制備探針分子的平面檢測陣列的多個相同副本的方法

專利名稱：制備探針分子的平面檢測陣列的多個相同副本的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于制備探針分子的平面檢測陣列的多個相同副本的方法，其是基于被切成所期望長度的纖維束，而所述探針分子是用于檢測目標分子。
背景技術：
以組織有序的方式沉積/結合/固定在平面表面上的大量不同探針或探針分子或測試化合物的集合在科技術語中被稱為陣列。此等陣列通過分析探針/探針分子/測試化合物與例如生物樣品中的分析物或者分析物的混合物(即、目標生物分子)之間的相互反應而能夠同時快速檢測/分析所有的探針/探針分子/檢測化合物。相比于在流動單元如珠(beads)上使用固定化探針、探針分子或測試化合物的同時檢測/分析法，陣列的優點在于，在陣列中，所固定的探針、探針分子或者測試分子的類型(化學結構和/或個體性質)通過在陣列表面上的位置而可精確知曉，并且局部檢測信號(這通過與目標分子的相互作用例如結合而產生，或者例如由于目標分子對探針的酶解轉化作用而消失，而且由此可間接用于檢測)因此可立即鑒定分子的類型。特別是在微小化的形式時，包含有生物探針、探針分子或測試分子的陣列也被稱為生物芯片。
所述陣列的重要例子有DNA片段、cDNA、RNA、PCR產物、質粒、噬菌體、合成的寡核苷酸或者通過與互補核酸分析物的雜交(形成雙鏈分子)來讀取的合成PNA寡聚物的核酸陣列；
抗體、在細胞中表達的蛋白質、噬菌體融合蛋白的蛋白質陣列；以及合成肽、其類似物如類肽(peptoid)、寡聚氨酯等、或者通常例如通過與親和性蛋白分析物或者其他分析物的結合或者例如通過酶解轉化作用來讀取的有機化合物的化合物陣列。
這些陣列以及用于研制這些陣列的方法和裝置都用于基礎生物學研究中，特別是用于醫療診斷以及藥物的研制中。自然科學中其他領域的研究，例如催化劑的研制以及材料科學，也開始成功地采用此等概念。有利地常規使用這些陣列的一個前提條件是廉價、快速以及完全自動化，以及測試結構(信息含量)的高密度和多樣性。
此等陣列通常是根據兩種不同的原理通過將探針、探針分子或測試分子沉積在已預先制備好的材料表面上而制備的(在以下文獻中提供了最新的綜述S.Woelfl，transcript Laborwelt 2000，3，12-20)。
(a)將預制探針、探針分子或測試化合物的溶液單個地分布在所述表面上；(b)在所述表面上重復、系列化地分布用于原位化學合成探針、探針分子或測試化合物的構建塊溶液。
預先已知的芯片構型可利用陣列單元的長方形x/y設置，該設置是通過相應的x/y移液工位或者通過相應制造的光能無機描示(photolitho-graphic)或打印掩膜進行計量加入而制得的；或者是圓形的rφ設置，該設置是通過旋轉移動芯片表面(rφ陣列)以及一個用于定時快速操作的計量裝置而制得的。因此，有可能得到每立方厘米高至1百萬個探針、探針分子或測試化合物的密度或者每單個面積為幾個平方微米的密度。
但是在用于常規醫療診斷中時，對于非常大量(幾百萬)的測試非常嚴格地要求分析結果具有重復性。這要求每一個生產批次、以及不同生產批次的芯片(陣列)具有幾乎相同的性質。然而，所有的上述生產方法都具有一個最大的缺陷，即、如此制得的每個陣列僅能夠在非常有限的程度上可以與第二個“相同”制備的陣列相比，這是因為每個陣列單元都是在單個過程中制得的。
還有一個事實是，探針、探針分子或化合物的相同溶液分布在一系列不同陣列的相同位置上。由于計量的不精確性、表面特征的不均勻性以及固定或合成步驟中的官能團及不同反應產率，都會發生誤差或者偏差。
