細胞毒蛋白及該細胞毒蛋白的利用的制作方法

專利名稱：細胞毒蛋白及該細胞毒蛋白的利用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的由幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生成的細胞毒蛋白(M毒素，粘膜層破壞毒素)及該細胞毒蛋白的用途。
背景技術：
一直以來認為許多人由于幽門螺旋桿菌而患胃炎、胃潰瘍和胃癌。然而在這些疾病最初時導致胃上皮細胞破壞和不可逆性細胞死亡的明確直接的細胞毒性因子一直未被確定。在胃中改變pH環境和免疫反應的因子、通過幽門螺旋桿菌粘附于胃上皮細胞的因子或細菌本身的運動特性一直被認為是發展為此類疾病的因素。然而，引發胃炎、胃潰瘍和胃癌的胃粘膜破壞是在那一個過程中被破壞的，或者導致胃粘膜破壞的直接因素是什么至今都還不清楚。僅具有細胞毒性的空泡毒素被分離，但是它具有弱細胞毒性和可逆細胞毒素活性。作為病原因子的關鍵性細胞毒因子，一直在體內或體外沒有被發現。
許多研究者推測，如上所述，處于體內胃環境中的幽門螺旋桿菌分泌胃粘膜細胞的直接細胞毒因子。考慮到疾病的重要性，在1996年其基因的所有序列被證實。然而，即使使用血清，由于具有困難的培養條件和純化條件的分離條件及不確定的毒素鑒定體系，所以不可能分離和鑒定到推測的毒素。
本發明欲解決的問題一個難題是找到造成由幽門螺旋桿菌感染而導致的胃炎、胃潰瘍和胃癌的蛋白，建立該毒素蛋白的大規模生成方法，鑒定新的M毒素和建立診斷和篩選方法。使用這些方法，期望控制造成胃粘膜細胞的細胞毒因子的毒素，研制胃炎、胃潰瘍、胃癌等的預防和治療試劑及發現使用該毒素的方法。

發明內容
本發明的發明人精心研究以解決以上提到的問題，并且當與通常條件不同的在與胃中環境相似的無血清條件下培養幽門桿菌時發現了一種導致不可逆性細胞死亡的新毒素。已發現該毒素每單位具有1000～100000倍的上述空泡毒素的毒力，并且它可以導致不僅包括胃上皮細胞而且也包括免疫細胞的各種溫血動物細胞的不可逆性細胞死亡。關于這些方面本發明的發明人已反復研究從而完成本發明。
即，本發明提供了以下內容。(1)含有與序列No.1表示的氨基酸序列具有至少70％或更高一致性的蛋白的細胞毒蛋白。(2)權利要求1中所述的細胞毒蛋白的部分肽，其特征在于該蛋白具有與序列No.1表示的氨基酸序列相同的細胞毒活性。(3)權利要求1或2的細胞毒蛋白，其中該蛋白由幽門螺旋桿菌生成。(4)權利要求1或2的細胞毒蛋白，其中該蛋白通過培養以重組載體轉化了的轉化體而被獲得，該重組載體含有編碼權利要求1或2的細胞毒蛋白的序列No.2的DNA。(5)權利要求4的細胞毒蛋白，其中該轉化體以FERM BP-8218的保藏號被保藏于國家先進工業科技研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(IPOD))。(6)含有權利要求1或2的細胞毒蛋白的抗腫瘤試劑。(7)通過對哺乳動物免疫權利要求1或2的細胞毒蛋白而獲得的該細胞毒蛋白的特異性單克隆抗體。(8)用保藏號為No.FERM BP-8222的雜交瘤細胞克隆生成的權利要求7的單克隆抗體。(9)用保藏號為No.FERM BP-8223的雜交瘤細胞克隆生成的權利要求7的單克隆抗體。(10)用保藏號為No.FERMBP-8224的雜交瘤細胞克隆生成的權利要求7的單克隆抗體。(11)通過對哺乳動物免疫權利要求1或2的細胞毒蛋白而獲得的該細胞毒蛋白的特異性多克隆抗體。(12)用于檢測和診斷權利要求1或2的細胞毒蛋白的方法，其中權利要求7～11中任意一項描述的單克隆抗體或多克隆抗體被使用。(13)用于預防和治療由權利要求1或2的細胞毒蛋白引發的胃癌、胃炎和胃潰瘍的試劑，其中權利要求7～11中任意一項描述的單克隆抗體或多克隆抗體被使用。(14)用于篩選促進或抑制權利要求1或2的蛋白的活性的化合物的方法，其中細胞增殖抑制活性、細胞毒活性或細胞死亡通過使用溫血動物細胞的陰性或陽性對照組之間的比較而被判斷。(15)用于篩選促進或抑制權利要求1或2的蛋白的活性的化合物或該化合物的鹽的試劑盒，其中包括權利要求1或2的蛋白。(16)促進或抑制權利要求1或2的蛋白的活性的化合物或該化合物的鹽，其中該化合物通過權利要求14的篩選方法或使用權利要求15的用于篩選的試劑盒被獲得。(17)含有化合物或該化合物的鹽的藥物，其中該化合物具有抑制具有權利要求1或2的蛋白質的溫血動物細胞的細胞毒活性的活性。(18)權利要求17的藥物，該藥物為用于預防或治療胃炎、胃潰瘍、胃癌和通過權利要求14的篩選方法或使用權利要求15的篩選試劑盒檢測出為由M毒素而導致的疾病的試劑。


圖1顯示實施例1中獲得的樣品的陰離子交換色譜。a顯示對于各組分(fraction)和洗脫蛋白質的吸光度的M毒素的活性。b顯示通過銀染在a的色譜中的組分16～組分22的SDS-PAGE。c顯示通過電印跡轉移到PVDF膜上的蛋白質毒素的帶。d和e分別顯示暴露于對照提取物和包括濃度為1nM的提取物的細胞毒素后24小時的HeLa細胞的形態變化。刻度條，50μm。
圖2顯示由實施例3獲得的基因重組毒素引起的細胞形態變化。a顯示6小時后HeLa細胞的陰性對照。b和c顯示加入5nM重組M毒素3小時后和6小時后的HeLa細胞。d顯示6小時后陰性對照的CRL7407(ATCC)正常人胃細胞。e和f顯示加入5nM重組M毒素3小時后和6小時后的CRL7407細胞。
圖3顯示實施例3中幾種癌細胞對M毒素的敏感性。該敏感性通過WST方法判定。X軸顯示培養基中M毒素的濃度，Y軸直接顯示415nm波長的吸光度或以陰性對照的吸光度為100％時的相對比率。HLF大鼠肝細胞瘤。colon 26小鼠結腸瘤。
圖4為如圖3中所示。T24人膀胱癌。OVK18人卵巢癌。KLM-1人胰腺癌。A-549人肺癌。Ca9-22人齒齦癌。CRL1500人乳腺癌。
圖5顯示實施例8中制備的單克隆抗體的蛋白質印跡實驗。所有的雜交瘤細胞的培養上清液的稀釋倍數為20倍。
圖6顯示實施例9中使用藻酸鈣作為吸附劑的M毒素活性。陰性對照只含有pH7.7的10mM Tris緩沖液作為培養基，而陽性對照含有培養基和10mM M毒素。X軸顯示通過藻酸鈣柱的各組分的編號。各組分的平均濃度為10nM。這些組分中的任意一個都表示至少10nM或更高。當紅血球被破壞時，溶液中血紅蛋白的濃度被提高。Y軸顯示415nm的吸光度。
在實施例10中，圖7顯示實施例10中通過活性炭的吸附而顯示M毒素抑制活性的HeLa細胞的存活百分率。X軸表示柱子的各洗脫組分編號。M毒素的濃度平均為10nM且任意一個組分濃度至少為10nM或更高。Y軸表示通過WST方法測得的各組分的毒性的值除以陽性對照所得的百分率。
圖8如圖7中所顯示。它顯示實施例10中在通過吸附顯示M毒素抑制活性的CM-纖維素和藻酸鈣的HeLa細胞中的存活百分率。
具體實施例方式
本發明的具有與序列No.1表示的氨基酸序列相同的氨基酸序列或基本相同的氨基酸序列的蛋白質可以是來源于幽門螺旋桿菌的菌株，如NCTC 11637、NCTC 11916、DT 61A、NCTC 11639、R85-13 6P、R85-13-12F、R85-13-11P、T81213-NTB、J99、4、U2-1、85D08、MC903、MC123、Tx30a、26695、UA 1182等的蛋白質，或者可以是合成蛋白質。
作為與序列No.1表示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可以舉出具有約70％或更高、優選約80％或更高、更優選約90％或更高、進一步更優選約95％或更高的同源性的氨基酸序列的例子。作為具有與序列No.1代表的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的蛋白質，可以舉出具有與具有序列No.1表示的氨基酸序列的蛋白質基本相同的氨基酸序列和基本相同的活性的蛋白質的例子。作為基本相同的活性的例子，細胞增殖抑制活性、細胞毒活性或導致細胞死亡的活性能夠被使用。基本相同意味著這些活性具有相同的性能，例如，在生理化學或藥理學方面。因此，優選細胞毒素等的活性具有相同的性能，例如，約0.1～100倍，優選地約0.5～10倍，更優選地約0.5～2倍。這些活性的程度或蛋白質分子量的數量因子可以不同。細胞增殖抑制活性、細胞毒活性或導致細胞死亡的活性的活性可以通過眾所周知的方法，例如，通過下述的篩選方法被判定。
作為本發明的蛋白質，以下蛋白可以被舉例在由序列No.1表示的氨基酸序列中刪除1～150個(優選地1～50個)氨基酸的氨基酸序列；在由序列No.1表示的氨基酸序列中增加1～100個(優選地1～30個)氨基酸的氨基酸序列；在由序列No.1代表的氨基酸序列中插入1～50個(優選地1～30個)氨基酸的氨基酸序列；在由序列No.1表示的氨基酸序列中1～50個(優選地1～30個)氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列；或者含有這些氨基酸序列的組合的蛋白質，被稱作粘蛋白。
如上所述當氨基酸序列被插入、刪除或取代時，插入、刪除或取代的位置不是特別地受限制的。
根據通常實踐，在本說明的蛋白中，左側為N末端(氨基末端)，右側為C末端(羧基末端)。在含有具有序列No.1所表示氨基酸序列的蛋白質的本發明的蛋白質中，C末端通常為羧基基團(-COOH)或羧化物(-COO-)，但是它可以是酰胺基(-CONH2)或酯基團(-COOR)，其中R為甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基等C1-6烷基基團，環戊基、環己基等C3-8環烷基基團，苯基、α-萘基等、苯甲基、苯乙基等C6-12芳香基基團，苯甲基、苯乙基等苯基-C1-2烷基基團，或者α-萘甲基等α-萘基-C1-2烷基基團的C7-14芳烷基基團。當本發明的蛋白質在除了C末端的其它位置處具有羧基(或羧化物)時，則本發明的蛋白質中含有具有酰胺基的或酯化的基團的蛋白質。作為酯，上述的C末端的酯可以被使用。在本發明的蛋白質中，進一步含有N末端處的氨基酸殘基(例如甲硫氨酸殘基)的氨基被保護基團(如甲酰基、乙酰基或相似的C1-6烷酰基基團等C1-6酰基基團)保護的蛋白質；在體內通過切割而生成的N末端的谷氨酸殘基被改變為吡咯谷氨酸基的蛋白質；分子中氨基酸側鏈上的取代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基團、吲哚基團、胍基等)被適當的保護基團(如甲酰基的C1-6烷酰基等的C1-6酰基基團等)保護的蛋白質；或結合有糖鏈的所謂糖蛋白的結合蛋白質等。
作為本發明的蛋白質的部分肽，可以是上述本發明的蛋白質的部分肽，優選地，該部分肽與本發明的蛋白質具有相似的活性(如細胞增殖抑制活性、細胞毒活性等)。作為例子，具有至少20％或更多，優選地50％或更多，更優選地70％或更多，進一步優選地90％或更多，最優選地95％或更多的本發明的氨基酸序列，和具有細胞增殖抑制活性、細胞毒活性或導致細胞死亡的活性的氨基酸序列的肽可以被使用。本發明的部分肽可以為以下肽在氨基酸序列中1～5個(優選1～3個)氨基酸被刪除；1～10個(優選1～5個(更優選1～3個))氨基酸被添加到氨基酸序列上；1～5個(優選1～3個)氨基酸被插入到氨基酸序列中；或者1～5個(優選1～3個)氨基酸被其它氨基酸取代。
