的GC/GC-MS、LC/LC-MS、CE等，可以有效地分析出環境當中已知具有內分泌干擾作用的化學物質，如農藥類的PCBs、DDT、DDE等，和工業中廣泛應用的非離子表面活性劑，如烷基酚類等。隨著大量新型化學物質的使用，一些新方法也正在開發和應用，以檢測那些可能具有內分泌干擾作用的物質。但是由于內分泌干擾物在環境中的濃度很低，進行直接檢測存在諸如步驟繁瑣和樣品需要量大(如分析水樣時常常需幾升)，運行費用高等問題。并且，儀器檢測結果只能反映某種特定內分泌干擾物作用水平的高低，而對于各種內分泌干擾物所引起的生物效應難以進行有效檢測和評價。生物體外方法如利用酵母雙雜交系統進行的生物體外實驗只能反映某種物質對生物特定內分泌的干擾效應，而對于環境多介質下整個生物體機能所受影響卻難以進行有效反映。因此亟待建立一種簡單、高效、靈敏的生物體內檢測方法，并和儀器分析有機結合，從整個生物體的角度來反映內分泌干擾物對生物體的影響，從而對生態環境是否被環境雌激素污染及其可能帶來的生態效應進行有效的診斷。
卵黃蛋白原是正常成熟雌魚所具有的特異性蛋白，當雌魚性腺開始發育時會分泌大量的雌二醇，在雌二醇的作用下肝臟合成和分泌卵黃蛋白原，通過血液循環進入卵巢，再經過濾泡細胞的轉運，最后由卵母細胞本身形成的微絨毛的微胞飲作用攝入卵質內。由肝臟產生的卵黃蛋白原作為IV時相卵母細胞的卵黃先質，作為胚胎發育的前期營養物質。這一形成過程在正常雄性魚類以及幼體生物(性成熟前)則不會產生。但是如果雄性及幼魚受到外來環境類雌激素的作用，由于其肝臟上具有雌激素受體，所以同樣會在體內產生卵黃蛋白原。并且卵黃蛋白原的產生不受時間、魚的種類、年齡的影響。因此，卵黃蛋白原可以作為診斷水生生物暴露類雌激素類物質下的一個重要生物標志物。
ELISA方法是根據抗原--抗體間的特異性結合，將酶標記在抗體/抗原分子上，形成酶標抗體/酶標抗原，即為酶結合物。該酶結合物在酶的催化作用下發生水解、氧化反應，生成有色產物。酶結合物的活性與產物呈現的色澤濃度成正比，并反映被測抗原的量，根據顏色的有無和深淺，來定位或定量抗原。根據所產生抗原水平，就可以判斷水域環境中環境激素的存在水平及其可能帶來的生態影響。
發明創造內容本發明的目的是提供一種較靈敏地檢測環境中內分泌干擾物的試劑盒。
一種檢測環境內分泌干擾物的試劑盒，它包括包被在酶標板上的鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體和鯽魚卵黃蛋白原抗原。
為了更方便現場操作，所述試劑盒還包括氧化劑和顯色劑，二抗和酶標抗原，以及終止液、洗滌液和質控血清。
所述魚卵黃蛋白原多克隆抗體為魚卵黃蛋白原兔多克隆抗體；所述酶標記為辣跟過氧化物酶。
所述魚卵黃蛋白原優選為鯽魚卵黃蛋白原。
所述酶標板可以是96孔單條酶標板，也可以是雙條可拆酶標板。
制備本發明鯽魚卵黃蛋白原ELISA試劑盒的方法是首先將制備的鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體包被于單條或雙條可拆酶標板上，使用BSA封閉后，置于4℃條件下保存、備用；然后，將誘導、提純制備的鯽魚卵黃蛋白原抗原與等量的甘油混合置于-20℃下保存；將上述抗原、抗體共同包裝。其中，所述鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備，是將鯽魚卵黃蛋白原注射到動物體內，自動物血清中提取多克隆抗體。所述標記酶為辣跟過氧化物酶。所述動物優選為兔子。
用本發明試劑盒檢測環境內分泌干擾物的方法是選擇水域當中的鯽魚現場采樣，將組織材料固定并抽血，取血清，用上述試劑盒進行測定、分析樣品中可能含有的鯽魚卵黃蛋白原。
本發明巧妙地利用鯽魚卵黃蛋白原ELISA反應機理，提供了一種簡便、高效、靈敏地檢測環境中內分泌干擾物的方法。相對于儀器分析，該卵黃蛋白原ELISA試劑盒分析方法操作簡便、快速，沒有特殊的儀器要求，樣品需要量少，從而大大降低了分析成本。對于一些不具備大型分析儀器的實驗室而言具有廣泛的應用前景，也為檢測我國水域環境中環境激素的類雌激素效應的普遍調查提供了重要的分析手段；相對于其它的生物種而言，鯽魚在我國分布十分廣泛，并且適應能力極強，幾乎在各個水域均有分布，因此為環境激素的調查取材提供了極大的方便，為判斷不同水域環境激素水平及其影響提供了不可缺少的生物材料。用本發明的試劑盒還可以分析判斷水域中生物體的健康所受到的影響以及環境激素對生態可能造成的影響。
下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。
圖1為鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體標準曲線。
具體實施例方式
實施例1、鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備將鯽魚卵黃蛋白原經弗氏完全佐劑(一免)和弗氏不完全佐劑(二免、三免、四免)乳化后注射到兔子的腳墊、淋巴結、背部皮下多點等部位，劑量為一免1mg/ml/只，每10天一次，共免疫四次；免疫完成后自兔子頸動脈放血，4℃靜止3-4小時，離心4500rpm/min，30min，4℃，得上層血清，保存于-80℃超低溫冰箱中。采用飽和硫酸銨沉淀法提純抗體，提純抗體經PBS、4℃條件下透析24小時以上，中間換液3-4次。用BaCL2檢測無沉淀產生。然后將抗體定容，分裝，保存在-80℃冰箱中。