陣列單元的空間尺寸越小，此等誤差的變化就越大，而且如果制備每個單獨陣列單元需要多個步驟，則呈指數變大。
由于陣列單元中各種探針、探針分子或測試化合物的化學結構和性質不同，參比裝置也僅是相對性地能夠校正上述偏差。每個單獨陣列的質量測試不是一個好的選擇，因為這將太過昂貴，而且許多測試不能可逆地進行，也就是說陣列將由于質量控制而被不可逆地改變。
Fislage和Teterin已經在DE 198 03 077 C1中描述了一種“制備用于特異性檢測受體物質-配體物質復合物的單個反應物的結構測試體的方法”，其中結合有反應物的材料層堆積并粘結在一起以形成一個三維體，而且該三維體隨后用切片機以與所述層的平面呈一定角度地切成薄的層。如此制得的層由相互靠緊的薄條組成，每個條包含不同的反應物質，使得在生物測試中可在一個測試體中平行且同時地檢測幾種不同的反應物。因此，他們提出了一種切削細薄片的方法，該薄片是從由攜帶不同物質的片段組成的物體中切得的。但是，由該方法制得的條狀測試體僅使用一維來設置用于平行測試的多種反應物。這些在DE 198 03 077中描述的反應物也可被理解為探針分子。
Anderson、Anderson和Braatz(WO 01/09607 A1)已通過以下方法克服了上述缺陷首先在線段上負載各種反應物，然后平行地并排放置成長方形柵網形，然后由所述線段切割三維體。該制備方法肯定可以用于較厚的纖維，如那些在實施例中描述的纖維。但是，如果纖維的厚度處于微米范圍內，并且將數十萬根纖維平行設置，那么必須設計出高精確度的機器。

發明內容
因此，本發明的目的是克服與以上現有技術相關的缺陷或問題。
本發明由此涉及一種用于制備探針分子的平面測試陣列的多個相同副本的方法，所述探針分子是用于檢測目標分子，其中，(a)使用大量纖維作為起始點，其中每個纖維僅具有一個類型的用于檢測一個類型的目標分子的探針分子，而且纖維的數量至少相應于不同類型的待檢測的目標分子的數量，(b)將所述大量的纖維按照平行方向設置，(c)將如上設置的纖維成束以形成纖維束，并成為最緊密的堆積(從垂直于纖維截面的角度觀察)，(d)單個纖維相互之間在纖維束中的設置是不可變更地固定，使得每個纖維占據一個幾何限定位置，并得到固化的纖維束，以及(e)以所希望的間隔按照垂直于纖維長度的方向切割所述經固化的纖維束，產生平面檢測陣列的多個相同副本，該陣列具有用于檢測目標分子的探針分子，該探針分子在切割表面上處于幾何限定的位置中。
根據本發明，WO 01/09607的現有技術在以下方法得到改進將纖維相互靠緊放置的過程現在變為一個簡單并且自我組織的過程。纖維首先被大約相互平行且有間隔地設置，并由此能夠以所希望的順序放置或者僅在它們設置期間一層一層地負載探針分子。該設置過程不需要高的精確度，而僅是必須確保正確的設置。
從屬權利要求涉及本發明的其他有利和/或優選實施方案。
根據一個實施方案，本發明涉及一種將大量的探針分子固定在大量纖維的相應表面上或者在這些表面上合成所述大量探針分子的方法。
根據另一個實施方案，本發明涉及一種通過擠出大量基礎纖維材料制備大量纖維的方法，每種基礎纖維材料在其上固定有大量探針分子。
根據本發明的一個實施方案，所述纖維例如由多孔合成材料、特別是聚酯、聚氨酯或者尼龍、纖維素、乙酸纖維素、棉花或者絲綢組成。但是，纖維不一定必須為多孔性的。還可使用例如由玻璃、金屬、金屬氧化物或者半金屬氧化物組成的纖維。但是在檢測過程中，僅在纖維上的“涂層”區域中形成信號，也就是說一種環繞纖維的環狀信號，但該信號不一定有在纖維的整個截面上延伸的信號那么強。