盡管在如以上所示的本發明的蛋白質中，本發明的部分肽通常在C末端具有羧基(-COOH)或羧化物(-COO-)，但是C末端可以是酰胺(-CONH2)或酯(COOR)，其中R與上述意義相同。在本發明的部分肽中，進一步如以上本發明的蛋白質所示，含有N末端的氨基酸殘基(例如甲硫氨酸殘基)的氨基被保護基團保護的肽；在體內通過切割而生成的N末端的谷氨酸殘基被改變為吡咯谷氨酸基的蛋白質；分子中氨基酸側鏈上的取代基被適當的保護基團保護的蛋白質；或結合有糖鏈的所謂糖蛋白的結合蛋白質等。本發明的部分肽可以被用作構建抗體的抗原，因此細胞增殖抑制活性、細胞毒活性等不是必需的。
作為本發明的蛋白質或部分肽的鹽，生理上允許的酸(如無機酸或有機酸)或堿(如堿性金屬鹽)的鹽可以被使用，并且優選生理上允許的酸性加成鹽可以被使用。作為這種鹽，有無機酸(如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)，有機酸(如乙酸、甲酸、丙酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的鹽。本發明的蛋白質和鹽可以來自任意一種上述幽門螺旋桿菌株的蛋白質通過眾所周知的方法，或通過培養含有編碼后述蛋白質的DNA的轉化體而被制備。該蛋白質和鹽可以進一步根據后述用于合成肽的方法被制備。當從任意一種幽門螺旋桿菌株生成蛋白質時，細菌細胞內的蛋白質通過超聲波破碎被離心分離，然后經硫酸銨沉淀等提取，得到的提取液通過如離子交換色譜和疏水性色譜的組合色譜被純化和分離。
在本發明的蛋白質、部分肽、其鹽或其氨化物的合成中，用于合成蛋白質的市售樹脂可以被使用。作為用于此的樹脂，以下樹脂被舉例氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲基胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基芐醇樹脂、4-甲基二苯甲基胺樹脂、PAM樹脂、4-羥甲基甲基苯基乙酰氨甲基樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2’，4’-二甲氧苯基羥甲基)苯氧樹脂、4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc氨乙基)苯氧樹脂。使用這些樹脂，α-氨基和側鏈的功能基團被適當地保護的氨基酸通過眾所周知的縮合方法在樹脂上被縮合以符合期望的蛋白質序列。在反應最后，蛋白質從樹脂上被切下并且多個保護基團被去除。然后，所要的蛋白質或其氨化物在高稀釋溶液中通過用于形成內部二硫鍵的方法被獲得。關于上述被保護的氨基酸的縮合，數種用于蛋白質合成的活性試劑可以被使用，并且特別地，碳化二亞胺可以被使用。作為碳化二亞胺，DCC，N，N’-二異丙基碳化二亞胺、N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺等可以被使用。在通過這些碳化二亞胺活化時，被保護的氨基酸可以用控制外消旋的加成劑(如HOBt或HOOBt)一起被直接加入到樹脂中，或者它可以在前面被保護的氨基酸的活化之后作為對稱酸酐或者、HOBt酯或HOOBt酯被加入到樹脂中。
作為在被保護的氨基酸的活化或使用樹脂的縮合中所用的溶劑，該溶劑可以選自蛋白質縮合反應可用的已知溶劑。作為此類溶劑，酰胺如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮，鹵化烴如二氯甲烷和氯仿，醇如三氟乙醇，亞砜如二甲基亞砜、吡啶，醚類如二惡烷和四氫呋喃，腈如乙腈、丙腈，酯如乙酸甲酯和乙酸乙酯，及其混合物可以被使用。反應溫度適當地選自用于形成蛋白鍵的反應中可用的已知溫度范圍，并且通常，該溫度適當地選自-20℃～50℃。活化的氨基酸衍生物通常以1.5～4倍的摩爾當量被使用。作為水合茚三酮反應的檢測結果，當縮合不充分時，縮合反應可以在不去除保護基團的情況下被重復從而進行充分的縮合。當充分縮合通過反復反應不能被進行時，未反應的氨基酸用乙酸酐或乙酰咪唑乙酰化，因此后續反應沒有影響。
作為起始材料的氨基的保護基團，例如，Z、Boc、t-戊氧羰基、異冰片氧基羰基、4-甲氧芐氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷氧基羰基、三氟乙酰基、鄰苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯亞磺酰基、二苯基硫膦基、Fmoc等可以被使用。羧基可以被保護，如，通過烷基酯化(如，甲基、乙基、丙基、丁基、t-丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基和2-金剛烷基的直鏈、枝鏈或環鏈的烷酯化)，芳烷酯化(如苯甲酯、4-硝基苯甲酯、4-甲氧基苯甲基酯、4-氯苯甲基酯、二苯甲基酯)，苯甲酰甲基酯化，芐氧基羰基酰肼化，丁氧羰基酰肼化，三苯甲基酰肼化等被保護。絲氨酸的羥基基團可以被保護，如，通過酯化或醚化被保護。作為該酯化的適合的基團，例如，低級(C1-6)烷酰基如乙酰基，酰基基團如苯甲酰基團，或者由碳酸鹽衍生的基團如芐氧羰基和乙氧羰基可以被使用。作為適合于醚化的基團，苯甲基基團、四氫吡喃基和t-丁基可以被作為例子。作為酪氨酸的酚羥基的保護基團，如Bzl、C12-Bzl、2-硝苯甲基、Br-Z和t-丁基可以被使用。作為組氨酸的咪唑基的保護基，如Tos、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、芐氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc可以被使用。
作為起始材料的被活化的羧基，如對應的酸酐、疊氮化物和活化的酯(醇(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝苯酚、氰甲基醇、對硝基苯酚、HONB、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺和HOBt)的酯)可被使用。作為起始材料的被活化的氨基，如對應的磷胺可以被使用。作為用于去除(消除)被保護的基團的方法，如在Pd-黑或Pd-炭的催化劑存在的情況下在氫氣流中的催化還原；用無水氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或它們的混合物進行的酸處理；用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪(piperadine)等進行堿處理；或者在液態氨中用鈉還原，這些方法可以被使用。通過使用以上酸處理進行的消除反應通常在-20℃～40℃的溫度下被進行。在酸處理中，添加陽離子捕捉試劑如茴香醚、苯酚、硫茴香醚、間甲酚、對甲酚、二甲基硫、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇是有效的。被用作組氨酸的咪唑保護基的2，4-二硝苯基通過硫代苯酚處理而被去除。被用作色氨酸的吲哚保護基的甲酰基在以上1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在下通過酸處理被去除，而且進一步它可以用稀釋的氫氧化鈉溶液、稀釋的氨水等通過堿處理被去除。
不應該參與起始材料的反應的功能基團和被保護的基團的保護、被保護的基團的消除、參與反應的功能基團的活化等可以適當地選自眾所周知的基團和方法。作為用于獲得蛋白的酰胺的其它方法，如羧基端氨基酸的α-羧基通過酰胺化被保護，在氨基端肽鏈(蛋白質)被延長以達到期望的鏈長度，肽鏈的N末端處的α-氨基的保護基被去除的蛋白質和肽鏈的C末端處的羧基的保護基被去除的蛋白質被制備，然后如上所述兩種肽在混合溶液中被縮合。該縮合反應的特殊之處如上所述。通過縮合而得的被保護的蛋白質被純化，通過以上方法去除所有被保護的基團，并且粗蛋白被獲得。該粗蛋白通過使用已知的純化方法被純化，再將主要片段凍干并獲得所要的該蛋白的酰胺。為獲得蛋白質的酯，如羧基末端的氨基酸的α-羧基與所需醇縮合以得到氨基酸酯，該酯如蛋白質的酰胺中所示被處理，則所要的該蛋白質的酯可以被獲得。
本發明的部分肽或鹽可以通過用于合成肽的眾所周知方法或使用適合的肽酶通過切割本發明的蛋白質而被生成。作為用于合成肽的方法，如固相合成方法或液相合成方法可以被使用。即，能夠組成本發明的部分肽的部分肽或氨基酸被與其余部分縮合，當產物具有被保護的基團時，該被保護的基團被去除，則所期望的肽可以被生成。
作為眾知的縮合方法和被保護的基團的去除，如以下方法可以被作為例子。M.Bodanszky和M.A.Ondetti，Peptide Synthesis，IntersciencePublishers，New York(1966)；Schroeder和Luebke，The Peptide，Academic Press，New York(1965)；Nobuo Izumiya et al.，Fundament andExperiments of Peptide Synthesis，Maruzen Co.，(1975)；Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara，Biochemical Experiment Lectures 1，Chemistry ofProteins IV，205(1977)；Haruaki Yajima supervised，ContinuedDevelopment of Medicines，Vol.14，Peptide Synthesis，Hirokawa Shoten。反應后，進一步本發明的部分肽可以通過常用純化方法被純化，如溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相色譜、重結晶和它們的組合。當部分肽通過以上方法被獲得時，它可以通過已知方法或相似的方法被生成為適當的鹽。當該部分肽的鹽被獲得時，它可以通過已知方法或相似的方法被生成為釋放化合物或其它鹽。
作為編碼本發明的蛋白質的DNA，含有編碼上述本發明的蛋白質的堿基序列的任何化合物可以被使用。進一步，基因組DNA、基因組DNA文庫、來自細胞和組織的上述cDNA、來自細胞和組織的上述cDNA文庫或者合成的DNA可以被使用。文庫中使用的載體可以選自細菌噬菌體、質粒、粘粒、噬菌粒等的任意一種。使用由以上細胞或組織制備的總RNA或mRNA組分可以通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(以下被稱作RT-PCR方法)被直接擴增。作為編碼本發明的蛋白質的DNA，以下任何一種DNAs可以被作為例子如含有序列No.2表示的堿基序列的DNA，或含有在高嚴格條件下與序列No.2表示的堿基序列雜交的堿基序列且編碼具有與本發明的蛋白質基本相同活性(如細胞毒素活性)的蛋白質的DNA。
