具有光聚合溶膠－凝膠組分的分離柱和相關的方法

專利名稱：具有光聚合溶膠－凝膠組分的分離柱和相關的方法
技術領域：
本發明的領域本發明一般地涉及分離柱，和特別地涉及包括光聚合溶膠-凝膠組分的分離柱和相關的方法。
本發明的背景在過去的十年中，毛細管區帶電泳(CZE)，以它的高的峰容量(即每單位時間分離的峰的數目)，已經發展成利用它們的電泳淌度來分離離子物質的有效的和廣泛使用的技術。在CZE中對于未帶電荷的被分析物的選擇性的缺乏仍然是有問題的。已經開發了幾種方法，如膠束的動電學色譜分析(MEKC)，可通過提供假靜止相(其中未帶電荷的化合物能夠被分離)有助于克服這一問題。MEKC之類的方法的應用是受限制的，因為能夠用于該技術中的假靜止相的有限數量。隨著毛細管電色譜法(CEC)的到來，其中結合了色譜分析和電泳轉運機理，能夠以高的拆分和效率使用低樣品體積來實現未帶電荷的被分析物的混合物的分離和分析。CEC在分析應用中的更多興趣歸因于所實現的大的板數和較高分離速度和所能夠使用的寬范圍的靜止相(通常用于高效液相色譜中的那些)。雖然CEC已經用于許多不同領域，但是填充柱制備和低的探測靈敏度使這一技術面臨挑戰。含有小的硅石填充物的毛細管柱已經成為CEC的主要依靠。填充柱的一個缺點是具有控制的孔徑、長度和高的機械穩定性的多孔熔結玻璃料(frit)的制造。雖然與熔結玻璃料對此類毛細管性能的影響有關的系統研究還沒有報導，但是應該認為這些熔結玻璃料能夠降低這些毛細管柱的效率。盡管如此，當分離柱需要使用熔結玻璃料的填充材料時，仍然希望具有簡單和可再現的制造熔結玻璃料的程序。用于顆粒填充柱的熔結玻璃料制造的常規方法包括填充材料如十八烷基硅石微粒(ODS)的區段的熱燒結。這一方法具有幾個缺點，包括(1)可靠地和可再現地生產熔結玻璃料的困難，(2)在熔結玻璃料本身中靜止相的特性的改變，(3)控制熔結玻璃料的孔隙度的困難，(4)在熔結玻璃料的位置處該毛細管的薄弱，(5)由熔結玻璃料引起的譜帶增寬，(6)在熔結玻璃料上氣泡形成和極性被分析物的吸附。這些問題能夠直接影響柱性能和柱-到-柱的可再現性。另一種方法已經被報道用于毛細管柱的制備，它避免了與淤漿和動電學填充物有關的熔結玻璃料制造和柱制造的技術問題。一種方法使用結合的靜止相。然而以這種方式制備的毛細管柱會遇到低的保留率和低的樣品容量和長的制備時間。用于開口毛細管柱的制備的另一種方法使用整體單段的(monolithic)填充技術。例如，已經描述了裝載了以溶膠-凝膠化學為基礎的色譜分析的顆粒的整體單段型多孔毛細管柱的制備和表征(參見，例如，Dulay等人，Anal.Chem.，70，5103-5107頁，1998)。整體單段型毛細管柱已經受到很多的關注，因為在滲透性和表面電荷的控制中所獲得的優點。在CEC技術中的主要挑戰是含有低濃度的被分析物的樣品的檢測。在低濃度下的敏感性的缺乏歸因于小的樣品容積和在線檢測的短的光程長度。在樣品注入之前富含目標被分析物的專用樣品制備歷程常常是為了獲得許多現實世界分析的必要敏感性所需要的。歷程如溶劑-溶劑萃取和固相萃取常常是非常乏味的和耗時的。這些歷程的替代是在線預濃縮。在氣相色譜中，這一目標通過讓氣流通過冷柱(隨后加熱)來實現。在高性能液相色譜(HPLC)中，這一工藝通常利用梯度HPLC來進行，其中對于第一種溶劑與對于后繼的溶劑相比，被分析物更加強烈地保留在柱上。在線的預濃縮也享受著在電泳分離中的一些成功。例如，在毛細管電泳(CE)中，這些包括等速電泳，樣品堆積，清掃，和動態pH交點的使用。在CZE中，已經說明在樣品和背景溶液區域之間的電場強度的變化能夠聚集(即堆積)帶電荷的物質(參見，例如，F.E.P.Mikkers，F.M.Everaerts，P.E.M.Verheggen，J.Chromatogr.169(1979)，pp.1-10和R.L.Chien，D.S.Burgi，Anal.Chem.64(1992)pp.489A-496A)。在動電學色譜分析中，已經顯示膠束能夠用于濃縮(即清掃)中性和帶電荷的物質(參見，例如，J.P.Quirino，S.Terabe，Science，282(1998)pp.465-68和J.P.Quirino，S.Terabe，Anal.Chem.71(8)(1999)pp.1638-44)。在使用顆粒(例如，十八烷基硅石)填充柱的CEC中，已經報道了與在梯度高效液相色譜法中類似的聚集效應。這些聚集效應通過使用(1)分步梯度洗脫，(2)在非洗脫溶劑中的樣品的制備，或在樣品注入之后水栓的注射，來實現。M.R.Taylor，P.Teale，D.Westwood，D.Perrett，Anal.Chem.69(1997)pp.2554-58最先于1997年報道了分步梯度在甾族樣品的預濃縮中的應用。D.A.Stead，R.G.Reid，R.B.Taylor，J.Chromatogr.A 798(1998)pp.259-67利用使用非洗脫樣品基體(matrix)的預濃縮來實現了甾族化合物的混合物的檢測靈敏度的17倍增加。Y.Zhang，J.Zhu，L.Zhang，W.Zhang，Anal.Chem.72(2000)pp.5744-47也使用非洗脫溶劑分別將苯偶姻和乙基苯基-N-甲基-乙內酰脲預濃縮134和219的因數。C.M.Yang，Z.El Rassi，Electrophoresis 20(1999)pp.2337-42報道了通過使用在長栓塞的樣品之后所注射的短栓塞的水，對殺蟲劑的稀釋樣品的預濃縮。M.J.Hilhorst，G.W.Somsen，G.J.de Jong，Chromatographia 53(2001)pp.190-96說明了通過使用非洗脫基體和分步梯度洗脫，對在結構上相關的甾族化合物的預濃縮。報道在敏感性上獲得了7到9倍的增加。類似地，T.Tegeler，Z.El Rassi，Anal.Chem.73(14)(2001)pp.3365-72最近剛剛報道了通過聯合使用非洗脫基體和分步梯度洗脫，在氨基甲酸酯類殺蟲劑的混合物中被分析物的預濃縮。最高允許樣品栓塞長度是大約20cm和對于蟲螨威(carbofuran)實現了500倍的敏感性提高。由張(Zhang)的同事實現了檢測靈敏度的進一步提高，它將電場增強的樣品注射與溶劑梯度洗脫相結合。他們說明了在帶正電荷的被分析物，propatenene，的峰高度上的17,000倍增加。所以希望能夠容易地制造具有相對于前述方法而言有改進性能的分離柱。
本發明概述根據本發明的實施方案，分離柱包括分離通道和在通道中的多孔基體。多孔基體包括金屬有機光聚合物。在這一實施方案中，多孔基體優選不包含色譜分析的顆粒和一般是均勻的。在本發明的實施方案中，該分離柱可以包括毛細管柱。在本發明的另一個實施方案中，多孔基體能夠包括被設計來將分離介質保留在通道中的熔結玻璃料。該熔結玻璃料能夠具有可控孔隙率和能夠從可光致固化的、甲基丙烯酸酯取代的硅酸鹽形成。因為光聚合反應一般利用輻射來引發，熔結玻璃料的位置能夠定位和該孔隙度可再現地控制。在本發明的又一個實施方案中，多孔基體可以包括分離介質，后者被設計來預濃縮和分離被分析物，沒有色譜分析的顆粒的存在。該分離介質可以是非熔結玻璃料(fritless)。可以相信，該分離柱允許預濃縮和分離出比使用色譜分析的顆粒的分離柱更大體積的被分析物。本發明進一步包括制備分離柱的方法。根據本發明的方法的一個實例，混合物是被引入毛細管柱。混合物包括金屬有機化合物。混合物在毛細管柱中經過輻射而利用光引發聚合反應來形成固體多孔基體。在這一實施方案中，多孔基體優選不包含色譜分析的顆粒。沒有色譜分析的顆粒的分離柱的制備是比制備有色譜分析的顆粒的分離柱相對容易。制備多孔基體的光化學途徑具有許多優點(1)短的制備時間，(2)孔隙大小的控制，(3)多孔基體的鍵接和長度的控制，(4)高的機械強度，和(5)導致開裂的高溫的避免。本發明也包括分離被分析物樣品的方法。根據本發明的實施方案，該方法首先提供包括分離通道和位于分離通道中的分離介質的分離柱。該分離介質包括多孔基體，和多孔基體是由金屬有機光聚合物形成和優選不包含色譜分析的顆粒。接著，在溶液中攜帶的被分析物樣品通過該柱。該分離介質將被分析物預濃縮在柱中。然后溶液被引起流過該分離柱，因此分離并洗脫該被分析物。該分離介質既預濃縮又分離該被分析物。除了由分離介質所發揮的作用之外，預濃縮能夠進一步通過溶劑梯度或樣品堆積來增強。
附圖的簡述在結合附圖閱讀下面的詳細說明之后，本發明的以上和其它特征和方面將變得更清楚，其中

圖1A是根據本發明的實施方案的分離柱的剖視圖；圖1B是分離柱的透視示意圖，其中多孔基體用作根據本發明的實施方案的分離介質；圖1C是分離柱的透視示意圖，其中多孔基體作為被設計來保留根據本發明的實施方案的分離介質的兩種熔結玻璃料來使用；圖2A和2B是使用本發明的實施方案的兩個代表性的電色譜圖，顯示了(a)一根柱和(b)另一根柱的吸收率/保留時間的曲線；圖3是顯示了使用本發明的實例的吸收率/保留時間的曲線的代表性色譜圖；圖4A和4B是本發明的實施方案的SEM顯微照片；圖5A和5B是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了不同被分析物的吸收率/保留時間的曲線；圖6是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖7(a和b)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖8(a，b，和c)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖9(a，b，c，d，和e)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖10是顯示使用本發明的實施方案的峰高比的對數對樣品中水的百分比的曲線的圖示；圖11(a，b，和c)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖12A，12B和12C是顯示使用本發明的實例的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖13(a和b)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖14(a，b，c，d，和e)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖15(a，b，c，d，e，和f)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖16(a和b)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖17(a，b，c，d，和e)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖18是根據本發明的實施方案制備的出口熔結玻璃料的SEM顯微照片；圖19是根據本發明的實施方案制備的進口熔結玻璃料的SEM顯微照片；圖20是根據本發明的實施方案制備的毛細管的填充段的截面的顯微照片；圖21A和21B是分別在填充柱和整體單段式柱上的NBD-DL-丙氨酸(Ala)和NBD-DL-蘇氨酸(Thr)的樣品的電色譜；圖22是在填充多段式柱上NBD-DL-Phe的電色譜；圖23是使用大內徑毛細管的硫脲和5種烷基苯基酮類的分離的電色譜；圖24是使用大內徑毛細管的硫脲和丙酰苯的分離的電色譜；圖25是使用大內徑毛細管的硫脲和丙酰苯的分離的第二個電色譜；為了描述的簡單起見，同樣的符號用于在本申請中同樣或相似的部分。