如果其上固定有探針分子的基礎纖維材料被用于擠出，則本領域技術人員可按照與官能化基礎纖維材料的溫和擠出有關的現有技術來實施，例如參見Science，295(2002)472，以及Schnegelsberg，Handbuch derFaser，Theorie und Systematik der Faser(纖維手冊，纖維的理論和系統)，1999，ISBN 3 871 506 249。
根據本發明的又一個實施方案，形成纖維束的纖維組合是例如通過在相同方向上扭轉或者相互纏繞來實現的。
纖維束的扭轉自動地使纖維盡可能地相互靠緊。這產生了與最緊密壓緊原理略有不同的纖維設置，但是纖維之間的相互空間位置并沒有由此而改變。另一個優點是測試陣列更為致密。
根據本發明再一個實施方案，纖維相互之間不可改變的固定設置以及纖維束的固化例如是通過以下方法實現的在可固化材料中嵌入或者聚合，隨后進行硬化或完全聚合或冷凍。
根據本發明的另一個實施方案，可固化的材料例如是石蠟、明膠、聚丙烯酰胺、環氧樹脂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇水溶液或者聚乙烯醇/PEG水溶液。原則上，任何適用于組織切片或者冷凍切片的材料都是合適的。本領域技術人員對于可固化材料與纖維的硬度之間的匹配性是熟知的。
根據本發明的再一個實施方案，已固化的纖維束例如用切片機(例如超聲切片機)或者冷凍切片機進行切割；該切割是垂直于纖維束的軸或者與纖維束的軸呈一定角度地實施。
本發明還涉及用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列，該測試陣列是通過在一個并且相同的平面上最致密地二維設置或者最緊密壓緊具有表面積、特別是相同表面積的平面單元而形成的，其中每個單元僅具有一個類型的用于檢測一個類型目標分子的探針分子，而且纖維的數量至少相應于待檢測的目標分子的不同類型數目。
本發明進一步涉及通過本發明的方法制得的用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列。
在根據本發明的平面測試陣列中，目標分子可以是目標生物分子。
在根據本發明的平面測試陣列中，具有相同表面積的單元可具有盤狀，特別是圓盤形狀、橢圓盤狀或者六邊形盤狀，而且可以最緊密壓緊、特別是六邊形最緊密壓緊(由垂直于所述盤平面的角度觀察)的方式存在于一個并且相同的平面中。
本發明還涉及包括一個或者多個、相同或者不同的根據本發明用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列的醫療或診斷裝置。
本發明進一步涉及包括多個相同或者不同的根據本發明用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列的試劑盒。
本發明還涉及包括一個或者多個、相同或者不同的根據本發明用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列以及一種或者多種用于檢測與探針分子結合的目標分子的試劑的試劑盒。
本發明還提供根據本發明的平面測試陣列、根據本發明的醫療或者診斷裝置或者根據本發明的試劑盒在檢測目標分子中的應用。
根據本發明所用的探針分子可以例如分別是互補結合配偶體之特異性相互反應體系中的一個配偶體。
由于互補結合配偶體的結合，例如直接作為結合本身的結果或者間接地因為其他標記分子特異性地與探針/目標生物分子結合物結合(夾心分析法)，能夠產生可檢測的信號。結合之前存在的信號也可例如因為連接在探針上的標記物被除去或者以其他方式失活(例如當目標分子是酶時)而消失。
互補結合配偶體的特異性相互作用體系可例如依賴于核酸/互補核酸、肽核酸/核酸、酶/底物、受體/效應器、凝集素/糖、抗體/抗原、抗生物素/生物素、鏈霉抗生物素蛋白/生物素的相互作用。