進一步具體化，作為編碼具有序列No.1表示的氨基酸序列的蛋白質的DNA，具有序列No.2表示的堿基序列的DNA可以被使用。
作為編碼本發明的部分肽的DNA，任何一種含有以上編碼本發明的部分肽的堿基序列的DNAs可以被使用。進一步，基因組DNA、基因組DNA文庫、來自細胞和組織的上述cDNA、來自細胞和組織的上述cDNA文庫或者合成DNA可以被使用。作為編碼本發明的部分肽的DNA，例如，任意一種以下DNAs可以被作為例子如含有具有序列No.2表示的堿基序列的DNA的部分序列的DNA，或者含有具有在高嚴格條件下與序列No.2表示的堿基序列雜交的堿基序列且編碼具有與本發明的蛋白質基本相同活性(如細胞毒性)的蛋白質的DNA的部分序列的DNA。
作為完美地編碼本發明的蛋白質或部分肽(下文在編碼這些蛋白質等的DNA的克隆和表達的描述中，逐個情況下，這些蛋白質等被簡寫為本發明的蛋白質)的DNA的克隆方法，使用具有本發明的蛋白質的部分堿基序列的合成DNA引物，通過已知的PCR方法該DNA被擴增，或者在適當載體中的組合DNA通過與DNA片斷或編碼部分或全部本發明的蛋白質區域的合成DNA雜交被篩選出。雜交方法可以通過如Molecular Cloning，2nd，J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)中的描述被進行。當市售文庫被使用時，可以通過附帶的說明中描述的方法進行雜交。在DNA堿基序列的改變中，使用已知的試劑盒如Mutan TM-G(由Takara Shuzou Co.生產)、Mutan TM-K(由Takara Shuzou Co.生成)等，缺口雙鏈方法，Kunkel方法，眾所周知的方法或相似的方法可以被進行。編碼被克隆的蛋白質的DNA可以被直接使用，或根據需要用限制酶消化，或通過添加連接子被使用。該DNA可以在5’末端側具有作為翻譯起始密碼子的ATG、GTG或TTG，在3’末端側具有作為翻譯終止密碼子的TAA、TGA或TAG。翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子可以通過使用合適的合成DNA連接物而被添加。本發明的蛋白質的表達載體可以被制備，如通過方法(i)將目的DNA從編碼本發明的蛋白質的DNA上切割下來，和(ii)將DNA片段連接到適當表達載體中啟動子的下游。
作為載體，來自大腸桿菌(Echerichia coli)(如pBR322，pBR325，pUC12，pUC13或pET30)的質粒，來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(如pUB110，pTP5或pC194)的質粒，質粒(如pSH19，pSH15)，來自酵母的噬菌體，噬菌體如λ噬菌體，動物病毒如逆轉錄病毒，牛痘病毒，桿狀病毒等，pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV或pcDNAI/Neo可以被使用。作為本發明使用的啟動子，適用于基因表達使用的宿主的任何啟動子都可以被使用。例如，當動物細胞被用作宿主時，SRα啟動子，SV40初期啟動子，HIV·LTR啟動子，CMV啟動子或者HSV-TK啟動子可以被作為例子。在這些啟動子中，CMV(細胞巨化病毒)啟動子、SRα啟動子可以被優選使用。當宿主是大腸桿菌科菌時，trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子或T7啟動子被優選。當宿主細胞是芽孢桿菌科的菌時，SPO1啟動子、SPO2啟動子或penP啟動子被優選。當宿主是酵母時，PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子或ADH啟動子被優選。當宿王是昆蟲細胞時，多角體蛋白啟動子、P10啟動子等被優選。
作為除了以上載體外的表達載體，如果需要，含有增強子、選擇標記、SV40復制起始位點(下文偶爾簡寫為SV40ori)等的載體可以被使用。作為選擇標記，如二氫葉酸還原酶(下文偶爾簡寫為dhfr)基因(氨甲蝶呤(MTX)抗性)、氨芐青霉素抗性基因(下文偶爾簡寫為Ampr)、新霉素抗性基因(下文偶爾簡寫為Neor)、G418抗性和卡那霉素抗性基因可以被作為例子。特別地，當dhfr基因通過使用dhfr基因缺陷的中國倉鼠細胞而被用作選擇標記時，轉化細胞可以通過不含有胸腺嘧啶的培養基被選擇出。如果需要，進一步，適合宿主的信號序列被添加到本發明的蛋白質的N末端側。當宿主細胞是大腸桿菌科的菌時，PhoA信號序列、OmpA信號序列等可以被使用。當宿主細胞是芽孢桿菌科的菌時，α-淀粉酶信號序列、枯草桿菌蛋白酶信號序列等可以被使用。當宿主是酵母時，MFα信號序列、SUC2信號序列、SUC2信號序列等可以被使用。當宿主是動物細胞時，胰島素信號序列、α-干擾素信號序列、抗體分子信號序列等可以被使用。使用含有編碼如此構成的本發明的蛋白質的DNA的載體，轉化體可以被制備。
作為宿主，如大腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、酵母、昆蟲細胞、昆蟲、動物細胞等可以被使用。作為大腸桿菌屬的具體例子，如Escherichiacoli K12，DH1，DH5α(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.60，160(1968))，JM103(Nucleic Acids Research，Vol.9，309(1981))，JA221(Journal ofMolecular Biology，Vol.120，517(1978))，HB101(Journal of MolecularBiology，Vol.41，459(1969))，C600(Genetics，Vol.39，440(1954))等可以被使用。作為芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌MI114(Gene，Vol.24，255(1983)，207-21(Journal of Biochemistry，Vol.95，87(1984))等可以被使用。作為酵母，如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R、NA87-11A、DKD-5D、20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、NCYC2036、巴氏畢赤酵母KM71等可以被使用。
作為昆蟲細胞，如當病毒為AcNPV時，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞；Sf細胞、來自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的中腸的MG1細胞、來自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)卵的High Five TM細胞、來自甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)的細胞、來自Estigmena acrea的細胞等可以被使用。當病毒是BmNPV時，家蠶(Bombyx mori)N細胞；BmN細胞等可以被使用。作為Sf細胞，如Sf9細胞(ATCCCRL1711)、Sf21細胞(Vaughn，J.L.et al.，In Vivo，13，213-217(1977))等可以被使用。作為昆蟲，如家蠶的幼蟲可以被使用(Maeda et al，Nature，Vol.315，592(1985))。作為動物細胞，如猴細胞COS-7、Vero、中國倉鼠細胞CHO(下文簡寫為CHO細胞)、dhfr基因缺陷的中國倉鼠細胞CHO(下文簡寫為CHO(dhfr-)細胞)、小鼠L cells、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤細胞、大鼠GH3細胞、人FL細胞等可以被使用。此外，許多種正常人類細胞，如肝細胞、脾細胞、神經細胞、神經膠質細胞、脾β細胞、骨髓細胞、腎小球膜細胞、郎格罕氏(Langerhans)細胞、表皮細胞、上皮細胞、內皮細胞、纖維原細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞(如巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿細胞、嗜曙紅細胞、單核細胞)、巨核細胞、滑液細胞、軟骨細胞、骨細胞、造骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、間質細胞、或這些細胞的前體細胞、干細胞或癌細胞可以被使用。對于大腸桿菌屬的轉化，如可以通過Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.69，2110(1972)，Gene，Vol.17，107(1982)等中描述的方法進行。
對于芽孢桿菌屬的轉化，如可以通過Molecular & GeneralGenetics，Vol.168，111(1979)等中描述的方法進行。對于酵母的轉化，如可以通過Methods in Enzymology，Vol.194，182-187(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.75，1929(1978)等中描述的方法進行。對于昆蟲細胞或昆蟲的轉化，如可以通過Bio/Technology，6，47-55(1988)等中描述的方法進行。
對于動物細胞的轉化，如可以通過Cell Engineering，separatevolume 8，New Cell engineering Experiment protocol，263-267(1995)，published by Shujunsha、和Virology，Vol.52，456(1973)中描述的方法進行。使用以上方法，用含有編碼蛋白質的DNA的表達載體轉化的轉化體可以被獲得。當以大腸桿菌屬或芽孢桿菌屬為宿主的轉化體被培養時，液體培養基作為用于培養的培養基是合適的。在培養基中，含有轉化體生長所必須的碳源、氮源、無機物等。作為碳源，如葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等可以被作為例子。作為氮源，例如，如銨鹽、硝酸鹽、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、豆餅、馬鈴薯提取物等的無機和有機物質可以被使用。作為無機物，如氯化鈣、磷酸二氫鈉和氯化鎂可以被作為例子。酵母提取物、維生素類、生長促進物質等可以被添加。培養基優選使用pH約5～8。