詳細說明具有光聚合溶膠-凝膠(PSG)組分的分離柱圖1A是根據本發明的實施方案制備的分離柱11的縱向剖視圖。該分離柱11包括在毛細管柱12內的分離通道13，和在分離通道13內的多孔基體15。在本發明的不同實施方案中，分離柱11能夠采取不同的形式，包括但不限于另一種類型的管或平面片，并且能夠進一步包括檢測窗口。毛細管柱12能夠具有許多不同的橫截面，其中包括但不限于圓截面。在另一個實施方案中，毛細管柱12能夠具有伸長的橫截面。這些和其它橫截面對于毛細管柱12是可能的并且是在本發明的范圍內。毛細管柱12能夠是典型地由熔凝硅石制造的圓形毛細管。毛細管的內徑(i.d.)能夠是約10μm到約1000μm，和更可能在75μm到500μm范圍。正如所指出的那樣，毛細管柱12能夠另外是平面片或限定空間，如由兩個片所限定而成的柱。根據本發明的實施方案，多孔基體15能夠用于許多不同應用中。在一個實施方案中，在圖1B中所示，多孔基體15作為被設計來預濃縮和/或分離被分析物的分離介質20來使用。在這一實施方案中，多孔基體15傾向于包括一般均勻的較長的和連續的結構。正如這里所使用的，術語“整體單段(monolith)”是指用作分離介質的較長和連續的多孔基體15。在另一個實施方案中，在圖1C中所示，多孔基體15作為被設計來將分離介質保留在分離通道13內的熔結玻璃料22來使用。一般，兩種熔結玻璃料22用于保持該分離介質，一種在進口熔結玻璃料中和另一種是出口熔結玻璃料。在這一實施方案中的分離介質(在圖1C中未顯示)能夠包括許多材料，其中包括但不限于填充的、球形的ODS顆粒或手性顆粒。在圖1C中該顆粒位于熔結玻璃料22之間。在這一實施方案中，多孔基體15傾向于包括較短的結構，當與圖1B的實例對比時，其中多孔基體15用作實際分離介質20本身。在又一個實施方案中，多孔基體15作為固相萃取材料來使用。在這一類型的使用的一個實例中，多孔基體15能夠用于將蛋白質與生物材料樣品中的鹽分離。這是有益的，因為鹽常常引起對用于測量或分析樣品中蛋白質的儀器的損害。而在又一個實施方案中，多孔基體15用作化學反應器。例如，蛋白質能夠保留在多孔基體15上，和酶然后被加入到多孔基體15中與蛋白質反應。所形成的肽能夠隨后被多孔基體15分離。多孔基體15填充分離通道13的至少一部分并能夠附著于分離通道13的通道壁17上。優選，多孔基體15可以以共價鍵鍵接于該通道壁17上。與已知的分離介質不同，多孔基體15是均勻的和不含有色譜分析的顆粒。均勻的分離介質的使用是有利的，因為，在一些已知的應用中，色譜分析的顆粒的使用會引入不需要的變寬(即拆分度不足)。在本發明的其它實施方案中，多孔基體15能夠分成兩段，該兩段被另一個段如具有不同的孔隙大小或表面電荷的整體單段所分開。根據本發明的實施方案，多孔基體15通過使用金屬有機光聚合物來形成。該光聚合物的前體能夠包括金屬醇鹽。該金屬可以是任何數目的金屬，包括但不限于鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅和鋯。例如，如果所選擇的金屬是硅，則相應的金屬醇鹽是硅烷。根據本發明的實施方案，該前體能夠進一步包括光活性基團如甲基丙烯酸酯。例如，該前體能夠是甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知為甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。在其它實施方案中，該光活性基團能夠是不同的丙烯酸酯或任何其它合適光活性基團。不同的官能化或衍生化單體可用于多孔基體15的形成。單體的選擇影響多孔基體15的物理性能，如孔隙大小，孔隙形狀，聚合物電荷密度，和疏水性。利用不同孔隙產生劑(porogen)控制孔隙尺寸和形狀能夠獲得具有寬的孔隙尺寸分布(即孔隙尺寸梯度)的多孔基體15。
光聚合溶膠-凝膠(PSG)分離介質根據本發明的實施方案，多孔基體15能夠包括分離介質。一般，當多孔基體15用作分離介質時，在分離通道13中不需要熔結玻璃料來將分離介質保持在位。作為分離介質的多孔基體15傾向于對被分析物具有親和性并能夠用于同時預濃縮和分離被分析物的樣品。被分析物的親合性能夠由被分析物的保留系數，k，來表述。該保留系數，k，能夠通過下列方程式測定 該保留系數k也能夠表達為k=tR-t0t0---(2)]]>其中tR是被分析物的遷移時間，和t0是“未保留”被分析物的遷移時間。該保留系數受到溶劑的性質，被分析物的性質，柱的長度，多孔基體的滲透性，多孔基體的疏水性，和多孔基體的詳細形態的影響。分離柱11能夠用于許多不同的目的，其中包括分析或半制備的工作。被分析物分離到亞毫克到毫克級量對于在分離柱11上的預濃縮而變得可能。例如，超過約100nL的處于mM水平的被分析物濃度下的樣品溶液能夠注入到該柱中，但沒有超負載的明顯證據。正如所指出的那樣，利用不同孔隙產生劑(porogen)控制孔隙尺寸和形狀能夠獲得具有孔隙尺寸梯度的多孔基體15。從具有孔徑尺寸梯度的多孔基體15形成的分離介質能夠用作毛細管電泳和毛細管電色譜法中的“分子分類器”。此類分離介質能夠分離尺寸結構或化學性質不同的大分子的混合物(例如，DNA片段)。另外，分離柱11能夠為反轉相，尺寸排阻，親合性，離子交換色譜分析等等而設計。另外地，從多孔基體15形成的分離介質可以是從單體的混合物制備的混合相多孔基體。例如，該單體可以包括甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷，和雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷。該混合相多孔基體能夠具有不同的性能，如疏水性。
光聚合溶膠-凝膠熔結玻璃料根據本發明的另一個實施方案中，多孔基體15可用于在毛細管柱中形成光聚合物熔結玻璃料。光聚合物方法具有與現有燒結硅石方法相比的幾個優點，其中包括(i)容易和快速的制備，(ii)在室溫下短的反應時間，(iii)光聚合物的UV透明度，(iv)孔徑尺寸的精確控制，和(v)熔結玻璃料長度和熔結玻璃料位置的控制。在本發明的一個實施方案中，光聚合物熔結玻璃料通過光固化甲基丙烯酸酯取代的硅酸鹽來制備。合適的光固化型溶膠-凝膠是本技術中已知的并用于實施本發明的這一方面。簡要地說，單體如3-(三甲氧基甲硅烷基)甲基丙烯酸丙基酯(MAPTMS)經過輻射而形成溶膠-凝膠基體。在另一個的實施方案中，其它合適單體包括但不限于金屬有機單體，如金屬醇鹽。當凝膠固化時，獲得硬的多孔玻璃。當產生用作熔結玻璃料的多孔基體15時，能夠使用孔隙產生劑。在不同的實施方案中，該孔隙產生劑可以是溶劑(例如甲苯或己烷和甲苯的1∶1混合物)，聚合物，或無機鹽(例如氯化鈉粉末或硫酸鈉)。聚合物孔隙產生劑的例子包括聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯。其它孔隙產生劑包括，但不限于，苯，乙腈，異辛烷，己烷，醇，四氫呋喃，和丙酮。根據本發明的實施方案，異辛烷和甲苯的混合物能夠作為孔隙產生型溶劑用于以甲基丙烯酸酯為基礎的多孔聚合物的制備。在多孔基體15中的孔徑尺寸能夠通過不同孔隙產生型溶劑的使用來控制，和進一步通過在單體和孔隙產生劑的摩爾比率上的變化來控制。大到5.0微米和可能更大的孔徑尺寸能夠通過使用本發明的方法來形成。
制備分離柱的方法本發明進一步包括制備分離柱11的方法。在本發明的實施方案中，該方法使用典型地由熔凝硅石形成的圓形毛細管柱12而形成分離柱11。毛細管柱12的內徑(i.d.)能夠是約10μm到約1000μm，和優選是在75μm到500μm范圍。根據本發明的方法的一個實例，多孔基體15是形成內部毛細管柱12使用A混合物那些 通過使用一般包括金屬有機單體，孔隙產生劑和光引發劑的混合物在毛細管柱12內形成多孔基體15。混合物被引入到用于形成分離柱11的毛細管柱12中，并通過使用注射器讓混合物流過毛細管柱12而引入。毛細管柱12的末端因此被密封。在進行光引發的聚合反應之后，混合物形成固體多孔基體。用于混合物中的金屬有機單體可以是金屬醇鹽，如硅烷，或金屬醇鹽的混合物。該金屬可以包括以下任何一種，但不限于鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅，或鋯。金屬醇鹽能夠包括光活性基團，如甲基丙烯酸酯。在一個實施方案中，該前體(這里金屬醇鹽和光活性基團)能夠包括甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知為甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。在另一個實施方案中，該前體可以是甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和另一種前體，如雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷或雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷的混合物。在本發明的實施方案中，金屬醇鹽能夠被添加到用于前體的水解的酸或堿催化劑中。該催化劑將烷氧基轉化為羥基。例如，硅烷能夠經歷下列水解反應而形成全水解的硅烷(3)該水解反應能夠在部分水解的硅烷，Si(OR)4-n(OH)n上停止。該金屬有機單體和催化劑能夠攪拌一段時間，常常在幾秒到二十四小時范圍。正如所指出的那樣，混合物也包括孔隙產生劑或孔隙產生劑的混合物。孔隙產生劑能夠與金屬有機單體和催化劑混合，和混合物攪拌攪拌一段時間，再次在幾秒到二十四小時范圍。在這一時間中，該金屬有機單體傾向于經歷縮合反應而形成二聚物，三聚物，和其它低聚物。例如，部分水解的硅烷能夠經歷下列縮合反應(4)較大的低聚物能夠通過提高反應的溫度來形成。該孔隙產生劑提供分子模板而在多孔基體15內形成孔隙。例如，如上所述，該孔隙產生劑能夠是溶劑，聚合物，或無機鹽。能被使用的溶劑包括甲苯或己烷和甲苯的1∶1混合物；能被使用的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯；和能被使用的無機鹽包括氯化鈉粉末或硫酸鈉。多孔基體15的孔隙度(即孔隙大小和形狀)可以通過所使用的孔隙產生劑的類型以及它在反應溶液中的體積或濃度來控制。例如，單體與孔隙產生劑的克分子或體積比能夠經過選擇以在混合物中形成孔隙。通過調節單體和孔隙產生劑的摩爾比率，多孔基體15的物理性能(例如，孔隙尺寸)可以得到控制。當混合物被輻射時該聚合過程開始，并且光引發劑或在單體上的光活性基團吸收來自輻射源的輻射。這啟動了光化反應，該反應會催化金屬有機化合物的聚合反應而在毛細管柱12內形成均勻的多孔基體15。