上述抗體可以例如是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或者單鏈抗體或者此等抗體的功能片段或衍生物。
以下將借助于示意性的實施方案以及參考附圖對本發明進行更為詳細的說明，但這絕不是對本發明范圍的限制。


圖1A是根據本發明的方法的一個實施方案的每個步驟的示意圖，而且也是根據本發明方法得到的產品的一個實施方案的示意圖。
圖1B是根據本發明的方法的一個實施方案的每個步驟的另一個示意圖。
圖2和2A至2C是本發明的一個實施方案的每個步驟的其他示意圖。
圖3顯示了根據本發明致密的纖維束以及通過該纖維束得到的測試陣列。
圖4是根據本發明致密的纖維束或者根據本發明的測試陣列的前示圖。
具體實施例方式
如圖1所示，在其上固定有大量探針分子的基礎纖維材料可用作起始點，而且該材料可通過噴嘴束或者噴嘴組紡成大約相互平行的纖維，這些纖維固定在與噴嘴相對設置的板或者多孔板上。為簡單起見，僅顯示了一個噴嘴。另外，已紡的線可由多孔板中穿過。
圖1A中示出的板是長方形或者正方形的，并且設有按照正方形格柵構型設置的孔，圖1B中示出的板大約呈圓形，孔的設置大致為六邊形。
圖2是用于平行設置纖維的裝置的平面圖，而圖2A至2C是其截面圖。該裝置設有導銷2，其用于以曲折的方式定位連續的線(在1處開始并在8處結束)。如圖1B所示，所述裝置中大致呈長方形的基底設有通道樣的溝7、通道或者槽，它們用于接納所述線的單獨平行部分。在這些溝7中，纖維可進行浸漬或者官能化。塑料條5用于支持和/或覆蓋平行部分的末端部分，并且可焊接和/或粘結在所述末端部分上。多對塑料條5與按照曲折方式焊接或粘結于其上的線可借助于釘子相互堆疊在一起，所述釘子是通過設在塑料條5中的導孔6而被導入的。
圖3顯示了經過扭轉的纖維束，由該纖維束通過使用切片機刀刃可切割根據本發明的測試陣列。這些測試陣列設有4個標記，使得它們能夠按照類似的方式取向。
圖4顯示了相互組合在一起并具有不同截面的纖維的測試陣列。
根據本發明，在制備用于常規醫療診斷的陣列時，特別推薦以下方法，其中由相同的材料制造大量相同陣列的每個陣列單元首先，例如將探針或者探針分子固定在“一維”線、絲或棒單元(“1D單元”)上。這可例如通過將合適的探針分子直接或者通過合適的連接物結合在“1D單元”表面上的活性基團上。例如，探針分子的溶液可向下流過垂直固定的線，或者所述線由探針分子的溶液浴中拖過或者放置在該溶液浴中。對于具體的方法沒有限制。優選的是，所述線例如用探針分子的溶液飽和/浸漬。如果是多孔纖維，例如纖維素或者棉線，該飽和/浸漬過程由于燈芯作用(吸附)可自動進行，而且使探針分子的溶液均勻地分布在所述纖維中。
“一維”線、絲或棒單元(“1D單元”)可沿長度方向平行放置，然后按照與制造繩子相同的方式通過最佳緊密壓緊(例如纏繞)牢固地相互組合在一起，以形成“三維”陣列體(“3D體”)。這可最簡單地例如通過沿相同的方向扭轉纖維或者其他類型的纏繞方法來實現。3D體接著用固化材料浸漬，該固化材料本身沒有任何限制。接著，在3D體的一端，垂直于所組合的“一維”陣列單元的軸或者與該軸成一定角度地進行切割。切割表面相應于常規陣列中陣列單元的二維設置(2D陣列)。可一個接一個地切割下大量的薄切片，而且每個切片由相同的2D陣列組成。這些陣列可放置在穩定的支持體上，并且可按照與其他常規陣列相同的方式進行進一步的處理。