作為培養大腸桿菌屬的培養基，如含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培養基(Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York 1972)優選使用。如果需要，為了使啟動子有效的起作用，例如，如3-β-吲哚基丙烯酸的試劑可以被添加。當宿主是大腸桿菌屬時，通常在溫度約為15～43℃下培養約3～24小時，如果需要，可以加以通氣及攪拌。當宿主是芽孢桿菌科菌時，通常在約30～40℃下培養約6～24小時，如果需要，可以加以通氣及攪拌。
當宿主為酵母的轉化體被培養時，作為培養基，如Burkholder最低培養基(Bostian，K.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，4505(1980))或含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養基(Bitter，G.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，5330(1984))可以被作為例子。約pH5～8的培養基被優選使用。通常在約20～35℃下培養約24～72小時，如果需要，可以加以通氣及攪拌。當宿主為昆蟲細胞或昆蟲的轉化體被培養時，作為培養基，Grace氏昆蟲培養基(Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962))可以通過適當地添加被固定化的10％牛血清等添加物而被使用。培養基優選使用約pH6.2～5.4。通常在約27℃下培養約3～5天，如果需要，可以加以通氣及攪拌。當宿主為動物細胞的轉化體被培養時，作為培養基，如含有5～20％小牛血清的MEM培養基(Science，Vol.122，501(1952))，DMEM培養基(Virology，Vol.8，396(1959))，RPMI1640培養基(The Jounal of the American Medical Association，Vol.199，519(1967))，199培養基(Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，Vol.73，1(1950))等可以被使用。培養基優選使用約pH6～8。通常在約30～40℃下培養約15～60小時，如果需要，可以加以通氣及攪拌。如以上所述，可以從轉化體的細胞生成本發明的蛋白質。
對于本發明的蛋白質的分離和純化，如以下方法可以被適當地使用。當本發明的蛋白質在培養后從培養的菌體或細胞中提取時，菌體或細胞通過眾所周知的方法收集、然后懸浮于適當的緩沖液中，然后通過超聲波、溶菌酶和/或凍融等方法破碎。然后，通過離心或過濾獲得該蛋白的粗提取液。緩沖液中可以含有蛋白質變性劑如尿素或鹽酸胍，或表面活性劑如tritonX-100TM。當蛋白質在液體培養基液體中被分泌時，培養完成后，通過眾所周知的方法使菌體或細胞與上清液分離，然后收集上清液。如此獲得的培養上清液或提取液中含有的蛋白質可以通過眾所周知的分離和純化方法的組合被純化。這些眾所周知的分離和純化方法為通過溶劑沉淀方法使用鹽析技術或溶解度的方法、透析方法、使用分子量差異的方法如超濾和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等、使用電荷差異的方法如離子交換色譜、使用疏水性差異的方法如疏水色譜、使用特異性親和力的親和層析、使用疏水性差異的方法如反相高速液相色譜、使用等電點差異的方法如等電點電泳。
當獲得游離體形式的前述蛋白時，該蛋白可以通過眾所周知的方法或類似方法被轉變為鹽。另一方面，當獲得鹽形式的蛋白質時，該蛋白質可以通過眾所周知方法或類似方法被轉變為游離形式或其它鹽。在純化該蛋白之前或之后由重組子生成的蛋白質可以進一步與適當的蛋白質修飾酶反應以任意地修飾或部分地去除多肽。作為蛋白質修飾酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、精氨酰基內肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等可以被使用。如此獲得的本發明的蛋白質或其鹽的活性可以通過使用標記配體的結合試驗(bond experiment)和使用特異性抗體的酶免疫試驗等被測定。
只要抗體可以識別蛋白質、部分肽和鹽，則用于本發明的蛋白質、部分肽或鹽的該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。用于本發明的蛋白質、部分肽或鹽的抗體(在以下抗體的描述中，這些蛋白質等可以被簡寫為本發明的蛋白質)可以通過以該蛋白質作為抗原和通過眾所周知的抗體或抗血清的制備方法而被制備。
(a)產生單克隆抗體的細胞的制備本發明的蛋白質以蛋白質本身或載體或稀釋劑在通過給藥可產生抗體的位置被給予溫血動物。在給藥過程中，為了提高抗體生成的效率，完全Freund氏佐藥或不完全Freund氏佐藥可以被給予。這種給藥通常每2～6周進行一次，共計2～10次。溫血動物為，如猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、雞等，優選小鼠和大鼠。在生產單克隆抗體的細胞的制備中，被抗原免疫的溫血動物，例如小鼠被使用。從小鼠中選出可識別抗體價的個體，在最終免疫的2～5天后采集脾或淋巴，然后脾或淋巴中含有的產生單克隆抗體的細胞與同種或不同種動物的骨髓瘤細胞融合以制備用于產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。抗血清中的抗體價可以通過，例如該抗血清與后述標記蛋白質反應，并且測定與抗體結合的標記試劑的活性的方法被確定。融合操作可以通過已知方法如Kohler和Milstein(Nature，256，495(1975))的方法被進行。作為融合促進試劑，如聚乙二醇(PEG)、Sendai病毒等，優選地PEG可以被使用。
作為骨髓瘤，如溫血動物的骨髓瘤細胞如NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1和AP-1，優選地P3U1可以被作為例子。抗體產生細胞(脾細胞)的數目與骨髓瘤細胞的數目的優選比率約為1∶1～20∶1。PEG(優選PEG1000～PEG6000)以約10～80％的濃度被加入，在20～40℃，優選地在30～37℃溫度下孵育1～10分鐘，細胞融合被有效地進行。在生成單克隆抗體的雜交瘤細胞的篩選中，多種方法被使用，如包括以下過程的方法將雜交瘤細胞培養物的上清液加入到直接或通過載體吸附蛋白質抗原的固相(如微板)中，然后用放射性物質或酶(當細胞融合使用的細胞是小鼠時，抗-鼠免疫球蛋白被使用)或蛋白A標記的抗免疫球蛋白抗體被加入以檢測與固相結合的單克隆抗體；及包括以下過程的方法雜交瘤細胞培養物的上清液被加入到吸收抗-免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相中，標記了放射性物質或酶的蛋白質被加入，然后與固相結合的單克隆抗體被檢測。單克隆抗體的選擇可以通過已知的方法或其類似的方法被進行。通常地，可以通過HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)被添加的用于動物細胞的培養基進行。作為用于選擇和繁殖的培養基，雜交瘤細胞可以被繁殖的任何培養基可以被使用。如，含有1～20％，優選10～20％小牛血清的RPMI1640培養基，含有1～10％小牛血清的GIT培養基(由Wako Junyaku KougyouCo.制備)或用于雜交瘤細胞培養的不含血清的培養基(SFM-101，Nissui Seiyaku Co.)可以被使用。培養溫度通常為20～40℃，優選約37℃。培養時間通常為5天～3周，優選1周～2周。該培養通常可以在5％二氧化碳中進行。雜交瘤細胞培養物的上清液的抗體價可以通過如在用于測定血清中抗體價的以上所述方法中所示被測定。
(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離和純化可以通過已知方法被進行，如用于免疫球蛋白的分離和純化的方法(如鹽析方法、醇沉方法、等電點沉淀方法、電泳方法、使用例子交換劑(如DEAE)的吸附和解吸附方法、超離心方法、凝膠過濾方法、或用活性吸附劑如抗原結合的固相或蛋白A或蛋白G的僅收集抗體的特異性純化方法，然后結合物被釋放以獲得抗體)。
本發明的多克隆抗體可以通過已知方法或其類似方法被制備。作為例子，使用免疫抗原(蛋白抗原)本身或免疫抗原和載體蛋白的復合體通過如用于制備單克隆抗體的上述方法中相同的方法免疫溫血動物，含有本發明的蛋白質的抗體的材料被收集，然后該抗體被分離和純化。至于免疫溫血動物的免疫抗原和載體蛋白的復合體，如果對于通過與載體交聯而被免疫的半抗原抗體能夠被有效地產生，則載體蛋白的種類和載體與半抗原的混合比率并不重要。如牛血清白蛋白、牛環狀球蛋白、血藍蛋白等可以以約0.1～20，優選地1～5份比1份半抗原的重量比率被用于與半抗原結合。在半抗原與載體的結合過程中，多種縮合試劑如含有戊二醛、碳二亞胺、順丁烯二酰亞胺活性酯、硫醇基團和二硫代吡啶基的活性酯試劑可以被使用。縮合的產物直接或與載體或與稀釋劑一起被給予到溫血動物的能夠產生抗體的部分。為了提高在給藥過程中抗體產生的能力，完全Freund氏佐劑或不完全Freund氏佐劑可以被給予。給藥通常每2～6周進行一次，共進行約3～10次。多克隆抗體可以從血液、腹水，優選從通過以上方法免疫的溫血動物的血液中收集。抗血清中的多克隆抗體價通過在以上血清中抗體價的測定中所述相同的方法被測定。多克隆抗體的分離和純化可以通過與以上單克隆抗體分離和純化中相同的免疫球蛋白的分離和純化的方法而被進行。
含有本發明的蛋白質或部分肽的治療試劑和本發明的蛋白質等具有癌細胞毒活性，因而該試劑可以被用作用于提取疾病組織(提取包括全部和部分，優選部分提取)，及特別地用于治療固定癌(fixed cancer)的試劑。當本發明的蛋白質等被用作以上治療和預防試劑時，該試劑在其被純化達到至少90％，優選95％或更高，更優選98％或更高，進一步優選99％或更高后被使用。
本發明的蛋白質等的癌細胞增殖的抑制活性可以通過已知方法被測定，或者細胞毒活性或導致細胞死亡的活性通過已知的方法或類似方法被測定，優選使用下述試驗中所述方法而被測定。作為測試化合物，如肽、蛋白質、非肽化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物和血漿可以被作為用于此的例子。這些化合物可以是新化合物或已知的化合物。
通過本發明的篩選方法或篩選試劑盒獲得的化合物或鹽選自以上測試化合物，如肽、蛋白質、非肽化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物和血漿。這些化合物具有抑制本發明的蛋白質等的細胞毒性的活性，或抑制本發明的蛋白質等的癌細胞增殖的活性。作為化合物的鹽，與本發明的蛋白質的鹽類似的鹽可以被使用。