毛細管柱12能夠在一段短時間如大約五分鐘暴露于輻射。輻射能夠包括可見光或紫外光，和輻射的波長取決于用于該反應中的光引發劑或光活性基團的類型。如果用于形成分離柱11的毛細管柱12具有對光源不透明的外涂層，則涂層首先被除去以制造輻射窗口。涂層的長度將決定了在分離柱中所形成的多孔基體15的長度。該光活性基團甲基丙烯酸酯能夠在約300nm或365nm的波長下光聚合，如分別在C.Yu，F.Svec，J.M.J.Frechet，Electrophoresis 21(1)(2000)pp.120-27和H.-G.Woo，L.-Y.Hong，S.-Y.Kim，S.-H.Park，S.-J.Song，H.-S.Ham，Bull.Korean Chem.Soc.16(1995)pp.1056-59中所報道。在其它實施方案中，所使用的光引發劑能夠是Irgacure 1800，它在大約365nm的波長下光聚合。Irgacure1800是從Ciba Geigy，Tarrytown，New York獲得。多孔基體15的制備的光化學途徑具有與形成基體的其它已知方法相比的許多優點，其中包括短的制備時間，基體的孔隙大小的精確控制，多孔基體15的鍵接(placement)和長度的控制，高的機械強度，和導致毛細管柱12或基體的開裂的高溫的避免。此外，根據本發明的方法所形成的多孔基體15不需要熔結玻璃料或色譜分析的顆粒，因此分離柱11的制備是比使用熔結玻璃料或色譜分析的顆粒的已知分離介質的制備更容易。在本發明的方法的實例中，在多孔基體15形成之后讓有機溶劑通過分離柱11以除去任何未反應的物質，孔隙產生劑，和光引發劑。能被使用的一種此類有機溶劑是乙醇。溶劑能夠通過使用注射器或其它器具而流過該分離柱11。分離柱11也能夠在分離柱11用于分離被分析物之前用分離溶液調理。分離溶液能夠包括緩沖劑，如含水乙酸銨，和洗脫溶劑，如乙腈。
分離被分析物樣品的方法本發明也包括分離被分析物樣品的方法。首先，該被分析物在分離柱11上預濃縮。這通過讓在樣品溶液中含有的被分析物樣品通過分離柱11來進行。被分析物能夠包括中性物質，如多環芳族烴，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物，和帶電荷的物質，如肽。樣品溶液能夠包括緩沖劑，如含水乙酸銨，和洗脫溶劑，如乙腈。樣品溶液能夠通過對分離柱11施加電壓或壓力而被引起流過分離柱11。如果使用壓力，則在大多數的分離柱11上施加的壓力典型地是在0psi到20psi范圍。如果必要，對于分離柱11也能夠使用更大的壓力，尤其當使用具有較大內徑的分離柱11時。該壓力能夠施加各種時間長度，在一秒到半小時之間。如果使用電壓，大約40V/cm的電場強度能夠對大多數的分離柱11施加一段時間。應該指出，所使用的具體壓力或電壓將以許多因素為基礎來變化，其中包括所使用的分離柱的設計。注射栓塞長度也發生變化，和超過兩厘米的栓塞長度能夠被注入到分離柱11中。隨著樣品溶液穿過分離柱11，多孔基體15將被分析物預濃縮在該柱上。預濃縮的程度純粹地取決于保留系數，該k值。該保留系數受到許多因素的影響，其中包括溶劑的性質，被分析物的性質，和分離介質的詳細形態。該流速最低限度地影響了預濃縮的程度。多孔基體15的高孔隙度的性質導致了對于被分析物的高質量轉移速率，它促進該預濃縮效果。高質量轉移速率起因于被分析物對于多孔結構的結合部位的增強的可達到性。因為高質量轉移速率，被分析物-多孔基體相互作用的動力學(即被分析物在移動相和靜止相之間的分配)不是該分離中的速率限制步驟。高質量轉移速率使得該分離方法區別于先前形式的色譜分離。對于這一分離方法，因為高質量轉移速率，有可能注入和濃縮更大體積的樣品溶液，與含有正常的色譜分析材料的柱相比而言。總的預濃縮效果與保留系數k成正比，其中較長的注射栓塞長度(例如，大于約25mm)導致具有低k值的被分析物的嚴重的峰加寬。這一行為暗示了在峰形狀折中之前，有著各被分析物的樣品栓塞的最大長度。在線預濃縮的主要優點是它降低了給定的被分析物的檢測極限。另一個優點是，當多孔基體15用于固相萃取時，預濃縮可用于為被分析物清除在樣品基體中見到的可能的干擾物質。在預濃縮階段之后，分離溶液通過分離柱11以分離和洗脫該被分析物。該分離溶液能夠通過使用以上對于樣品溶液所述的相同技術，即施加壓力或電壓，而通過分離柱11。再次，施加的壓力能夠是在大多數的分離柱上大約0.5psi到大約20psi范圍，典型地經歷一秒到半小時的一段時間。如果使用電壓，大約40V/cm的電場強度能夠對大多數的分離柱11施加一段時間。正如以上所指出，所使用的具體壓力或電壓將以許多因素為基礎來變化，其中包括所使用的分離柱的設計。分離溶液能夠包括緩沖劑，如含水乙酸銨，和洗脫溶劑，如乙腈。在一個實施方案中，該分離溶液與樣品溶液相同。多孔基體15用于從溶液中萃取被分析物以及為被分析物的色譜分離提供靜止相。正是這一萃取器-分離器聯合，使得這一方法與已知方法相比有優點。例如，具有超過約兩厘米的栓塞長度的樣品溶液能夠裝載到分離柱11中并使用與該樣品溶液相同的分離溶液來預濃縮。在一個實施方案中，除了由多孔基體15所發揮的效果，溶劑梯度可用來進一步增強被分析物的預濃縮。在這一實施方案中，樣品能夠溶于溶液中，后者具有比在分離溶液中更高濃度的緩沖劑(例如，水)。緩沖劑在樣品溶液中的較高濃度會提高樣品對靜止相的親合性。當使用溶劑梯度時，栓塞長度能夠長于分離柱11的長度。例如，使用本發明已經發現，91.2cm栓塞的注射，它是毛細管的總長度的三倍以上，是可能的，而僅僅在拆分率上有輕微損失。在梯度條件下獲得的峰高度的改進能夠是大于一千倍。對于中性被分析物，現有在多孔基體15上使用梯度的兩種途徑。第一種途徑是提高在分離溶液和樣品溶液之間的有機溶劑比率。第二種途徑是通過提高水在分離溶液中的百分比，同時維持在分離溶液和樣品溶液之間有機溶劑的合理百分比，來提高在分離中的保留系數k。分析對于第一種途徑是更快的，而拆分率對于第二種途徑是更好的。在本發明的另一個實施方案中，除了由多孔基體所發揮的效果，樣品堆積可用來進一步增強被分析物的預濃縮。樣品堆積是帶電荷的被分析物的聚集，當該被分析物經過分開高和低電場強度的區域的濃度邊界時。高的電場區域是含有更多洗脫溶劑的較低導電性樣品溶液，而低電場區域是較高導電性分離溶液。該洗脫溶劑，如乙腈，具有比緩沖劑如乙酸銨水溶液更低的導電性。因此，較高濃度的洗脫溶劑導致降低樣品基體導電性。在樣品堆積中，用分離溶液制備分離柱11。當被分析物被引入該分離柱中和施加電壓時，樣品溶液中的被分析物在柱的進口快速地加速移向早已在柱中存在的分離溶液(較低電場強度)，而穿越在樣品溶液和分離溶液之間的邊界時，他們減慢速度并堆積在界面上的窄區段中。樣品堆積基本上是由在濃度邊界上電泳速度的變化所引起。電泳速度是電泳遷移率和電場強度的乘積。當電泳速度在濃度邊界處降低時發生聚集(樣品堆積)。樣品堆積也通過使用等速電泳的基本原理和科爾勞施(Kohlrausch)定律來解釋。現有在多孔基體15上進行樣品堆積的兩種途徑。第一種途徑是提高有機溶劑如乙腈的百分比。第二種途徑是降低緩沖組分在樣品溶液中的濃度。提高乙腈或其它合適有機溶劑的百分比尤其可用于含有高濃度鹽的真實樣品。脫鹽，例如通過透滲析，因此是制備供注射用的較低導電性溶液所不需要的。當脫蛋白質是樣品制備的一部分時，有機溶劑的使用也用于生物樣品。
大體積的被分析物樣品的分離當進行在大體積樣品中的被分析物的分離時，已知的分離技術具有許多相關問題。例如，毛細管電泳(CE)沒有廣泛地用作制備性的分離工具，因為低的樣品體積和在與CE相關的小內徑(i.d.)毛細管的使用中固有的短的檢測通路長度。通過使用一些策略如有分級收集的多次注射和管束式毛細管，僅僅在CE中實現了納摩爾的量的被分析物的荷載。與試圖使用較大i.d.毛細管(200μm i.d.和更大)有關的主要缺點中的一個是焦耳熱的產生。CEC可用于通過使用填充了小直徑色譜分析的顆粒的大i.d.毛細管來分離在大體積樣品中的被分析物。例如，能夠使用具有500μm內徑和填充了1μm球形硅石顆粒的毛細管。該硅石顆粒在至少一些情況下，對于在施加高電壓時在柱中產生的焦耳熱的散逸是有效的。不幸地，顆粒填充柱的大回壓常常防止樣品的高負載。本發明與較大i.d.毛細管的結合使用已經顯示可用于半制備性應用。在本發明的一個實施方案中，分離柱11是通過使用具有較大內徑(例如＞500μm)的毛細管來構造。為了分離大體積的樣品，被分析物首先在這一實施方案的分離柱1l上進行預濃縮。已經顯示，這一技術允許在多孔基體15填充的540μm i.d.毛細管中荷載多達至少8納克(ng)的被分析物(例如，丙酰苯)。本發明利用下列實施例更詳細地進行描述。下列實施例僅僅為了進一步說明和公開本發明而給出，不應該認為限制本發明。實施例1-17討論了PSG分離介質，實施例18討論PSG熔結玻璃料，和實施例19討論使用大i.d.直徑毛細管柱的PSG分離介質。
實施例1原料和化學品。熔凝硅石毛細管(75μm i.d.×365μm o.d.)是從Polymicro Technologies，Phoenix，Arizona商購的。
甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)是從Gelest，Tullytown，Pennsylvania和Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin商購的并且在沒有提純的情況下使用。HPLC-級甲苯，菲，芘，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物是從Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin購得。Irgacure 1800是從Ciba，Tarrytown，New York獲得。安裝儀器。使用帶有UV吸光檢測器的Beckman P/ACE2000毛細管電泳儀來進行全部CEC實驗。XL-1500 UV cross-linker，可從Spectronics Corp.，Westbury，New York獲得，裝有主要地365nm波長的六只15W黑光燈管，用于輻射該反應溶液。在從Eindhoven，Netherlands獲得的Philips SEM 505掃描電子顯微鏡上進行掃描電子顯微鏡(SEM)分析。聚合反應程序。通過將375μl的MPTMS添加到100μl的0.12N HCl中，剛好在使用之前制備單體貯備溶液。這一溶液在室溫下攪拌大約三十分鐘而獲得透明，單相的溶液。將合適量的甲苯(孔隙產生劑)加入到該單體貯備溶液中，如在下表1中所示。