實施例2、鯽魚卵黃蛋白原ELISA試劑盒的制備。
首先將制備的鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體包被于單條或雙條可拆酶標板上，使用BSA封閉后，置于4℃條件下密封以保存、備用。然后，將實驗室誘導、提純制備的鯽魚卵黃蛋白原利用辣跟過氧氫物酶標記，將標記的抗原與等量的甘油混合至于-20℃下保存。將上述抗體、抗原、顯色底物(優選為TMB)、酶底物(優選為過氧化氫)、二抗、終止液(優選為硫酸)、洗滌液(優選為0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)、質控血清(無污染的鯽魚血清)包裝得到試劑盒，試劑盒中每種試劑分別為鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體稀釋1000倍包被；鯽魚卵黃蛋白酶標抗原標準濃度為10、100、200、300、400、500、600和700ng/ml各1ml；未標記抗原標準濃度1g/ml為100 1(稀釋50倍使用)；顯色底物為1ml(稀釋10倍使用)；酶底物為TMB；二抗為羊抗兔多抗(稀釋1000-2000倍使用)；終止液為5ml；洗滌液為5ml(稀釋100倍使用)；質控血清為100 1(稀釋10倍使用)。
實施例3、鯽魚卵黃蛋白原ELISA試劑盒用于進行環境內分泌干擾物污染水平調查在進行環境內分泌干擾物污染水平調查時，對環境生物樣品(鯽魚)進行檢測。選擇水域當中的鯽魚現場采樣，將組織材料固定并抽血，立即靜至、離心處理，取血清(或血漿)保存在低溫保溫箱中帶回實驗室進行處理、分析(如有條件可將鯽魚帶回實驗室進行活體處理)。
采用本發明鯽魚卵黃蛋白原ELISA試劑盒對鯽魚血清(或血漿)進行測定，分析樣品中可能具有的卵黃蛋白原。測定樣品時，將標準濃度的卵黃蛋白原(未用酶標記)、辣跟過氧化物酶標記的鯽魚卵黃蛋白原、質控血清和待測樣品同時加入酶標板中共同競爭有限的抗體結合位點。反應結束后洗掉未結合抗原，加入酶底物進行反應，然后用酶標儀(450nm)比色測定結合上有酶活性的抗原-抗體復合物從而來測定樣品中卵黃蛋白原，通過與標準系列抗原相比較，得出樣品中卵黃蛋白原的含量(以高于陰性對照2倍以上視為陽性)。
通過本試劑盒，可以快速、靈敏的檢測鯽魚血清(或血漿)中可能含有的卵黃蛋白原，大約只需要3-4小時就可以得出結果，靈敏度可達6.25ng/ml。其檢測效能如圖1所示，圖1中VTG即為鯽魚卵黃蛋白原。結果表明該方法的線性范圍在6.25-700ng/ml，回收率在91.1-104.4％之間。測定時所需要的樣品量(血清或者血漿)非常少，大約100 l左右即可。
權利要求
1.一種檢測環境內分泌干擾物的試劑盒，它包括包被在酶標板上的鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體和鯽魚卵黃蛋白原抗原。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括氧化劑和顯色劑。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括二抗和酶標抗原。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括終止液、洗滌液和質控血清。
5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括終止液、洗滌液和質控血清。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體為鯽魚卵黃蛋白原兔多克隆抗體。
7.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記為辣跟過氧化物酶。
8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標板為96孔單條或雙條可拆酶標板。
9.權利要求1-8所述試劑盒在環境內分泌干擾物檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測環境內分泌干擾物的試劑盒與應用，目的是提供一種較靈敏地檢測環境中內分泌干擾物的試劑盒。一種檢測環境內分泌干擾物的試劑盒，它包括包被在酶標板上的鯽魚卵黃蛋白原多克隆抗體和鯽魚卵黃蛋白原抗原。本發明可以靈敏、快速地檢測出水域當中可能存在的環境激素及其對生物的綜合污染水平，應用非常廣泛。
文檔編號G01N33/577GK1521507SQ03102118
公開日2004年8月18日 申請日期2003年2月8日 優先權日2003年2月8日
發明者胡建英, 郭振泉, 鄧寶山, 安立會, 孫曉航 申請人:北京大學