當通過使用篩選方法或用于篩選的試劑盒而獲得的化合物被用作以上治療試劑時，這些化合物可以通過常用方法被使用。例如，這些化合物被用作片劑、膠囊、酏劑、微膠囊、無菌溶液、懸浮液等。如此獲得的藥物制劑是安全的且具有低毒性，例如它們可以被給藥于人或溫血動物(如小鼠、大鼠、兔、山羊、豬、牛、馬、鳥、貓、狗、猴等)。該化合物及其鹽的劑量根據作用、疾病、劑量方案等而變化。一般地，對于成人(以60kg體重被估計)，每天約0.1～100mg的化合物，優選約1.0～50mg，更優選約1.0～20mg的化合物可以被給藥。在非消化道給藥過程中，通常對于成人(以60kg體重被估計)按照目的、疾病等變化的化合物的合適靜脈注射劑量為每天約0.01～30mg，更優選為約0.1～20mg，進一步優選約為0.1～10mg。對于其它動物，對于60kg估計重量的劑量可以被使用。
用于疾病的藥物的候選化合物的篩選由于本發明的蛋白質等具有細胞毒活性，所以促進本發明的蛋白質等的功能(如細胞毒活性)的化合物或鹽，例如，可以被用作治療癌癥的試劑。另一方面，抑制本發明的蛋白質等的功能的鹽，例如，可以被用作用于治療和預防胃炎和胃潰瘍的試劑。據此，本發明的蛋白質等被有效地被用作用于篩選促進或抑制本發明的蛋白質等的功能的化合物或鹽的試劑。
即，本發明提供了(1)一種篩選方法，其特征在于本發明的蛋白質或部分肽或鹽被使用，及該方法篩選促進本發明的蛋白質或部分肽或鹽的功能(如細胞毒活性)的化合物，或該方法篩選抑制本發明的蛋白質或部分肽或鹽的功能(如細胞毒活性)的化合物。下文中該促進功能的化合物可以簡寫為“促進劑”，該抑制功能的化合物被簡寫為“抑制劑”。
此外，本發明提供(2)用于篩選促進劑或抑制劑的試劑盒，其特征在于含有本發明的蛋白質或部分肽或鹽。下文中以上試劑盒可以簡寫為“本發明的用于篩選的試劑盒”。
在具體實施中，例如，在以上(1)中，提供了促進劑或抑制劑的篩選方法，其特征在于進行情況(i)和情況(ii)之間的比較。情況(i)是本發明的蛋白質或部分肽或鹽與細胞接觸，其中該細胞為含有來自以上溫血動物(優選人)的組織的血細胞的正常細胞或上述癌細胞。情況(ii)是本發明的蛋白質或部分肽或鹽與細胞接觸，其中該細胞為含有來自以上溫血動物(優選人)的組織的血細胞的正常細胞或上述癌細胞。
在具體實施中，進一步，在以上(2)中，提供了用于篩選促進劑或抑制劑的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有本發明的蛋白質或部分肽或鹽，及為含有來自以上溫血動物(優選人)的組織的血細胞的正常細胞或者上述癌細胞等。
進一步，具體地，在篩選方法中，情況(i)和情況(ii)的特征在于本發明的蛋白質等的細胞毒活性被測定并被比較。
本發明的蛋白質等的細胞毒活性、細胞繁殖抑制活性及導致細胞死亡的活性可以通過已知方法或其類似方法被測定。然而，更具體地，使用已建立的細胞系等，進一步，含有測試化合物的培養基，培養基不含有該測試化合物的陰性對照，及培養基含有M毒素的陽性對照，這三種或兩種被使用。在滿足統計學意義的條件下比較細胞數目時，細胞毒活性或細胞增殖活性的抑制活性，或具有細胞毒活性或細胞增殖活性的抑制活性的特定樣品通過活性的存在或缺乏或者增加和降低而被檢測。該檢測方法中使用的細胞是，例如，含有來自以上溫血動物(優選人)的組織的血細胞的正常細胞，或幾種溫血動物的上述癌細胞(如子宮內膜癌、子宮腺肌瘤、乳腺癌、胃癌、肝癌、脾癌、膽囊癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、成神經細胞瘤、膀胱癌、惡性黑素瘤、舌癌、齒齦癌、小鼠纖維原細胞、非洲綠猴腎細胞、大鼠肝癌等)。
作為測試化合物，例如，肽、蛋白質、非肽性化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物等可以作為此的例子。這些化合物可以是新化合物或已知的化合物。對于進行以上篩選方法，本發明的蛋白質等被懸浮于適合于篩選的緩沖液中，并且本發明的蛋白質等的樣品被制備。作為緩沖液，不抑制本發明的蛋白質等與測試化合物的反應的pH約4～10(優選pH約6～8)的磷酸緩沖液、三-鹽酸緩沖液等可以被使用。
作為具體的篩選方法，在篩選檢查之后，①用于在顯微鏡下直接觀察細胞變化及用血球計數計等計數細胞的方法，②捕獲通過細胞死亡而從細胞中被釋放的鉀、血紅蛋白等的變化的方法，③用于在反應后使用四唑鹽等測定殘余細胞的方法，④用放射性標記的物質測定殘余活細胞的方法，⑤通過誘導細胞凋亡(cell apoptosis)確認細胞死亡的方法等可以用作此的例子。例如，作為增加本發明的蛋白質等的細胞毒活性的化合物，其中細胞毒活性在以上情況(ii)下比在以上情況(i)下被增加了約20％或更高，更優選30％或更高，進一步優選50％或更高的測試化合物可以被選擇。另一方面，作為抑制本發明的蛋白質等的細胞毒活性的化合物，其中細胞毒活性在以上情況(ii)下比在以上情況(i)下被抑制約20％或更高，更優選30％或更高，進步優選50％或更高的測試化合物可以被選擇。這些可以被作為用于高通量篩選的方法而被進行。以下，作為方法②的用于通過溶血反應測定血紅蛋白的方法，和作為方法③的WST方法分別被使用。在這些方法中，活性炭、CM纖維素和藻酸鈣被選作顯示抗-M毒素活性的吸附劑。
進一步可能用動物模型檢驗和比較含有這些陰離子對照、陽性對照和測試化合物的溶液以確認抗-M毒性物質的動物水平的效果。在這些情況中，許多種類的溫血動物可以被使用。特別地，小鼠、大鼠、狗和猴可以被使用。作為感染模型，蒙古沙鼠、小鼠和猴可以被有效地使用。
當通過本發明的篩選方法或用于篩選的試劑盒而獲得的化合物被用作以上治療和預防試劑時，這些化合物可以通過常用方法被使用。例如，使用與本發明的蛋白質的藥物制劑相同的方法，這些化合物可以被用作片劑、膠囊、酏劑、微膠囊、無菌溶液、懸浮液等。由于如此獲得的制劑是安全的且具有低毒性，例如，因而它們可以被給藥于人或溫血動物(如小鼠、大鼠、兔、山羊、豬、牛、馬、鳥、貓、狗、猴等)。這些化合物或其鹽的劑量可以按照作用、疾病、劑量方案等而改變。當該化合物在去除疾病組織后作為組織再生試劑被用于增加本發明的蛋白質等的功能時，通常地，對于成人(按60kg體重估計)每天約0.1～100mg的化合物，優選1.0～50mg，更優選約1.0～20mg的該化合物可以被口服給藥。對于其它動物，對于以60kg被估計的體重的劑量可以被使用。
本發明的蛋白質或部分肽或鹽的定量用于本發明的蛋白質等的抗體(下文偶爾被簡寫為本發明的抗體)可以特異地識別本發明的蛋白質等，因而這些抗體可以被用于測試液體中本發明的蛋白質等的定量，特別地，被用于通過夾層免疫技術的定量。即，本發明提供了(i)用于定量測試液體中本發明的蛋白質等的方法，其特征在于本發明的抗體與測試液體和本發明的蛋白質等競爭性反應，與抗體結合的被標記的本發明的蛋白質等的比率被測定，及(ii)用于定量測試液體中本發明的蛋白質等的方法，其特征在于測試液體和固定化在載體上的抗體和本發明的其它被標記的抗體在同時或持續地反應，且然后在不溶性的載體上的標記試劑的活性被測定。在以上定量方法(ii)中，優選地，一種抗體為識別本發明的蛋白質等的N末端的抗體，另一種抗體是與本發明的蛋白質等的C末端反應的抗體。
此外，使用本發明的蛋白質等的單克隆抗體(下文偶爾簡寫為本發明的單克隆抗體)，本發明的蛋白質等的定量可以被進行，并且進一步，檢測可以通過使用組織染色被進行。用于這些目的，抗體分子本身可以被使用，或者抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片斷可以被使用。使用本發明的抗體定量本發明的蛋白質等不應該受到限制。例如，化學地或物理地測定測試液體中對應抗原的量(如蛋白質的量)的抗體、抗原或抗體-抗原復合體的量，所得量使用通過含有已知量的抗原的標準液體形成的標準曲線而被測定。作為例子，比濁法、競爭法、免疫計法及夾層法被優選使用。考慮到敏感性和特異性，下述夾層方法被優選。作為使用被標記物質的測定方法中所用的標記試劑，如，放射性同位素、酶、熒光物質、發光物質等可以被作為關于此的例子。作為放射性同位素，例如，〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕可以被使用。作為酶，穩定和高活性的同位素，例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等可以被使用。作為熒光物質，例如，熒光胺、熒光素異硫氰酸酯等可以被使用。作為發光物質，例如，氨基苯二酰一肼、氨基苯二酰一肼衍生物、熒光素、光澤精等可以被使用。此外，對于抗體或抗原與標記試劑的結合，生物素-抗生物素蛋白類型可以被使用。
抗原或抗體的固相化可以通過通常被用于蛋白質或酶的固相化的物理吸附或化學結合而被進行。作為載體，不溶性多糖如瓊脂糖、右旋糖苷和纖維素，合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅樹脂或玻璃可以被作為用于此的例子。在夾層方法中，測試液體與被固定化的本發明的單克隆抗體反應(初級反應)，然后與其它被標記的本發明的單克隆抗體反應(次級反應)，之后被固定化的載體上的標記試劑的活性被測定以測定測試液體中本發明的蛋白質的量。該初級反應和次級反應可以被改變。此外這些反應可以同時或通過交錯起始時間而進行。該標記試劑和固相化方法可以與這些反應同樣被處理。在通過使用夾層方法的免疫試驗中，用作固相用抗體或標記用抗體的抗體不必要為同一種類。兩種或多種抗體的混合物可以被用于提高測定靈敏度。在通過使用本發明的夾層法測定本發明的蛋白質等的測定方法中，用于初級反應和次級反應的單克隆抗體優選具有不同的與本發明的蛋白質等結合的部分。即，關于初級反應和次級反應所用的抗體，如當次級反應所用的抗體識別本發明的蛋白質等的C末端時，該用于初級反應的抗體優選識別除了C末端以外的部分，如N末端。
本發明的單克隆抗體可以被用于除了夾層方法以外的測定體系如競爭方法，或免疫計方法或比濁法。在競爭法中，測試液體中的抗原和被標記的抗原競爭地同抗體反應，然后未反應的被標記的抗體(F)和與抗體結合的被標記的抗原(B)被分離(B/F分離)，B或F被標記的量被測定，然后抗原的量被定量。在反應方法中，可溶解的抗體被用作抗體。在B/F分離中，聚乙二醇或用于以上抗體的第二抗體被使用的液相方法，固相抗體被用作第一抗體或可溶性抗體被用作第一抗體，并且固相抗體被用作第二抗體的固相方法被用作關于此的例子。在免疫計方法中，測試液體中的抗原和固相抗原與確定量的被標記的抗體競爭性地反應，然后固相和液相被分離。此外，測試液體中的抗原和過量的被標記抗體反應，固相抗體被加入固相中以結合未反應的被標記的抗體到固相上，然后固相和液相被分離。連續地，兩相中任意一相的被標記的量被測定，并且測試液體中抗原量被測定。在比濁法中，在凝膠中或在溶液中作為抗原-抗體反應結果而形成的不溶性沉淀的量被測定。當測試液體中抗原的量極少并且只有少量沉淀獲得時，使用激光散射的激光比濁法等被優選使用。