表1 光引發劑，Irgacure 1800，首先被添加到該甲苯中，按照甲苯/單體貯備溶液的總重量的5％。這一光引發劑溶液然后被加到相應量的單體貯備溶液中，并在室溫下攪拌三十分鐘而獲得黃色，單相的溶液。為了最大程度地減少甲苯的蒸發，該溶液是在具有聚硅酮封蓋的管形瓶中制備，在溶液的填充過程中經由該封蓋將毛細管插入。通過使用位于毛細表面的45°角的刀片，除去在30cm長的毛細管上的聚酰亞胺涂層的15cm細條。毛細管的機械穩定性是顯著地優良的，盡管有聚酰亞胺涂層的細條的除去。輻射光僅僅通過該15cm細條進入毛細管。在毛細管中沒有形成整體單段，其中聚酰亞胺涂層(“掩蔽層”)完整無損。通過使用0.5ml一次性注射器，在用溶液裝填該毛細管之前將大約0.2ml的反應溶液沖洗通過該毛細管以便徹底地濕潤壁面。這導致整體單段粘結于毛細血管壁上。不需要毛細血管壁的特殊預處理來將整體單段粘結于壁上。填充好的毛細管在UV cross-linker中使用365nm光進行輻射(900mJ/cm2)五分鐘而形成多孔基體。在輻射后，該毛細管利用手持注射器用乙醇洗滌，以除去未反應的試劑或孔隙產生劑。因為該整體單段是高度滲透性的，不需要高壓來驅動液體通過該毛細管。一旦未反應的試劑被除去，該整體單段變成不透明的并且無需借助顯微鏡就能清楚地透過該毛細管看見。多孔基體的均勻性是在100X放大倍數下證實。緊接著在整體單段區段之后用發煙硫酸燒除聚酰亞胺涂層而形成檢測窗口。一旦制造之后，該毛細管成功地安裝在盒中，沒有任何損害。使用注射器和手持鉗子，該毛細管用分離緩沖液調理大約五分鐘。一次在該儀器中，毛細管進一步通過用分離緩沖液加壓漂洗(20psi)來調理或通過在5kV或10kV下電動力學調理三十分鐘。表征。SEM用于研究分離柱的形態。毛細管被小心地切開以暴露該整體單段。毛細管的切開段用金進行濺射，之后進行SEM分析。被分析物分離。在移動相中制備被分析物，以防止在CEC實驗過程中的梯度效應。該移動相是由各種比率(v/v)的50mM乙酸銨，水，和乙腈組成。新樣品溶液用于每一次注射，以維持在樣品溶液和移動相中相同濃度的乙腈。圖2A是顯示柱B的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離是用50mM乙酸銨/水/乙腈(1/3/6)溶液來進行。樣品溶液在0.5psi壓力下注入達到三秒鐘，和在20℃的溫度下用1kV的外加電壓進行分離和然后在214nm下檢測。分離的洗脫順序是(1)硫脲，(2)四氫呋喃，(3)萘，(4)菲，(5)熒蒽，(6)芘，(7)1，2-苯并蒽，和(8)1，2，5，6-苯并蒽(bienzanthracene)。圖2B是顯示柱D的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離是用50mM乙酸銨/水/乙腈(1/4/5)溶液來進行。樣品溶液在0.5psi壓力下注入達到三秒鐘，和在20℃的溫度下用15kV的外加電壓進行分離和然后在200nm下檢測。分離的洗脫順序是(1)苯，(2)甲苯，(3)乙烯苯，(4)丙基苯，(5)丁基苯，和(6)己基苯。柱的洗脫順序類似于利用比小分子量或較高親水性的被分析物更遲洗脫的較大分子量或較高疏水性的被分析物來進行的反相色譜的洗脫順序。在兩圖中的被分析物的洗脫是在低于七分鐘內進行。氣泡形成不是CEC實驗中的問題，為此典型的操作電流是在3和10μA之間。對于典型的毛細管柱D，對于硫脲，較少保留的化合物，實現了高達100,000板/m的效率。在三天的時間中(n＝33)對于硫脲(0.65％RSD)，萘(1.10％RSD)，菲(1.14％RSD)，和芘(1.14％RSD)觀察到洗脫時間的小變化。圖3是顯示柱D的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離是用50mM乙酸銨/水/乙腈(1/3/6)溶液來進行。樣品溶液在0.5psi壓力下注入達到三秒鐘，和在20℃的溫度下用1kV的外加電壓進行分離和然后在214nm下檢測。硫脲，萘，菲，和芘的樣品是在僅僅20psi(儀器的最高界限)的施加的壓力下在110分鐘中被分離。峰拖尾對于芘是最嚴重的，因為它與多孔基體的強相互作用，但對于硫脲沒有觀察到拖尾，因為硫脲在柱上較低停留。圖4A是在75μm-i.d.毛細管柱中用80％(v/v)甲苯(毛細管B)形成的金屬有機光聚合物的橫截面的掃描電子顯微照片。該顯微照片顯示了1μm球形結構的互連網絡，在其中散布了微米級尺寸的大孔(大到5μm)。圖4B是在75μm-i.d.毛細管柱中用50％(v/v)甲苯形成的金屬有機光聚合物的橫截面的掃描電子顯微照片。與圖4A中示出的多孔基體相反，在圖4B中示出的結構是具有2μm或更低直徑的大孔的致密的光聚合物。因此，在圖4B中的基體是較低滲透性的，和產生相當大的回壓。在接近200psi的壓力下沒有液體被驅動穿過該柱。多孔基體的滲透性是通過多孔基體的線速度來決定，它與滲透性成正比，如在達西定律(Darcy’s law)中所述。多孔基體的滲透性與大孔尺寸的關系高度取決于用于制備光聚合物的孔隙產生劑的體積和類型。對于用90％(v/v)甲苯制得的柱(柱A)，線速度是12.3cm/分鐘，和80％(v/v)柱(柱B)具有3.3cm/分鐘的線速度而用73％(v/v)甲苯制得的柱(柱D)具有0.6cm/分鐘的線速度。這些線速度數據提示了大孔隨著降低孔隙產生劑濃度而減少。這一行為與在文獻中報道的一致。
實施例2按照在實施例1中所述來制備分離柱。1∶1己烷/甲苯的混合物用于該孔隙產生劑。該分離柱具有與用80/20甲苯/反應溶液制得的分離柱的分離性能類似的分離性能。獲得了對于硫脲的68,000板/m(RSD 7.0％，n＝5)的柱效率和3.7cm/分鐘的電滲流(EOF)速度。
實施例3375μl的MPTMS和100μl的0.12M鹽酸的混合物在室溫下攪拌三十分鐘。27份的這一混合物與73份的甲苯混合而得到200μl的最終溶液。添加相當于最終溶液的5wt％的光引發劑Irgacure 1800，和所獲得的溶膠-凝膠溶液在使用之前攪拌五分鐘。75μm i.d.×365μmo.d.熔凝硅石毛細管用該溶膠-凝膠溶液填充，然后該分離柱在Spectrolinker X1-1500中暴露于365nm的UV光來進行光聚合。多孔基體的聚合反應長度可通過在五分鐘的輻射之前除去毛細管的聚酰亞胺涂層的15cm細條來控制。未反應的試劑用乙醇沖洗掉。毛細管的總長度是25.6cm(從進口到檢測器窗口為18.8cm)。在使用之前所獲得的柱用該分離溶液進行調理。全部電泳實驗用Beckman P/ACE 2000來進行。該毛細管然后恒溫在20℃。注射通過使用壓力(即，0.5psi和20psi)或電壓(1kV到10kV)和在兩秒到1920秒之間改變持續時間來進行。檢測是在214或254nm下進行。數據分析是用從Galactic Industries Corporation，Salem，New Hampshire獲得的GRAMS/32版本4.02來進行。圖5A和5B是顯示了使用本發明的實例的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。這些圖說明了，在含有小分子，硫脲，三種多環芳族烴(PAHs)，和8種烷基苯基酮的混合物的CEC分離中，隨著注入的栓塞長度的增加，檢測靈敏度提高。為了消除溶劑梯度影響，樣品是在該分離溶液中制備。樣品和分離溶液是50mM乙酸銨/水/乙腈(1/4/5)。在圖5A中，栓塞長度是0.1mm，6.8mm，13.7mm，27.4mm，和34.2mm。0.1mm栓塞長度屬于0.5psi的施加的壓力，而全部其它栓塞長度屬于20psi的施加的壓力。分離的外加電壓是20kV，和該吸收率是在214nm下測量。柱的洗脫順序是(1)12.5μM硫脲，(2)51.0μM萘，(3)1.0μM菲，和(4)123μM芘。在圖5B中，該柱是按照與前面所述的柱同樣的方式制備，只是該柱通過(3，3，3-三氟丙基)三氯硅烷在室溫下的三十分鐘的連續流動和隨后用甲苯漂洗來進行后改性。栓塞長度是0.7mm，7.2mm，10.7mm，17.9mm，和28.6mm。外加電壓是15kV，和該吸收率是在254nm下測量。柱的洗脫順序是(1)5μm硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。這些烷基苯基酮中的每一種的濃度是在分離溶液中0.1μg/mL。對于在圖5A中示出的PAH混合物，以0.1mm栓塞長度的典型注射幾乎看不見峰，但是當栓塞長度從6.8mm提高到34.2mm時峰高度提高。因此，該分離柱，本發明的實施方案，允許比典型分離柱更長的栓塞長度的注射。類似地，對于在圖5中示出的烷基苯基酮混合物，當栓塞長度從0.7mm增加到57.3mm時峰高度提高。隨著栓塞長度的增加，全部四個峰都顯示更多的變寬，但是后面的洗脫峰則在較小程度上比前面的洗脫峰更對稱。這一行為與在典型的色譜分離中觀察到的不同，在典型的色譜分離中，后面的洗脫峰因為分散效應而不如前面的峰對稱。這些結果顯示，在注射過程中被分析物在多孔基體的進口處積聚，其中較多保留性的物質比較少保留性的物質更有效地定位。在圖5A中，與0.1mm的典型注射相比27.4mm注射的峰高度分別對于萘，菲，和芘是50，125和127倍。在27.4mm注射中的樣品溶液是在典型的0.1mm注射中的樣品的10倍稀釋液。
實施例4按照在實施例3中所述來制備分離柱。樣品和分離溶液是50mM乙酸銨/水/乙腈(1/3/6)。樣品在1kV下注入。外加電壓是15kV，和該吸收率是在214nm下檢測。圖6是顯示了使用本發明的實例的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。在分離溶液中39.0mM的萘被注射五秒鐘，由信號a表示，和在分離溶液中的3.9mM的萘被注射八十五秒，由信號b表示。通過控制樣品的十倍稀釋液的注射時間，兩電色譜的矯正峰面積(峰面積/遷移時間)彼此變得更靠近。在a和b兩線中電泳圖譜的矯正峰面積分別是0.0023(％RSD＝0.02％，n＝3)和0.0025(％RSD＝0.00，n＝3)任意單位/分鐘。進行對比，使得每一輪注射的萘分子的量是相同的。預濃縮是通過稀釋樣品的較長時間注射的稍高峰高度和對于兩實驗的幾乎相同的矯正峰寬(峰寬/遷移時間)來證實。在信號a和b中電色譜的峰高度分別是0.0869(％RSD＝0.36％，n＝3)和0.0937(％RSD＝0.06％，n＝3)任意單位。在a和b兩信號中電色譜的峰寬度分別是0.0253(％RSD＝0.07％，n＝3)和0.0249(％RSD＝0.01％，n＝3)任意單位/分鐘。在b線上遷移時間的變化是由較長注射時間所引起，這使得樣品栓塞的中心更靠近檢測器窗口。
實施例5575μl的MPTMS和100μl的0.12M鹽酸的混合物在室溫下攪拌三十分鐘。20份的這一混合物與80份的甲苯混合而得到200μl的最終溶液。添加相當于最終溶液的總體積的10％的光引發劑，和所獲得的溶膠-凝膠溶液在使用之前攪拌五分鐘。如以上在實施例3中所述來制備分離柱。未反應的試劑用甲苯沖洗掉。多孔基體的表面通過五氟苯基三氯硅烷在室溫下經由毛細管的四十五分鐘的連續流動和隨后用甲苯漂洗來改性。圖7(a和b)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。分離溶液是50mM磷酸/水/乙腈(1/5/4)。外加電壓是15kV，和該吸收率是在214nm下檢測。圖7(a)顯示了試驗肽的在0.1mm栓塞長度的0.5psi注射，和圖7(b)顯示了試驗肽的在12mm栓塞長度的0.5psi注射。試驗肽，它們是帶電荷的被分析物，是(1)血管舒緩激肽，(2)血管緊張素II，(3)三肽I，(4)三肽II，和(5)蛋氨酸腦啡肽。肽的濃度是16.7μg/ml。肽的陰極引導速度是由電泳和電滲流效應來支配。該肽在分離溶液的pH(pH＝2)下具有凈正電荷。與0.1mm栓塞長度的典型注射相比更長時間的注射的峰高度的改進分別對于血管舒緩激肽，血管緊張素II，三肽I，三肽II，和蛋氨酸腦啡肽是21，19，16，18和22倍。這一結果說明了這一方法對于帶電荷的被分析物的有用性。