當這些免疫學測定方法被用于本發明的測定方法中時，特定條件和操作的建立是不必要的。各方法中的常用條件和操作方法加上本領域的通常技術想法，本發明的蛋白質等的測定體系就可以被建立。關于這些常用技術方法的細節，常用書、專業書可以被參考。例如Kan Irie編輯的Radioimmuno Assay，Kodan-sha(1974)，Kan Irie編輯的Radioimmuno Assay，continued，Kodan-sha(1979)，Eiji Ishikawa等編輯的Immunoenzymometric Assay，Igaku Shoin(1978)，Eiji Ishikawa等編輯的Immunoenzymometric Assay第二版，Igaku Shoin(1982)，EijiIshikawa等編輯的Immunoenzymometric Assay第三版，Igaku Shoin(1987)，Methods in ENZYMOLOGY，Vol.70，Immunochemical Techniques(Part A)ibid.，Vol.73，Immunochemical Techniques(Part B)，ibid.，Vol.74，Immunochemical Techniques(Part C)，ibid.，Vol.84(ImmunochemicalTechniques(Part DSelected Immunoassays))，ibid.，Vol.92(Immunochemical Techniques(Part EMonoclonal Antibodies and GeneralImmunoassay Methods))，ibid.，Vol.121(Immunochemical Techniques(Part IHybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))，全部由Academic Press Co.出版，可以被參考。如上所述，通過使用本發明的抗體，本發明的蛋白質等可以被靈敏地定量。此外，通過使用本發明的抗體來定量本發明的蛋白質等的濃度，當本發明的蛋白質等的濃度在感染幽門螺旋桿菌的患者身上被檢測出增加時，則該患者患有疾病，如胃炎、胃潰瘍、胃癌、瓣膜疾病、糖尿病、各種癌癥(如子宮內膜癌、子宮腺肌瘤、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、脾癌、膽囊癌、腎癌、成神經細胞瘤、膀胱癌、惡性黑素瘤等)。此外，可能診斷出以后病變的可能性高。本發明的抗體可以被用于測試液體如體液或組織中本發明的蛋白質等的檢測。該抗體被用于形成純化本發明的蛋白質等所用的抗體柱、檢測在純化時各組分中本發明的蛋白質等、及分析測試細胞中本發明的蛋白質等的行為。
含有本發明的抗體、具有中和本發明的蛋白質等的活性的作用的本發明的抗體(中和抗體)的藥物可以作為用于治療和預防疾病，如胃炎、胃潰瘍、胃癌、瓣膜疾病、糖尿病、各種癌癥(如子宮內膜癌、子宮腺肌瘤、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、成神經細胞瘤、膀胱癌、惡性黑素瘤等)的藥物。對抗本發明的蛋白質等的本發明的人源化抗體可以被用作治療和預防疾病如胃炎、胃潰瘍、胃癌、瓣膜疾病、糖尿病、各種癌癥(如子宮內膜癌、子宮腺肌瘤、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、成神經細胞瘤、膀胱癌、惡性黑素瘤等)的藥物。該人源化抗體可以參考如Nat Biotechnol，14，845-851(1996)，Nat Genet.15，146-156(1997)和PNAS，97(2)，722-727(2000)所述方法被制備。以下，本發明的這些中和抗體和人源化抗體被簡寫為本發明的抗體。
以上含有本發明的抗體的治療和預防試劑可以被以該試劑本來的液體形式或以適當劑型的藥物組合物被口服或非消化道給藥于人或哺乳動物(如小鼠、兔、山羊、豬、牛、貓、狗、猴等)。該試劑的劑量根據目的、疾病、病情、劑量方案等而改變。當該試劑被用于治療或預防子宮內膜腫瘤時，本發明的抗體的劑量通常為0.01～20mg/kg體重，優選0.1～10mg/kg體重，更優選0.1～5mg/kg體重，每天約1～5次，優選每天約1～3次。通過靜脈注射給予該試劑是方便的。其它非消化道或口服給藥的劑量也可以根據以上劑量。當病情非常嚴重時，給藥劑量可按照病情增加。本發明的抗體可以以它本身的形式或以適當的藥物組合物被給藥。給藥所用藥物組合物含有用于以上抗體或鹽的藥物學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。此組合物可以被制成適合于口服或注射給藥的劑型。即，例如，作為用于口服給藥的組合物，劑型為固體或液體，具體地為片劑(包括糖衣片和膜衣片)、丸劑、粒劑、粉劑、膠囊劑(包括軟膠囊)、糖漿劑、乳劑、混懸劑等。此種組合物通過已知的方法被制備，并且該組合物可以含有通常所用的載體、稀釋劑或賦形劑。例如，作為用于片劑的載體和賦形劑，乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等可以被使用。
序列表的下述序列號顯示如下序列。
序列No.1顯示來自幽門桿菌60190的氨基酸序列(M毒素)。
序列No.2顯示編碼本發明的具有序列No.1表示的氨基酸序列的來自幽門螺旋桿菌60190的蛋白質(M毒素)的DNA堿基序列。
序列No.3顯示實施例3所用引物(合成的)DNA的堿基序列。
序列No.4顯示實施例3所用引物(合成的)DNA的堿基序列。
下述實施例3中所得轉化體、大腸桿菌M毒素/pET30EK/LIC/DH5α已經于2002年10月17日以保藏號FERM BP-8218被保藏于國家先進工業科技研究所(IPOD)。此外，在下述實施例4中所得的雜交瘤克降No.4已經于2002年10月23日作為BALB-c/P3U1/004-1G9以保藏號FERM BP-8222被保藏于國家先進工業科技研究所(IPOD)。進一步，雜交瘤克隆No.101于2002年10月23日作為BALB-c/P3U1/101-1C10以保藏號FERM BP-8223被保藏于國家先進工業科技研究所(IPOD)。雜交瘤克隆No.116于2002年10月23日作為BALB-c/P3U1/116-5D7以保藏號FERM BP-8224被保藏于國家先進工業科技研究所(IPOD)。
實施例根據以下實施例本發明將被更清楚地被理解。然而，這些實施例被用于說明本發明而不被解釋用于限制本發明的范圍。使用E.coli的基因操作根據分子克隆(Molecular Cloning)所描述的方法。
實施例1用于從幽門螺旋桿菌純化和提取本發明的毒素的方法幽門螺旋桿菌可以通過已經被確立的分離株(例如從美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection))獲得或者通過培養從臨床測試樣品分離的菌株而被獲得。在本實施例中，幽門螺旋桿菌60190的分離株被使用。使用5％牛血清(由Sigma Co.生產)被加入到腦心浸液(Brain Heart Infusion)瓊脂培養基中(由Difco Co.制備)的瓊脂培養基，該分離株在37℃和90％或更高的濕度下在微氧條件(CO25～10％)下次培養2～5代約1～2周。在顯微鏡下確認這些細胞沒有死或處于膠體形式而是令人滿意地生長。將細胞轉移到不含有血清而含有5％2，6-二-O-甲基-β-環糊精的腦心浸液瓊脂培養基(由Difco Co.生產)平皿中。在確認培養和生長條件與以上所述條件相同后，這些細胞被轉移到含有以逐漸階梯式下降，即濃度為2％、1％和0.5％的2，6-二-O-甲基-β-環糊精的培養基中。
在含有0.5％2，6-二-O-甲基-β-環糊精的腦心浸液液體培養基中，細胞在37℃溫度在微氧條件下被培養約16小時，同時以旋轉混合器以100～120rpm攪動。通過10000×g離心20分鐘收集小球狀細菌細胞。將收集到的細胞懸浮于pH為7.7的10mM Tris-HCl緩沖液中(下文簡寫為緩沖液A，因為目標蛋白的pH為pI6.08，所以pH至少為6.1或更高)并且經聲波處理。在-80℃下貯存過夜，然后細胞再被聲波處理并且100000×g離心60分鐘。被分離的三層中僅最上層被提取。
提取液用70％硫酸銨溶液粗純化。所得提取物通過使用用具有相對較大顆粒直徑的顆粒的陰離子交換樹脂(Amersham PharmaciaBiotech AB的DEAE Sephacel)的離子交換色譜被純化。緩沖液A被用作平衡緩沖液，緩沖液A和0.3M NaCl鹽溶液的混合物被用作洗脫液。使用緩沖液A和洗脫液，細胞通過濃度梯度被提取。適當量的各組分被逐滴加到植有HeLa細胞的小孔中，并且各小孔中細胞的存活率被評定。該評定通過使用細胞計數試劑盒(DOJIN實驗室)的WST試驗進行。與對照比較，顯示顯著低存活率的組分和具有蛋白質的相對一致增加曲線的組分隨同電泳結果一起被評定以作為用于下一純化過程的樣品組分。
具有與下一次的分離體系不同的分離體系的疏水性層析(Amersham Pharmacia Biotech AB的Phenyl Sepharose CL-4B)被選用。在10mM磷酸緩沖液中含有1M硫酸銨的平衡緩沖液被使用。在10mM磷酸緩沖液中含有40％乙二醇的洗脫緩沖液被使用。在細胞通過濃度梯度提取之后，各樣品通過與以上所述相同的方法被評定。
通過以上過程所提取的樣品通過使用具有相對較小顆粒直徑的顆粒的陰離子交換層析(Amersham Pharmacia Biotech AB的RESOURCEQ)被再提取。緩沖液A被用作平衡緩沖液，緩沖液A和1M NaCl鹽溶液的混合物被用作洗脫緩沖液。使用該層析，分子量約為41000的單一帶蛋白質被最終獲得。這些層析的種類和順序可以被改變而且可以被進一步添加。
在所得信號帶經考馬斯亮蘭(Coomassie Brilliant Blue)染色后，所得信號帶通過印跡設備被轉錄到硝酸纖維素膜或聚偏二二氟乙烯膜上，并且通過氨基酸測序儀分析。結果是如上所述，注冊數據庫(幽門螺旋桿菌22695)中的基因位點HP1037的N末端氨基酸序列匹配95％(20個堿基中19個堿基匹配)。(圖1)
實施例2通過基因技術生產方法的氨基酸序列和DNA序列在本實施例中，幽門螺旋桿菌60190的分離株被使用。如以上所述，不同株的幽門螺旋桿菌22695的所有基因分析已經被進行。同源基因位點可以通過檢索TIGR(The Institute for Genomic Research)數據庫可以被預測。發現幽門螺旋桿菌22695的基因位點HP1037編碼同源蛋白。
從這些結果中，本發明的蛋白質的克隆被進行。即，幽門螺旋桿菌60190被用作模板，首先，多組基于上游的基因位點HP1037和基因位點HP1036和下游的基因位點HP1038的適當引物被方便地形成(在5’位點和3’位點)以進行測序。具有校正功能的DNA聚合酶被使用。各引物組被組成因而含有足夠的共有引物部分，并且從5’位點和3’位點的多個測序被進行。所得DNA序列如序列表的序列No.2所示。氨基酸序列在序列No.1中被顯示。