實施例6與在實施例3中一樣制備分離柱。圖8(a，b，和c)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。圖8顯示了尿樣品的分析結果，摻加0.1mM皮質甾醇(峰1)，0.3mM黃體酮(峰2)和0.2mM可的松(峰3)。四份的摻加或未摻加的尿與六份的乙腈混合和離心處理以除去蛋白質。在注射之前一份的各上層清液與一份的50mM乙酸銨/水/乙腈(1/7/2)混合。圖8(a)顯示了0.1mm的注射栓塞長度，和圖8(b)顯示了21.4mm的注射栓塞長度。圖8(c)表示了尿空白的21.4mm注射栓塞長度。分離溶液由50mM乙酸銨/水/乙腈(1/5/4)組成。分離的外加電壓是17kV，和該吸收率是在254nm下測量。在用乙腈進行蛋白質沉淀后，這些甾族化合物被檢測和用樣品溶液的21.4mm注射來定量，但是用典型的0.1mm注射來微弱地檢測。在空白試驗和摻加的試驗之間的對比表明，仍然含有其它生物分子的樣品基體沒有顯著地干擾該分離柱的甾族化合物分析。這一結果說明了該技術在生物流體分析中的有用性。
實施例7按照在實施例3中所述來制備分離柱。圖9(a，b，c，d，和e)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。1.1cm的樣品栓塞長度被注入。該分離溶液是在60％乙腈中5mM乙酸銨，和樣品溶液是在60％乙腈(a)，50％乙腈(b)，40％乙腈(c)，30％乙腈(d)，和20％乙腈(e)中的5mM乙酸銨。分離的外加電壓是15kV，和該吸收率是在254nm下檢測。洗脫順序是(1)硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。各被分析物的濃度是2nl/ml。該保留系數，k，對于乙酰苯(峰2)，丙酰苯(峰3)，丁酰苯(峰4)，戊酰苯(峰5)，己酰苯(峰6)，庚酰苯(峰7)，辛酰苯(峰8)和癸酰苯(峰9)獲得的保留系數k分別是0.18，0.25，0.32，0.41，0.53，0.67，0.85和1.33。在這一研究中，硫脲(峰1)用作供k的測定用的基本上未保留的中性溶質。k的值和遷移時間跟隨烷基鏈長度的增加。通常，當水濃度從40％提高到50％，60％，70％和80％時改進了峰形狀和拆分，這可分別由a，b，c，d，和e來證實。
實施例8該實驗條件與在實施例7中相同。圖10是曲線的圖解表示，顯示了峰高比(從樣品基體中較高濃度的水獲得的峰高度除以從與分離溶液的樣品基體類似的樣品基體獲得的峰高度)的對數/樣品基體中水的百分比的關系。該數據顯示存在一種限度，在該限度上峰高度能夠通過提高樣品基體中緩沖劑的濃度來改進。預濃縮得到改進，歸因于被分析物對多孔基體的增加的吸引。當峰高度比的對數的值是低于1，約1，或大于1時，與使用分離溶液作為樣品基體的類似注射相比，在峰高度中分別有降低，無變化，或提高。對于全部的試驗APK，當水濃度從40％提高到50％和從50％提高到60％時，峰高度得到改進。當水的百分比從60％提高到70％或更高時峰高度沒有改進，但是，當水的百分比從60％提高到70％時兩種最低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)除外。峰高度對于在80％水基體中的較高k值被分析物(庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯)則變惡化。峰高度的降低的原因是高k值被分析物在高度含水樣品基體中的溶解度的減少。矯正的峰面積，它是對于辛酰苯和癸酰苯所負載的樣品的量的量度，是在80％水基體中比所用其它樣品基體降低了10％到60％。為了避免溶解度問題，在接下來的實驗上的試驗APK是在具有至少30％乙腈的基體中制備的。
實施例9如以上在實施例3中所述來制備分離柱。圖11(a，b，和c)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨。栓塞長度是對于在60％乙腈中的5mM乙酸銨的樣品溶液來說的0.2cm(a)；對于用于a的同樣樣品溶液來說的2.74cm(b)，和對于在30％乙腈中5mM乙酸銨的樣品溶液來說的2.74cm(c)。其它條件和峰的鑒別與在實施例7中相同。該梯度條件，如在圖11(c)中所示，顯示改良的拆分和峰形狀。在圖11中所示的在梯度條件下峰高度的改進(c)對于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯分別是36，35，38，41，42，38，32和24倍。所測量的峰高度的％RSDs(n＝5)是在0.9％到2.5％范圍。遷移時間的％RSD(n＝5)是在0.3％到0.5％范圍。該程序因此在單個柱中可再現。
實施例10圖12A，12B和12C是顯示使用本發明的實例的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。栓塞長度是對于在40％乙腈中的5mM乙酸銨的樣品溶液來說的2.74cm(圖12A)；對于在30％乙腈中5mM乙酸銨的樣品溶液來說的2.74cm(圖12B)，和對于與圖12B中相同的樣品溶液來說的5.48cm(圖12C)。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨(圖12A)和在50％乙腈中5mM乙酸銨(圖12B和12C)。其它條件和峰的鑒別與在實施例7中相同。在圖12B中的k值比在圖12A中的高，因為在分離溶液中的水的高百分率。被分析物分子在高百分比的水下更吸引到PSG相上。分配常數K(在PSG相中溶質的摩爾數除以在分離溶液中溶質的摩爾數)，它與k值成正比，隨著提高在分離溶液中水的濃度而增大。在圖12B中，對于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯的k值分別是0.29，0.47，0.65，0.92，1.28，1.76，2.37和4.25。為了保持該梯度效應恒定，在分離溶液和樣品基體之間的有機溶劑比率的百分比被保持與圖12A和12B同樣的值。因為仍然未知的原因，在圖12B中的結果顯示，對于具有較低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)，與圖12A相比在峰高度上有輕微的提高。對于其它試驗溶質，在峰高度上有一些下降。圖12C說明了對于5.48cm的較長注射栓塞和在分離溶液中較高百分比的水所遇到的情況。峰高度的改進對于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯和癸酰苯分別是31，33，55，44，44，37，29和19倍。與圖11(c)中一樣，峰高度的改進沒有跟隨k，與在非梯度條件中不同。在峰高度上的改進可以與在分離溶液和樣品基體之間的較高百分比的有機溶劑所獲得的那些相當(圖11，c)。應該指出，在圖11中(c)注射栓塞比在圖12C中短兩倍。
實施例11圖13(a和b)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。栓塞長度是0.22mm(a)和19.5cm(b)。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨。樣品溶液是在60％乙腈中(a)和在36％乙腈中(b)的5mM乙酸銨。樣品濃度是11-53μg/ml(a)和1.1-5.3μg/ml(b)。外加電壓是30kV，和該吸收率是在214nm下檢測。洗脫順序是硫脲(峰1)，萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)，和benz(e)acephenanthylene(峰5)。溶劑梯度改進了四種PAH的檢測，如在圖13中所示(b)。在分離溶液中高百分比的乙腈(60％)，更短的PSG長度(10cm)，和高的電場強度(781.3V/cm)用于更快速的分析時間。圖13(a)是在分離溶液中制備的樣品的0.22mm典型注射。圖13(b)是使用梯度的19.5cm注射，其中樣品處于36％乙腈基體中，這在樣品溶液和分離溶液之間提供高百分比的有機溶劑。長于19.5cm的栓塞會引起萘峰的變寬。有益的是應該指出，注射長度長于從進口到檢測器窗口的長度(18.8cm)。在樣品注射過程中實際上觀察到快速洗脫硫脲區段。硫脲區段因此是在分離電壓開始時的檢測窗口。對于萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)和benz(e)acephenanthylene(峰5)在峰高度上的改進分別是346，437，409和315倍。在圖13中的樣品濃度(b)比在圖13中(a)低10倍。對于萘，菲和芘，以上所述的值是比前面所報導的在非梯度條件下的值分別好了6.9，3.5和3.2倍。
實施例12圖14(a，b，c，d，和e)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。栓塞長度是0.23mm(a)，7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨。樣品溶液是在60％乙腈中(a)和在40％乙腈中(b，c，d和e)的5mM乙酸銨。樣品濃度是9-50μg/ml(a)，0.9-5μg/ml(b，c，d和e)。外加電壓是22kV，和該吸收率是在254nm下檢測。該洗脫順序是硫脲(峰1)，癸酰苯(峰2)，和芘(峰3)。癸酰苯(峰2)和芘(峰3)的峰高度隨著增加栓塞長度而提高。該注射是從0.23mm(a)提高到7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)，這對應于總毛細管長度的0.1％，30％，89％，178％，和356％。多孔基體的高孔隙度或低流動阻力使得有可能以相當容易的方式引入更大長度的樣品溶液。長于91.2cm注射仍然是可能的。然而，它沒有進行，歸因于拆分能力的損失，正如在圖14(e)中所觀察的。在d或e中的電色譜被認為是在CEC中的第一個示范，顯示樣品注射長于總毛細管長度。所注射的樣品的體積也大于1μl。在a和e中獲得的峰高度的對比提示了對于癸酰苯和芘而言在峰高度上分別改進1118倍和1104倍。這些值是通過在CEC中使用簡單的在線預濃縮技術，對于中性被分析物的最高所報道的敏感性改進。被分析物與多孔基體的強相互作用和多孔基體的固有的快速質量轉移特性使得可以觀察到此類突出的預濃縮效應。成功的分離已經用PSG在250μm i.d.毛細管中實現(數據未顯示)。這一工作產生了牽涉到長的栓塞注射的進行半制備性分離的可能性。在u1范圍中的注射體積能夠容易地做到。