實施例3通過基因重組的毒性蛋白的表達試驗E.coli在表達試驗中被使用。用于表達的載體pET-30EK/LIC(由Novagen Co.生產)和E.coli BL21(DE3)被使用。正義引物為在實施例2克隆的來自幽門螺旋桿菌60190的毒性蛋白的編碼正義鏈的5’位點插入GACGACGACAAG的序列No.3。反義引物為在5’位點處插入GAGGAGAAGCCCGGTTA的序列No.4。插入基因通過使用以上引物的PCR方法被形成。被插入的基因在25mM dATP和100mM DTT存在時用T4 DNA聚合酶制備以符合載體的LIC位點，并且在25mMEDTA存在下加熱。形成的重組子再被測序以確認所得序列與序列No.1相同。所得重組子被進一步轉化到用于表達的E.coli BL21(DE3)中，并且再在含有30μg/ml的卡那霉素的LB培養基中培養。
37℃以250rpm震蕩培養至OD600約為0.4。異丙基-β-硫代半乳糖苷被加入使其最終濃度為1mM，并且混合物再進一步震蕩2小時。由于融合蛋白形成包涵體，離心收集E.coli，蛋白的包涵體使用BugBuster試劑和Benzonase核酶(都是從Novagen Co.獲得)被獲得。該蛋白質通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳方法被分離，并且通過銀染相應的單一帶被確認。蛋白質被再折疊并且通過使用HeLa細胞和其它溫血動物細胞用WST試劑(Dojin ChemicalLaboratories Ltd.的細胞計數試劑盒)與對照比較。結果是存活的顯著差異被評定，并且發現該表達蛋白具有與純化蛋白相等的活性。發現該表達蛋白對正常人胃細胞具有與宮頸癌細胞的HeLa細胞同樣的活性(圖2)。也發現不僅對于其它人組織，而且對于哺乳動物細胞該蛋白質都具有廣泛的活性(圖3，圖4)。
實施例4單克隆抗-M毒抗體的形成240μg已經被重折疊的表達M毒素在BALB/C小鼠的若干位置處被進行2次皮下注射。最后一次免疫4天后，切下小鼠的脾并且用不銹鋼網壓擠過濾，然后懸浮于Eagle氏改良最小必須培養基上(MEM)以獲得脾細胞的懸浮溶液。作為用于細胞融合的細胞，來自BALB/C小鼠的雜交瘤細胞P3-X63.Ag 8.U1(P3U1)被用作用于細胞融合的細胞。〔Current topics in microbiology and immunology，81，1(1978)〕。該細胞融合根據最初的方法進行〔Nature，256，495(1975)〕。即，脾細胞和P3U1分別用不含有血清的MEM洗3次且脾細胞和P3U1的數目以6.6∶1的比率被混合。細胞通過750×g離心15分鐘被沉淀。去除所有上清液，松散該沉淀，0.3ml 45％聚乙二醇(PEG)6000(由WakoJunyaku Co.制備)被加入，將混合物于37℃的水浴鍋中放置7分鐘以進行融合。融合后，限量的MEM被加到細胞中，且總量為15ml的MEM被加入。混合物以750×g離心15分子，然后去除上清液。細胞沉淀在含有10％小牛血清的GIT培養基(由Wako Junyaku Co.生產)(GIT-10％FCS)中被懸浮以使每毫升含有2×105的P3U1，以每孔1ml的量接種入24-孔多孔盤(由Iwaki Co.生產)中，共種入168個孔中。接種后，細胞在37℃下于含5％二氧化碳的培養箱中孵育。24小時后，含有HAT(次黃嘌呤1×10-4M，氨基蝶呤4×10-7M和胸腺嘧啶1.6×10-3M)的GIT-10％FCS培養基(HAT培養基)以每孔中1ml的量被加入以開始HAT選擇性培養。4天和7天后，1ml的舊液體被舍棄，然后通過加入1ml HAT培養基HAT選擇性培養被繼續。在細胞融合9天后，發現雜交瘤細胞的增殖，然后收集上清液。通過以下方法測定上清液的抗體價。即，100μl培養上清液和100μl用緩沖液C稀釋200倍的HRP-標記的M毒素被加入到結合抗-鼠免疫球蛋白抗體的微板的各小孔中，然后在4℃下反應過夜。在該板用PBS洗過后，為了制作結合抗-鼠免疫球蛋白抗體的微板，首先，將pH為9.6且含有100μg/ml羊抗鼠免疫球蛋白(IgG片斷，由DAKO Co.生產)的0.1M碳酸緩沖液用移液管以每板100μl的量滴加到96孔微板中，然后在4℃下放置24小時。然后，用磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.4)清洗該板，25％Brock Ace(商標，由Yukijirushi Milk Products Co.生產)和pH為7.2且含有0.1％NaN3的PBS各300μl被滴加以封閉小孔的過量結合部分，并且在4℃下處理至少24小時。對于結合抗鼠免疫球蛋白抗體的以上微板的各孔，100μl用緩沖液EC
-1-丙磺酸)，2mM EDTA和0.1％NaN3的磷酸緩沖液]稀釋的鼠抗血清被加入，且在4℃下反應16小時。然后，用pH為7.4的PBS洗該板，并且100μl HRP標記的重折疊毒素蛋白被加入并在室溫下反應7小時。以上重折疊毒素蛋白在以上實施例3中通過用緩沖液C[pH7.0且含有1％BSA，0.4M NaCl和2mM EDTA的0.02M磷酸緩沖液]稀釋100倍而制備。用pH為7.4的PBS洗該板，100μl TMB微孔過氧化物酶取代系統(TMB microwell peroxidese substitutesystem)(KIRKEGAARD & PERRY LAB.，由Funakoshi Yakuhin提供)被加入，并在室溫下反應10分鐘以測定固相上的酶活性。通過添加100μl1M磷酸終止反應，用讀板儀(MTP-120，由Corona Co.生產)測定450nm處的吸光度。根據這些方法，固相上的酶活性被測定。結果是從123個孔中選出18個發現抗體價的孔，且雜交瘤細胞被冷凍并被保存。No.4、No.53、No.61、No.76、No.101和No.116這6個孔的雜交瘤細胞通過稀釋方法被克隆。在克隆時，BALB/C小鼠的胸腺細胞作為飼喂細胞以每孔5×105個被加入。克隆后，上清液的抗體價使用相同方法被測定。陽性克隆是No.4、No.101和No.116。這些克隆被作為表達M毒素的抗體生成雜交瘤細胞。
實施例5
單克隆抗體的種及亞種的確定通過實施例4所描述的方法，抗兔IgG-結合微板被形成。即，pH為9.6且含有100μg/ml羊抗兔免疫球蛋白(IgG片斷，由DAKO Co.生產)的0.1M碳酸鹽緩沖溶液用移液管以每孔100μl的量滴加到96孔微板中，然后4℃下放置24小時。用磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.4)沖洗該板，25％Block Ace(商標，由Yukijirushi Milk Products Co.生產)和pH為7.2且含有0.1％NaN3的PBS各300μl被滴加以封閉小孔的過量結合部分，并且在4℃下處理至少24小時。向抗兔IgG抗體結合微板中加入50μl緩沖液EC和100μl由Bio-Rad實驗室生產的同型分型試劑盒(iso-type typingkit)中含有的亞型特異性抗體被加入并在4℃下反應1天。用pH為7.4的PBS洗過該板后，以上所述的雜交瘤細胞的培養上清液被加入，并且在4℃下反應1天。用pH為7.4的PBS沖洗該板，100μl在以上實施例3中通過用緩沖液C[pH7.0且含有1％BSA，0.4M NaCl和2mM EDTA的0.02M磷酸緩沖液]稀釋100倍而制備的HRP標記的重折疊毒素蛋白被加入，而且室溫下反應6小時。用pH為7.4的PBS洗板，然后固相上的酶活性通過實施例4中所述方法被測定。結果是，由這些雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的亞種為No.4(IgG1)、No.101(IgG2b)和No.116(IgG2a)。
實施例6用于制備雜交瘤細胞的小鼠腹水的方法No.4、No.101和No.116雜交瘤細胞為小鼠腹水。0.5ml礦物油被事先非腸道給予小鼠。以上雜交瘤細胞以1～3×106細胞/小鼠的量被非腸道給予小鼠(BALB/C，雌性)，6～20天后收集含有抗體的腹水。用蛋白A柱從所得的腹水中純化單克隆抗體。即，約25ml的腹水用相同體積的結合緩沖液(3.5M NaCl，含有0.05％NaN3的1.5M甘氨酸，pH9.0)稀釋，然后該溶液被沉淀于用結合緩沖液事先平衡過的重組蛋白-A-瓊脂糖(agalose)(Repligen Co.)柱上，特異性抗體用洗脫緩沖液(pH3.0且含有0.05％NaN3的0.1M檸檬酸緩沖液)洗脫。洗脫液體用pH7.4的PBS于4℃下透析2天，然后用0.22μm的過濾器(由MilliporeCo.生產)過濾除菌，然后在-80℃保藏。
實施例7多克隆抗體M毒素的制備4.1mg本發明的細胞毒蛋白M毒素與Freund氏完全佐劑混合，然后將混合物對兔進行皮下免疫。一周后，同樣量的M毒素與Freund氏不完全佐劑混合，然后將混合物進一步對兔進行皮下免疫。免疫后，采集的血液被離心并去除血球成分，這樣抗-血清被獲得。
實施例8通過蛋白質印跡法分析M毒素含有2-巰基乙醇的SDS-樣品緩沖液被加入到實施例3所得的上清液中，將混合物用肽-PAGE(TEFCO)進行電泳，然后電轉移到PVDF膜(Amersham)上。實施例4和實施例6所得的各抗體(2μg/ml)被用作初級抗體。HRP(辣根過氧化物酶)標記的抗兔和抗鼠IgG抗體(稀釋2000倍；Dako)被用作次級抗體。用ECL Western雜交檢測系統(Amersham)進行著色。結果是，確認各初級抗體識別表達蛋白質(圖5)。
實施例9活性炭(0.2～0.1mm直徑)、CM纖維素和藻酸鈣各0.5ml被填充到3個柱子中。用pH7.7的10mM Tris緩沖液平衡后，0.5ml 400nM具有已重折疊活性的M毒素被加入到各柱中，將這些柱子塞緊并在25℃下放置60分鐘。其間，單獨的Tris緩沖液和含有相同M毒素的Tris緩沖液在相同條件下被放置。然后將所有的柱子打開，分離出各100μl柱子滴下的液體，進一步，各0.5ml Tris緩沖液被加到各柱子中，并且各100μl滴液被收集。正常成人的全血以800×g離心10分鐘收集，并且如此離心2～3次，直至上清液變得澄清。10μl沉淀所得紅血球被加入到990μl 10mM Tris緩沖液中以用作陽性對照。同樣地，10μl沉淀所得紅血球被加入到0.9％鹽10mM Tris緩沖液以被用作陰性對照。從以上柱子中收集樣品。紅血球以每100體積樣品中1體積紅血球的比例被加入到樣品中。對照和樣品通過用多道讀板儀(BioRad)測量415nm處吸光度而比較洗脫下的血紅蛋白的相對濃度(圖6)。
實施例10暴露于實施例9各柱子的組分的HeLa細胞(人宮頸癌細胞)的比例和存活率通過使用四唑鹽的WST方法被測定。HeLa細胞以每孔10000個細胞的比率于96孔板培中養24小時。僅含有培養液體的陰性對照、各樣品液體和20nM毒素蛋白的陽性對照被分別加入各孔中，然后于37℃培養12小時。使用細胞計數試劑盒(DOJINLABORATORIES Ltd.Co.)，通過WST方法檢測的細胞存活比率以415nm波長的吸光度被測定。
工業應用本發明的蛋白質和部分肽等可以被用作，例如，癌癥的治療試劑。本發明的抗體可以被用于鑒定從檢測患者采集的血液、組織、尿樣和糞便中的本發明的蛋白質，并確認幽門螺旋桿菌的感染。本發明的抗體被進一步用于本發明的蛋白質的定量。本發明的蛋白質可以被用作增加或抑制本發明的蛋白質的活性的化合物的篩選試劑。
序列表<110>大野博之(OHNO，Hiroyuki)<120>細胞毒蛋白及該細胞毒蛋白的利用<150>2001-371210<151>2001-12-05<160>4<210>1<211>357<212>PRT<213>幽門螺旋桿菌<400>1Met Lys Gly Leu Glu Arg Glu Ser His Phe Thr Leu Asp Glu Asn Ala1 5 10 15Met Phe Phe Glu Cys Ala Tyr Ser Cys Asp Asn Ala Leu Phe Leu Gln20 25 30Leu Glu Asp Arg Ser Phe Phe Ile Thr Asp Ser Arg Tyr Thr Gln Glu35 40 45Ala Lys Glu Ser Ile Gln Pro Lys Asn Gly Val Leu Ala Glu Val Ile50 55 60Glu Ser Ser Asp Leu Val Gln Ser Thr Ile Asp Leu Ile Ala Lys His65 70 75 80Ser Val Lys Lys Leu Phe Phe Asp Pro Asn Gln Val Asn Leu Gln Thr85 90 95Tyr Lys Arg Leu Asp Ser Ala Ile Gly Asn Lys Val Ile Leu Glu Gly100 105 110
Val Pro Ser Tyr His Arg Gln Lys Arg Ile Ile Lys Asn Asn His Glu115 120 125Ile Gln Leu Leu Lys Lys Ser Gln Ala Leu Asn Val Glu Ala Phe Glu130 135 140Asn Phe Ala Glu Tyr Val Lys Lys Ile Phe Asp Glu Lys Glu Ser Leu145 150 155 160Ser Glu Arg Tyr Leu Gln His Lys Val Lys Asp Phe Leu Thr Lys Glu165170 175Gly Val Tyr Asp Leu Ser Phe Glu Pro Ile Leu Ala Leu Asn Ala Asn180 185 190Ala Ser Lys Pro His Ala Leu Pro Ser Ala Lys Asp Phe Leu Lys Ala195 200 205Glu His Ser Ile Leu Leu Asp Met Gly Ile Lys Tyr Glu Arg Tyr Cys210 215 220Ser Asp Arg Thr Arg Thr Ala Phe Phe Asp Pro Lys Asp Phe Val Phe225 230 235 240Lys Arg Glu Gln Ser Phe Lys Asp Lys Glu Ser Gln Lys Ile Tyr Asp245 250 255Ile Val Lys Glu Ala Gln Glu Lys Ala Ile Ser Gly Ile Arg Ala Gly260265 270Met Thr Gly Lys Glu Ala Asp Ser Leu Ala Arg Gly Val Ile Ser Asp275 280 285Tyr Gly Tyr Gly Gln Tyr Phe Thr His Ser Thr Gly His Gly Ile Gly290 295 300Leu Asp Ile His Glu Leu Pro Tyr Ile Ser Ser Arg Ser Glu Thr Ile Leu
305 310 315 320Glu Glu Gly Met Val Phe Ser Val Glu Pro Gly Ile Tyr Ile Pro Gly325 330 335Phe Phe Gly Val Arg Ile Glu Asp Leu Val Val Ile Lys Asn Ser Arg340 345 350Ala Glu Leu Leu355<210>2<211>1071<212>DNA<213>幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)<400>2atgaaaggat tagaaagaga atcgcatttc acgcttgatg aaaacgcgat gttttttgag60tgtgcttata gttgcgataa tgctttgttt ttgcaattag aggatcgctc gttttttatc120actgattctc gctacactca agaagctaaa gaaagcattc agcctaaaaa tggcgtttta180gcggaagtga tagaatccag cgatttagtc caaagcacga ttgatttgat cgcaaaacac240tcggttaaaa agctcttttt tgatcccaat caagtgaatt tgcaaaccta caagcgtttg300gattcggcga ttgggaataa ggttatttta gagggcgtgc ctagttacca ccgccaaaaa360cgcatcatta aaaacaatca tgagatccaa ctcctcaaaa aatctcaagc gttgaatgtt420gaagcttttg aaaattttgc cgagtatgtg aaaaagattt ttgatgaaaa agagtccttg480agcgagcggt atttgcagca taaggttaag gactttttga ctaaagaggg ggtttatgat540ctgagctttg agcctatttt agccttgaat gcgaacgcga gcaaacccca tgctttgcct600agtgcgaagg attttttaaa agcggagcat agcattcttt tggatatggg gatcaaatac660gaacgctatt gctcggatag gactcgcacg gctttttttg accctaaaga ttttgtcttc720aaaagagagc agagtttcaa ggataaagag agtcaaaaga tttatgacat tgtgaaagaa780gcgcaagaaa aggctatttc aggtattaga gcgggcatga ccggtaaaga agcggacagc840ttggctaggg gagtgattag cgattatggt tatgggcaat atttcactca cagcactgga900catggcattg gcttagacat tcatgagctt ccttatattt catcgcgcag tgaaaccatt960ttagaagagg gcatggtgtt ttctgtagag cctgggattt atatccctgg attttttggg1020
gtgcgcattg aagatttagt ggtgatcaaa aattctaggg ctgagctttt g1071<210>3<211>32<212>DNA<213>螺旋桿菌(licobacter pylori)<400>3gacgacgaca agatgaaagg attagaaaga ga32<210>4<211>37<212>DNA<213>幽門螺旋桿菌<400>4gaggagaagc ccggttacaa aagctcagcc ctagaat3權利要求
1.一種細胞毒蛋白，含有與由序列No.1表示的氨基酸序列具有至少70％或更高一致性的蛋白質。
2.權利要求1所述的細胞毒蛋白的部分肽，其特征在于該蛋白質具有與由序列No.1表示的氨基酸序列相同的細胞毒活性。
3.權利要求1或權利要求2的細胞毒蛋白，其中該蛋白質由幽門螺旋桿菌生成。
4.權利要求1或權利要求2的細胞毒蛋白，其中該蛋白通過培養用重組載體轉化的轉化體而獲得，該重組載體含有編碼權利要求1或2的細胞毒蛋白的序列No.2的DNA。
5.權利要求4的細胞毒蛋白，其中該轉化體以保藏號FERMBP-8218被保藏于國家先進工業科技研究所(IPOD)。
6.一種含有權利要求1或2的細胞毒蛋白的抗腫瘤試劑。
7.一種特異地對抗該細胞毒蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體通過用權利要求1或2的細胞毒蛋白免疫哺乳動物而獲得。
8.如權利要求7的單克隆抗體，由保藏號為FERM BP-8222的雜交瘤細胞克隆生成。
9.如權利要求7的單克隆抗體，由保藏號為FERM BP-8223的雜交瘤細胞克隆生成。
10.如權利要求7的單克隆抗體，由保藏號為FERM BP-8224的雜交瘤細胞克隆生成。
11.特異地對抗該細胞毒蛋白的多克隆抗體，該多克隆抗體通過將權利要求1或2的細胞毒蛋白免疫哺乳動物而獲得。
12.用于檢測和診斷權利要求1或2的細胞毒蛋白的方法，其中權利要求7～11中任意一項所述的單克隆抗體或多克隆抗體被使用。
13.用于預防和治療由權利要求1或2的細胞毒蛋白引發的胃癌、胃炎、胃潰瘍的試劑，其中權利要求7～11中任意一項所述的單克隆抗體或多克隆抗體被使用。
14.用于篩選促進或抑制權利要求1或2的蛋白質的活性的化合物的方法，其中細胞增殖抑制活性、細胞毒活性或細胞死亡通過使用溫血動物細胞的陰性或陽性對照組之間的比較而被判斷。
15.用于篩選促進或抑制權利要求1或2的蛋白質的活性的化合物或其鹽的試劑盒，其中包括權利要求1或2的蛋白質。
16.促進或抑制權利要求1或2的蛋白質的活性的化合物或其鹽，其中該化合物通過權利要求14的篩選方法或使用權利要求15的篩選試劑盒而獲得。
17.含有化合物或其鹽的藥物，其中該化合物具有抑制權利要求1或2的蛋白質的溫血動物細胞的細胞毒活性的活性。
18.權利要求17的藥物，該藥物為用于預防或治療胃炎、胃潰瘍、胃癌及通過權利要求14的篩選方法或使用權利要求15的篩選試劑盒而顯示為由M毒素所導致的疾病的試劑。
全文摘要
本發明涉及一種新的由幽門螺旋桿菌生成的細胞毒蛋白質(M毒素、粘膜層破壞毒素)及該細胞毒蛋白的應用。本發明提供了由幽門螺旋桿菌產生的細胞毒蛋白(M毒素)、部分肽和含有該細胞毒蛋白的抗腫瘤試劑。該蛋白通過培養用含有編碼該細胞毒蛋白的DNA的重組載體轉化的轉化體而獲得。本發明進一步提供了該蛋白的應用。
文檔編號G01N33/53GK1599750SQ0282440
公開日2005年3月23日 申請日期2002年12月5日 優先權日2001年12月5日
發明者大野博之, 稅所宏光, 丹沢秀樹 申請人:大野博之