實施例13圖15(a，b，c，d，e，和f)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。栓塞長度是0.1mm(a)和1.8cm(b，c，d，e和f)。注射通過使用壓力來進行，其中注射時間被固定在1.8cm。該分離溶液是與分離溶液相同(a和b)，在20％乙腈中10mM磷酸(c)，在70％乙腈中10mM磷酸(d)，在40％乙腈中的50mM磷酸(e)，在40％乙腈中的0.05mM磷酸(f)。該分離溶液是在40％乙腈中的10mM磷酸。肽濃度是16.7μg/ml每次，外加電壓是12kV，和吸收率檢測是在214nm下進行。洗脫順序是血管舒緩激肽(峰1)，血管緊張素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸腦啡肽(峰5)。雖然可以預期與非梯度條件(圖15，b)相比在梯度條件下峰形狀是更好的(圖15，c)，但是通過使用在樣品基體中更高濃度的乙腈，所獲得的峰形狀是更好的(圖15，d)。在從樣品堆積所形成的圖15(d)中觀察到更好的峰形狀。通過在樣品溶液中使用較高濃度的洗脫溶劑的變寬效果(因為較高濃度的洗脫溶劑所引起的反向梯度效應)沒有觀察到，因為一旦施加電壓之后陽離子肽立刻遷移到分離緩沖液中，因此在到達多孔基體之前肽區段(zones)早已存在于分離溶液中。樣品堆積也示于圖15(f)中，其中在具有與分離溶液相比更低濃度的緩沖組分和類似百分比的乙腈的基體中制備樣品。在從去堆積形成的圖15(c)中觀察到所不希望有的的峰形狀。去堆積(Destacking)是當被分析物經過分開低和高電場強度的區域的濃度邊界時帶電荷的被分析物的變寬。低的電場區段是含有更多水的高電導率樣品基體。去堆積也示于圖15(e)中，其中在具有與分離溶液相比更高濃度的緩沖組分和類似百分比的乙腈的基體中制備樣品。
實施例14圖16(a和b)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。注射是使用0.5psi壓力的0.1mm(a)和在5kV下的15-s(b)。樣品溶液是在40％乙腈中10mM磷酸(a)和在40％乙腈中0.5μm磷酸(b)。肽濃度是16.7μg/ml每一種(a)和167ng/ml每一種(b)。分離電壓是12kV。其它條件與在實施例13中相同。在圖16中的被分析物(b)是比圖16中的那些少濃縮了一百倍。對于血管舒緩激肽(峰1)，血管緊張素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸腦啡肽(峰5)在峰高度上的改進分別是1040，820，810，950和711倍。對于預濃縮程序，峰高度的％RSD(n＝5)是在6.2％-16.2％范圍，而遷移時間的％RSD(n＝5)是在0.7％-1.5％范圍。借助于內標物的使用應該改進峰高度的可再現性。通過將樣品溶于低導電率基體(在40％乙腈中0.5μM磷酸)中，隨后在檢測器端使用負電極的電壓進行注射，來進行電場增強的樣品注射。當施加電壓時，低導電率樣品基體借助于電滲流(EOF)進入毛細管，而陽離子肽借助于EOF和電泳流兩者進入柱中。僅僅非常小栓塞的樣品基體被引入，因為分離溶液的低pH顯著地減少EOF，這防止在毛細血管壁上硅烷醇基的解離。在30分鐘之后實際上檢測未保留的中性溶質(硫脲)。在被引入柱中的樣品基體區段中的電場大大高于分離區段。這一效應引起了進入毛細管的陽離子肽的高電泳速度。高的被分析物電泳速度引起大量的肽被引入，與在水動力學注射中不同，負載的樣品的體積限制了所引入的樣品的量。高的被分析物電泳速度也引起在樣品基體和分離溶液之間的濃度邊界上肽的聚集或預濃縮(樣品堆積)。在動電學注射之前水栓的引入(被建議用于利用動電學注射的樣品堆積中)沒有改進峰高度，因為EOF和被分析物電泳速度的相似方向。進入毛細管的低導電率樣品基體也在注射過程中在毛細管的入口端維持電場的增加。利用在圖16中的條件，在5kV下的最佳動電學注射時間是15秒。比較久的注射導致峰的變寬。在注射之后，利用與在注射中同樣的極性來施加分離電壓(在檢測器側的負電極)。被分析物運動到陰極和隨后以它們在PSG柱上的保留為基礎再次預濃縮。該方法被認為對陽離子有選擇性，因為陽離子主要被引入毛細管中。所注入的中性物質是在未保留的中性標記物和陽離子之后遷移，因為該EOF是非常緩慢的。在所使用的pH下，全部的被分析物是帶陽電荷的或中性。該技術對于其它陽離子樣品的適用性也是可能的。
實施例15表2列出了用于制備不同的前體貯備溶液的試劑的類型和體積，其中酸催化劑與前體(甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷)的比率會改變或其中前體與共前體反應(形成混合相PSG整體單段)。
表2
1甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷2雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷3雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷40.12M改變在反應溶液中前體的濃度或使用用于混合相的形成中的共前體可以改性母體PSG整體單段的化學性質。分別從溶液A和J制備的PSG整體單段，PSG-A和PSG-J，僅僅在前體的體積上不同，該前體用于與含有比A更高體積的前體的J反應。在反應中較高體積的前體會導致在毛細管柱中形成致密的整體單段。PSG整體單段，PSG-K，是用前體和作為共前體的雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷來制備。PSG整體單段，PSG-M和PSG-P，是用前體和不同量的作為共前體的雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷制備的。共前體水解和與前體縮合而形成雜化溶膠(混合相)。對于溶液A和J，將合適量的前體添加到100μl的酸催化劑(0.12M HCl)中，和所形成的溶液在室溫下(在黑暗中)攪拌15分鐘。對于K，M和P，將合適體積的前體添加到100μl的0.12M HCl中，隨后添加合適量的雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷；所形成的溶液在室溫下(在黑暗中)攪拌15分鐘。全部這些溶液在兩小時中用于它們的制備。重復類似的程序，利用所添加的光引發劑來制備甲苯/前體貯備溶液。被添加到甲苯/前體貯備溶液中的光引發劑的量是10mg光引發劑/每100μl的甲苯/前體貯備溶液。該毛細管是按照與前面所述的相同的方法來制備和調理。PSG毛細管柱調理與前面相同。測定對于烷基苯基酮(APK)和多環芳族烴(PAH)的兩種試驗混合物而言的整體單段的分離系數。該分離系數是色譜系統的被分析物分離能力的量度。分離系數，α，是由k2/k1導出，其中k是具體的被分析物的保留系數，以及k2和k1是相鄰被分析物的k值。保留系數k＝(tR-t0)/t0是按通常方式測定的，其中tR是被分析物保留時間和t0是未保留的標記物的保留時間，對于標記物我們使用硫脲。表3列出了對于萘和芘的各PSG整體單段的分離系數。
表3 α的值是從PSG-K的2.43變化到PSG-P的2.76，其中PSG-P的分離系數稍微地高于另一個整體單段的分離系數。大于1的分離系數預示著被分析物的成功分離。圖17(a，b，c，d，和e)是使用本發明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線。硫脲(T)，萘(N)，菲(PH)和芘(Py)的混合物是在PSG-A(圖17，a)，PSG-K(圖17，b)，PSG-J(圖17，c)，PSG-M(圖17，d)，和PSG-P(圖17，e)。在全部情況下不同被分析物的峰被充分拆分。拆分能力是從以下表達式確定Rs=N4(α-1)αk(k+1)]]>
其中N是效率(理論塔板數)，α是分離系數，和k是具體的被分析物的保留系數。PSG-A對于萘和芘具有2.43的最低拆分能力，而PSG-J對于相同的兩種被分析物具有4.35的拆分能力。與PSG-A相比更高體積的前體用于PSG-J的制備中可導致整體單段的提高的疏水性。在PSG-J上對于萘和芘的保留系數分別是0.31和0.79，和這些值反映了整體單段的疏水性的增加。這些值分別代表了55％和54％的提高。共前體，雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷在PSG-M中和雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷在PSG-K和PSG-P中的使用會導致對于萘和芘的拆分能力分別為4.09和9.03，與在母體PSG-A(Rs＝2.43)上的拆分能力相比有了高達73％的提高。萘(0.23)和芘(0.56)的保留系數兩者對于這三個整體單段而言都比PSG-A高60％，。
實施例16按照與以上在實施例15中對于整體單段PSG-J所述的那樣來制備分離柱。對于具有15cm長度的多孔基體，萘和芘的保留系數，分別為kN和kPy，對于用80％甲苯制得的多孔基體分別是0.31和0.79。對于具有10cm長度的類似的多孔基體，kN和kPy分別是0.10和0.24。在長度和kN(r＝0.991)和kPy(r＝0.991)之間有線性關系。15cm，10cm，和5cm多孔基體的分離系數分別地是2.55，2.52和2.40。因此，對于最短的整體單段長度，保持了高的分離系數，而被分析物的洗脫時間顯著地減少。降低在毛細管柱中多孔基體的長度會導致試驗被分析物的洗脫時間的減少。降低這一長度具有降低萘和芘的保留系數的效果。
實施例17如以上在實施例15中所述來制備分離柱。對于用80％甲苯制得的PSG-A，kN是0.14和kPy是0.36，而對于用73％甲苯制得的PSG-A，kN是0.30和kPy是0.74。對于用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-A來說的分離系數分別地是2.57(0.1％RSD)和2.47(0.1％RSD)。對于萘和芘，k的值提高了53％和51％，當73％甲苯用于整體單段的制備時。對于PSG-J觀察到類似的趨勢，其中對于用80％甲苯制得的整體單段，kN是0.31和kPy是0.79。當甲苯的濃度從80％下降到73％時，kN(0.49)和kPy(1.23)值提高了37％和36％。用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-J的分離系數分別地是2.55和2.51。當對比用80％和73％甲苯制得的PSG整體單段時，萘和芘的拆分能力差別較大。當孔隙尺寸減少時，這通過使用較低體積的甲苯來實現，隨著在相同分離溶液條件下的保留和拆分的增加，PSG表面增大。因此，多孔基體的滲透性影響被分析物的保留。
實施例18原料。用(S)-N-3，5-二硝基苯甲酰基-1-萘基甘氨酸改性的5μm球形手性顆粒是由the Graduate School of PharmaceuticalSciences，University of Tokyo(東京，日本)和Sumika ChemicalAnalysis Service(大阪，日本)提供。D-和L-氨基酸，D-和L-非蛋白質氨基酸(NPAA)，3甲基丙烯酸-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯和4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑(NBD-F)是從Sigma(St.Louis，Mo，USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)或Fluka(Ronkonkoma，NY，USA)商購并以接收到的形式使用。Irgacure 1800是Ciba(Tarrytown，NY，USA)商購。雙次蒸餾水用于全部樣品和緩沖劑的制備。HPLC-級乙腈是從Aldrich商購并且無需進一步提純就使用。熔結玻璃料制造和柱填充。該光聚合程序是按照在M.Kato，M.Dulay，B.Bennett，J.Quirino，和R.Zare，Journal ofChromatography A，924(2001)，187-195頁中所述來進行。現場自由基聚合反應通過輻射在從Polymicro Technologies(Phoenix，AZ，USA)商購的熔凝硅石毛細管(75μm i.d.×365μm o.d.)中的單體溶液來引發。單體溶液的輻射通過XL-1500 UV crosslinker(Spectronics，Westbury，NY，USA)來進行，它具有六只15W熒光黑光燈管，產生主要地365nm波長的UV光。該溶膠-凝膠溶液是由750μl的甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯，22.5μl的0.12M鹽酸和225μl的水組成，并在室溫下在黑暗中攪拌30分鐘。將170μl體積的甲苯加入到30μl的該溶膠-凝膠溶液中和在室溫下攪拌30分鐘。將8.9mg量的Irgacure 1800加入到甲苯混合物并在室溫下攪拌1小時。這一程序形成了我們稱作溶液A的產物。首先制備出口熔結玻璃料。用剃刀從距離30cm長的毛細管的末端約10cm處除去約3mm區段的聚酰亞胺涂層。該毛細管然后使用注射器填充溶液A。在毛細管暴露于UV光5分鐘之前，毛細管的兩端用蠟膜(parafilm)密封。熔結玻璃料的存在可在100倍放大下檢查來證實。該整體單段材料具有不透明外觀和是非常多孔性的。該毛細管利用來自注射器的壓力用乙醇漂洗以除去未反應的溶液。通過用注射器和手持鉗子將10mg的手性顆粒的超聲波處理(5分鐘)過的淤漿引入到毛細管柱中，在毛細管中制備15cm填充手性區段。最后，在柱中按照與出口熔結玻璃料同樣的方式制備進口熔結玻璃料。從距離毛細管的出口約25cm和距離出口熔結玻璃料15cm處除去3mm區段的聚酰亞胺涂層。溶液A使用由手持鉗子加壓的注射器被引入毛細管中。所形成的熔結玻璃料緊接著該填充區段的末端。在出口緊接著在填充區段之后通過使用熱的硫酸(＞100℃)產生檢測窗口。該柱用已經通過超聲波處理方法被脫氣的運動緩沖液預先調理(用手持鉗子將柱進口加壓至大約200psi)。接著，通過在15kV的外加電壓下以電動力學方式驅動緩沖液移動相通過毛細管，直至達到穩定的基線為止，使該柱進一步在CE儀器中調理。這一程序典型地花費2到3小時來完成。氨基酸的衍生化。10μl體積的在0.2M硼酸鹽緩沖液(pH8.0)中的各5mM氨基酸或NPAA和10μl的在乙腈中的5mM NBD-F進行混合并在60℃下加熱5分鐘。在添加20μl的運動緩沖液之后，混合物在10kV下以電動力學方式注射到毛細管中達5秒。分離。全部分離是在Beckman P/ACE 5000毛細管電泳系統(Fullerton，CA，USA)上進行。該儀器裝有空氣冷卻的488nm氬離子激光器。具有15cm手性填充區段的毛細管柱用于氨基酸的分離。衍生化的氨基酸樣品在20℃的溫度下以電動力學方式(0.33kV/cm)注射到柱中。在分離過程中的外加電壓主要地是0.83kV/cm或0.50kV/cm。未保留化合物的洗脫時間是從注射到第一個溶劑干擾峰出現為止的時間。第一個干擾峰的速度是1.28mm/s，當對柱施加0.83kV/cm的電壓時。通過檢測它們的熒光強度(激發波長是488nm，對于發射有520nm的波段通過過濾器(band pass filter))來觀察被分析物。對映異構體分離的效率是由拆分系數的值測量，后者被定義為拆分系數＝2(tA-tB)/(WA+WB)其中tA是有較多保留性的對映異構體(A)的保留時間，tB是有較少保留性的對映異構體(B)的保留時間，以及WA和WB是物質A和B的峰寬度。掃描電子顯微鏡法(SEM)分析。填充的毛細管被切成5mm段。這些段被濺射金，以便于SEM分析。在掃描電子顯微鏡(PhilipsSEM 505，Eindhoven，The Netherlands)上進行SEM分析。用于在實施例18中所述的實驗中的填充毛細管能夠被認為具有三個區段(1)出口熔結玻璃料，(2)填充的區段，和(3)進口熔結玻璃料。正如在圖18中所看出的，該出口熔結玻璃料似乎是由互聯1μm直徑球形結構的網絡組成。在出口熔結玻璃料中沒有所包埋的顆粒。在溶膠-凝膠網絡中看見有3μm通道(暗區)。這些通道允許離子和液體的通過，但防止手性顆粒的脫逸。然而，如在圖19中所示，該進口熔結玻璃料含有一些包埋的手性顆粒。這是在輻射之前顆粒進入毛細管的填充區段中時，顆粒與溶液A混合的結果。包括出口熔結玻璃料的互聯球形結構不再看出。作為替代，SEM顯微照片(圖19)顯示一些無定形結構，它覆蓋手性顆粒和結合手性顆粒而形成該進口熔結玻璃料。在顆粒的存在和不存在下在兩種熔結玻璃料之間觀察到的結構差異類似于其它人的報道。圖20是毛細管的填充段的截面的顯微照片。該溶膠-凝膠材料沒有在填充段的任何部分中形成，因為在熔結玻璃料的光聚合過程中聚酰亞胺涂層阻斷了UV光進入毛細管的該區段中。因此，該填充段僅僅由手性顆粒組成，后者由出口和進口熔結玻璃料固定就位。手性分離。通過分離熒光衍生化氨基酸，來考察填充手性柱的性能。該結果然后與在使用溶膠-凝膠材料包埋相同的手性顆粒的整體單段式柱上進行的以前報道的氨基酸分離進行對比。在先前的報導中，13種衍生化氨基酸和三種NPAA的混合物是通過使用5mM磷酸鹽緩沖液(pH2.5)和乙腈的分離溶液，在手性顆粒填充的整體單段式柱上被分離。通過在與以前同樣的條件下使用填充柱分離氨基酸和NPAA的相同的混合物。具體地說，分離溶液是5mM磷酸鹽緩沖液(pH2.5)-乙腈(30∶70)的混合物，該電場強度是0.50kV/cm，和該溫度是20℃。表4列出了NBD-氨基酸和NBD-NPAA的保留時間，拆分系數，洗脫順序，和板高度。
表4NBD-氨基酸對映異構體分離的洗脫時間，拆分系數，和板高度
N.I.不鑒別。大部分的NBD-氨基酸和NBD-NPAA在10分鐘內洗脫，而NBD-谷氨酸(Glu)對映異構體在40分鐘內洗脫。在填充柱中，與在顆粒填充的整體單段式柱中相同的分離相比，氨基酸的保留時間被縮短。在我們的實驗條件下，電滲流是非常小的或可以忽略的以及電泳速度是被分析物遷移通過該柱的主要的驅動力。填充柱和整體單段式柱的分離溶液和外加電壓是相同的，因此這些被分析物的電泳速度在填充柱和整體單段式柱之間是類似的。在兩種柱之間的不同保留時間是因為在移動相和靜止相之間不同分配所引起。在填充柱和整體單段式柱之間的結構差異導致了在被分析物的分配上所觀察到的差異。通過使用由光聚合溶膠-凝膠熔結玻璃料制造手性柱，全部的NBD-氨基酸和NBD-NPAA被很好地拆分。拆分系數是在1.21和8.29之間。這些值比在顆粒填裝的整體單段式柱中的值大了約1.5倍。在填充柱上NBD-氨基酸的洗脫順序與在整體單段式柱上的那些一樣，其中NBD-D-氨基酸洗脫得比NBD-L-氨基酸更快，但NBD-Pro除外。NBD-NPAA的洗脫順序沒有證實，因為樣品是由外消旋混合物組成而不是由旋光活性混合物組成。NBD-氨基酸和NBD-NPAA的板高度是在填充柱上低于20μm，但NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸除外。在整體單段式柱中，NBD-氨基酸和NBD-NPAA的板高度是在14和65μm之間。這些板高度是比在填充柱中的那些高約兩倍。這些NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸顯示比在填充柱和整體單段式柱兩者中其它NBD-氨基酸和NBD-NPAA更差的分離效果。在色譜分離中，導致質量轉移速度下降的附加的相互作用會提高被分析物的板高度。Glu具有兩個羧基，該羧基與氨基丙基硅膠的改性氨基形成離子相互作用。2，3-二氨基丙酸的兩個氨基是用NBD結構衍生化，使得它不同于其它氨基酸和NPAA。這兩個NBD結構可以與填充顆粒形成一些附加的π-π相互作用。因此NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸顯示出比在填充柱和整體單段式柱兩者中的分離效果更差的分離效果。全部NBD衍生物，其中包括NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸，的板高度是填充柱的比整體單段式柱的更小。圖21A顯示了NBD-DL-丙氨酸(Ala)和NBD-DL-蘇氨酸(Thry)的樣品在填充柱上的電色譜，而圖21B是同樣的樣品在整體單段式柱上的電色譜。在填充柱上實現了類似的洗脫時間，與使用0.5kV/cm的外加電場的整體單段式柱相比。在圖21B中在約6分鐘觀察到的峰是從氟產生劑的水解所產生。在氨基酸之間的分離已經在填充柱上大大地改進。在圖21中可以看出，用填充柱實現了樣品組分的基線分離，與整體單段式柱相比。在填充柱中各NBD-氨基酸的峰形狀是比在整體單段式柱中的峰更尖銳。這些合結果表明填充柱的分離效率優于整體單段式柱的分離效率。與整體單段式柱相比，在填充柱中氨基酸樣品的分離效率和拆分系數的改進歸因于該氨基酸與手性顆粒的更佳相互作用。在顆粒填充的整體單段式柱中，由于顆粒被包封在溶膠-凝膠基體中，這些顆粒已經部分地被屏蔽。在溶膠-凝膠基體不存在的情況下，質量轉移得到改進。在整體單段式柱上較低分離效率的另一個理由是在溶膠-凝膠結構中的一些不均勻性，如小的縫隙或裂紋。在用于包埋手性顆粒的溶膠-凝膠的熱聚合過程中，當乙醇從反應混合物中蒸發時產生該縫隙或裂紋。光聚合允許避免使用熱量，因此避免了在整體單段式結構中這些縫隙或裂紋的形成。使用光聚合溶膠-凝膠形成熔結玻璃料的附加優點是在制備中的容易和速度以及在控制熔結玻璃料的長度和位置上的容易性，與其它光聚合的或硅酸鹽熔結玻璃料的制備相比。熔結玻璃料是在我們的填充柱中通過暴露于UV光在5分鐘中制得。甲基丙烯酸酯型試劑在熔結玻璃料中的使用需要1-16小時的聚合時間。對于硅酸鹽熔結玻璃料，制造僅僅需要幾秒，但是需要毛細血管壁的預處理。因此，使用硅酸鹽熔結玻璃料的填充毛細管的制備需要一個小時來制造該填充柱。此外，更難于控制通過加熱制備的熔結玻璃料的位置和置放。由于溶膠-凝膠熔結玻璃料的高的孔隙度，在極低壓力(約200psi，來自手持鉗子上的注射器)需要僅僅30分鐘在毛細管中填充15cm區段的手性顆粒。背壓對于光聚合溶膠-凝膠熔結玻璃料是極低的，與硅酸鹽或光聚合的甲基丙烯酸酯熔結玻璃料相比。短填充多段式柱的性能。在該填充柱中，NBD-氨基酸對映異構體的板高度是比整體單段式柱小兩倍。因此，NBD-氨基酸預計以短的脫離時間通過短填充柱來分離。NBD-氨基酸對映異構體(NBD-Phe，-Val，-Gln，-Thr)的分離是在5cm填充段柱上的分離。短的填充柱在僅僅5分鐘內分離NBD-Phe對映異構體(圖22)。NBD-Phe對映異構體的分離系數和NBD-D-Phe的板高度分別是2.22和8μm。板高度在短填充柱上改進，然而該分離系數卻下降，由于短填充段。
實施例19PSG整體單段的制備。在毛細管柱中母體PSG結構的制備以前已有描述。用于以結合相來使母體PSG的表面衍生化的程序也已經描述。然而，衍生反應的長度通常是在較大i.d.毛細管中長度的兩倍，與較小i.d.毛細管相比。分離。硫脲，乙酰苯，丙酰苯和丁酰苯的混合物(全部以毫摩爾的量)已經以電動力學方式注入到PSG填充的毛細管中。最低注射時間是15秒。該外加電壓是8kV到15kV。紫外吸收檢測器用于檢測該被分析物峰。高壓電源用于為毛細管提供電壓。全部其它實驗細節類似于早已針對分析用途(小i.d.)PSG填充的毛細管有出版公開的那些。每一種被分析物的貯備溶液是作為1mg烷基苯基酮在1mL乙腈中的溶液來制備。硫脲在水中的50mM貯備溶液用于樣品溶液的制備。結果。被分析物的分離是按照相同的反相機理，其中更多疏水性的被分析物比較少疏水性的被分析物更遲洗脫。當注射時間(即栓塞長度)增加時，觀察被分析物的預濃縮。在圖23中，硫脲和烷基苯基酮的混合物是在填充了用C8結合相(PSG-C8)衍生化的10cm PSG整體單段的250μm i.d.毛細管上進行預濃縮和分離。長的注射栓塞長度允許將多達0.74ng的丙酰苯裝載到該柱上。荷載越高，峰變得更加尖銳。可以相信，在峰形狀和高度上有折中之前能夠將更多的被分析物裝載到柱上，而且不再能實現預濃縮。裝載到柱上的丙酰苯的量能夠通過使用填充了相同的PSG整體單段的350μm i.d.毛細管而增加到7.43ng，如在圖24中所示。在拆分系數上有一點損失，但峰已經變寬。圖25顯示硫脲和丙酰苯在填充了相同的PSG整體單段的540μm i.d.毛細管中的分離。0.86ng的丙酰苯以3.73mm的短的注射長度被裝載到柱上。已經開發了使用光聚合溶膠-凝膠熔結玻璃料和整體單段來制備填充柱的一種容易和快速的方法。在色譜分析實驗的任何一個中沒有觀察到氣泡形成。盡管上面已經參考各種實施方案描述了本發明，但應該理解的是在不脫離本發明的范圍的前提下可以作一些變化和改進。本發明包括在所附權利要求的字面上的和合理的范圍內的全部變化和改進。以上引用的全部參考文獻以它們的全部內容被引入這里供參考。
權利要求
1.分離柱，包括分離通道；和在通道內的多孔基體，多孔基體包括金屬有機光聚合物，其中多孔基體是均勻的和不包含色譜分析的顆粒。
2.權利要求1的柱，其中該多孔基體包括分離介質。
3.權利要求2的柱，其中分離通道具有通道壁，和介質附著于通道壁上和并填充該通道的至少一個區段。
4.權利要求1的柱，其中光聚合物的前體包括金屬醇鹽。
5.權利要求4的柱，其中金屬醇鹽包括金屬，和該金屬選自鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅和鋯。
6.權利要求4的柱，其中金屬醇鹽包括至少一種光活性基團。
7.權利要求2的柱，其中多孔基體對被分析物有親和性。
8.權利要求1的柱，其中該分離通道是毛細管分離通道或平面結構。
9.權利要求1的柱，其中該多孔基體包括被設計來將分離介質保留在通道中的至少一種熔結玻璃料。
10.權利要求9的柱，其中至少一種熔結玻璃料具有受控制的孔隙率。
11.權利要求9的柱，其中熔結玻璃料結合于通道壁的內表面上。
12.權利要求9的柱，其中分離通道在進口和出口之間延伸和具有通道壁，和其中該熔結玻璃料靠近進口，出口，或兩者。
13.權利要求9的柱，其中分離通道是具有在約5和1000μm之間的范圍內的內部尺寸的熔凝硅石毛細管，和熔結玻璃料具有足以在將分離介質填充在通道中的過程中承受高壓的結構。
14.權利要求9的柱，其中熔結玻璃料是從甲基丙烯酸酯取代的硅酸鹽形成的。
15.權利要求14的柱，其中熔結玻璃料是從可光致固化的甲基丙烯酸酯取代的硅酸鹽形成的。
16.權利要求9的柱，該柱具有填充了分離介質的第一部分和靠近該第一部分的傳輸輻射的第二部分。
17.權利要求16的柱，其中第二部分不含有該分離介質。
18.分離柱，包括分離通道；和在通道內的多孔基體，多孔基體包括金屬有機聚合物，其中多孔基體是均勻的和不包含色譜分析的顆粒。
19.分離柱，包括分離通道；和在通道內的多孔基體，該多孔基體包括金屬有機光聚合物。
20.制備分離柱的方法，包括提供分離柱；將混合物引入到該柱中，混合物包括金屬有機化合物；和輻射混合物，利用光引發聚合反應引起混合物形成固體多孔基體。
21.權利要求20的方法，其中多孔基體不包含色譜分析的顆粒。
22.權利要求20的方法，其中混合物包括至少一種金屬有機單體，至少一種孔隙產生劑，和光引發劑。
23.權利要求22的方法，其中可控地選擇孔隙產生劑以在基體中形成孔隙。
24.權利要求23的方法，進一步包括選擇單體與孔隙產生劑的摩爾比率以便在基體中形成孔隙。
25.權利要求20的方法，其中輻射包括用可見光或紫外光輻射混合物。
26.權利要求20的方法，進一步包括將有機溶劑引入到柱中，該柱包括固體多孔基體。
27.權利要求20的方法，其中該提供包括提供毛細管或平面結構。
28.分離被分析物的樣品的方法，包括提供包括分離通道和在通道中的分離介質的分離柱，該介質包括多孔基體，該多孔基體包括金屬有機光聚合物；將在溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，其中該介質將被分析物濃縮在柱上；和引起溶液流過該柱，因此分離并洗脫該被分析物。
29.權利要求28的方法，其中該引入包括對柱施加電壓或壓力。
30.權利要求28的方法，其中該引入包括將在第一種溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，和該引起包括引起第二種溶液流過該柱，其中第一種溶液是與第二種溶液相同的溶液。
31.權利要求28的方法，其中該引入包括將在第一種溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，其中第一種溶液包括洗脫溶劑，和該引起包括引起第二種溶液流過該柱，其中第二種溶液包括洗脫溶劑，和在第一種溶液中的洗脫溶劑的濃度低于在第二種溶液中的洗脫溶劑的濃度。
32.權利要求31的方法，其中該引入包括引入具有大于柱長度的注射栓塞長度的被分析物樣品。
33.權利要求28的方法，其中該引入包括引起樣品堆積。
34.權利要求28的方法，其中該提供包括提供分離介質，后者包括沒有色譜分析的顆粒的多孔基體。
35.權利要求28的方法，其中該提供包括提供包括毛細管或平面結構的分離柱。
36.分離柱，包括分離通道；和在通道內的非熔結玻璃料分離介質，該介質包括多孔基體，該多孔基體包括金屬有機光聚合物。
37.權利要求36的柱，其中分離通道具有通道壁，和介質附著于通道壁上和并填充該通道的至少一個區段。
38.權利要求36的柱，其中多孔基體是均勻的和不包含色譜分析的顆粒。
39.權利要求36的柱，其中光聚合物的前體包括金屬醇鹽。
40.權利要求39的柱，其中金屬醇鹽包括金屬，和該金屬選自鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅和鋯。
41.權利要求39的柱，其中金屬醇鹽包括至少一種光活性基團。
42.權利要求36的柱，其中多孔基體對被分析物有親和性。
43.權利要求36的柱，其中該分離介質包括均勻相。
44.權利要求36的柱，其中該分離通道是毛細管分離通道或平面結構。
45.分離柱，包括分離通道；和在通道內的非熔結玻璃料分離介質，該介質包括多孔基體，該多孔基體包括金屬有機聚合物。
46.在分離柱中制備整體單段的方法，包括提供分離柱；將混合物引入到該柱中，混合物包括金屬有機化合物；和輻射該混合物，利用光引發的聚合反應引起混合物形成固體多孔基體，因此在柱中形成非熔結玻璃料分離介質。
47.權利要求46的方法，其中多孔基體不包含色譜分析的顆粒。
48.權利要求46的方法，其中混合物包括至少一種金屬有機單體，至少一種孔隙產生劑，和光引發劑。
49.權利要求48的方法，其中可控地選擇孔隙產生劑以在基體中形成孔隙。
50.權利要求48的方法，進一步包括選擇單體與孔隙產生劑的摩爾比率以便在基體中形成孔隙。
51.權利要求46的方法，其中輻射包括用可見光或紫外光輻射混合物。
52.權利要求46的方法，進一步包括將有機溶劑引入到柱中，該柱包括固體多孔基體。
53.權利要求46的方法，其中該提供包括提供毛細管或平面結構。
54.分離被分析物的樣品的方法，包括提供包括分離通道和在通道中的非熔結玻璃料分離介質的分離柱，該介質包括多孔基體，該多孔基體包括金屬有機光聚合物；將在溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，其中該介質將被分析物濃縮在柱上；和引起該溶液流過該柱，因此分離并洗脫該被分析物。
55.權利要求54的方法，其中該引入包括對柱施加電壓或壓力。
56.權利要求54的方法，其中該引入包括將在第一種溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，和該引起包括引起第二種溶液流過該柱，其中第一種溶液是與第二種溶液相同的溶液。
57.權利要求54的方法，其中該引入包括將在第一種溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，其中第一種溶液包括洗脫溶劑，和該引起包括引起第二種溶液流過該柱，其中第二種溶液包括洗脫溶劑，和在第一種溶液中洗脫溶劑的濃度低于在第二種溶液中洗脫溶劑的濃度。
58.權利要求54的方法，其中該引入包括引入具有大于柱長度的注射栓塞長度的被分析物樣品。
59.權利要求54的方法，其中該引入包括引起樣品堆積。
60.權利要求54的方法，其中該提供包括提供分離介質，后者包括沒有色譜分析的顆粒的多孔基體。
61.權利要求54的方法，其中該提供包括提供包括毛細管或平面結構的分離柱。
全文摘要
提供了分離柱和制備該分離柱的方法。分離柱包括分離通道和在通道中的多孔基體。多孔基體包括金屬有機聚合物，如光聚合物。多孔基體可以是被設計來分離被分析物樣品的分離介質或被設計來將分離介質保留在通道中的熔結玻璃料。
文檔編號G01N30/28GK1630546SQ02818591
公開日2005年6月22日 申請日期2002年8月13日 優先權日2001年8月13日
發明者R·N·扎勒, M·T·杜雷, J·P·奎利諾, B·D·貝內特 申請人:萊蘭德斯坦福初級大學理事會