該新的制造方法具有以下有利的特征(a)“1D單元”可由預制的材料(棒、絲、或線)組成，每個單元在一個預先完成的步驟中負載一個探針、探針分子或化合物。所述負載是一個如下的過程探針、探針分子或化合物固定在表面上，或者根據固相合成原理在所述表面上原位進行化學合成。簡單的例子是纖維素、乙酸纖維素或棉線，而化合物被化學性地連接在這些物質的羥基官能團上。在絲線或者合成材料的線上，特別是聚酯、聚氨酯或尼龍基的線，可使用類似的方法。在以下書籍中可發現許多用于將分子固定在表面上的例子，而所述分子適用于探針/目標生物分子的組合或者通常用于生物結合系統G.T.Hermanson的“生物結合技術(Bioconjugate Techniques)”，Academic Press，1996。在以下書籍中則可發現許多用于固相合成的系統的例子F.Z.Doerwald的“固相有機合成(Organic Synthesis on SolidPhase)”，Wiley-VCH，2000。
或者，“1D單元”也可直接例如由合適的基礎材料的溶液制備，在此情況下，探針、探針分子或者測試化合物已共價鍵地、離子性地或者機械地結合在所述基礎材料的分子上；例如參考WO 99/54729。該制備過程可象制備合成纖維或者粘性乙酸纖維素或絲綢纖維那樣，例如通過擠出法實施。在此情況下，通過擠出噴嘴的相應孔，還可得到長方形、六邊形或者其他形狀的纖維/絲。
該方法確保每個陣列單元(其在后來以非常小的部分得到)由在預先的制備方法中制造的相同材料組成。
(b)在本發明的一個實施方案中，“1D單元”的設置及組合可類似于制造繩子的過程。纖維的末端按照所希望的陣列順序設置，同時相互隔開，然后略微扭轉這些線。扭轉后形成牢固組合在一起并且致密的束。該致密作用是自我組織的，而且是可重現的。在精確測定2D陣列部分的最終取向時，可插入例如具有顯色、熒光或者其他合適標記的參比纖維。對于多個系列的所有陣列僅需要一個分類操作。
(c)切割操作相應于常規的切片法，用該方法可制造出極薄的嵌入在合適介質中的生物材料切片。超薄切片機可產生小至僅0.1微米厚的切片。因此，由1米長的3D體中可以沒有任何困難地制備出一千萬個厚度為0.1μm的陣列切片。
為此目的，3D體用適用于切片的材料(石蠟、明膠、聚丙烯酰胺、環氧樹脂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇水溶液或者聚乙烯醇/PEG的水溶液)浸漬，然后象生物材料那樣在其中嵌入或者聚合或者冷凍纖維。在此方面，適合于本發明的切片機和超薄切片機的制造商有許多標示。
(d)切片機切下的切片可放置在穩定的支持體如玻璃上，結合，然后如果需要，象常規陣列使用時作進一步的處理。陣列支持體的尺寸可與常規陣列的尺寸相匹配(例如，顯微鏡載玻片的尺寸為2.5×7.5cm)，使得仍可以使用用于測試和讀取陣列的市售裝置。
在一個支持體上可放置一個切片，也可在同一個支持體上放置多個切片(“陣列的陣列”)。在后一種情況下，可設置多個相同的陣列，或者也可設置多個不同的陣列。在此等“陣列的陣列”上的切片之間，可放置或者制造小的網，以得到分開的室，而且每個單獨的切片可同時用不同的生物樣品進行檢測。
整個方法都可容易地完全自動化。
標號說明A用于引導纖維的右端片B用于浸漬通道的中心片C用于引導纖維的左端片1線(開始)2導銷3用于填充浸漬通道7的移液管4用于切割纖維平面的線5用于焊接纖維末端的塑料條6用于堆疊纖維平面的導孔7用于浸漬溶液的通道8線(末端)
權利要求
1.一種用于制備探針分子的平面測試陣列的多個相同副本的方法，所述探針分子是用于檢測目標分子，其中，(a)使用大量纖維作為起始點，其中每個纖維僅具有一個類型的用于檢測一個類型目標分子的探針分子，而且纖維的數量至少相應于不同類型的待檢測的目標分子的數量，(b)將所述大量的纖維按照平行方向設置，(c)使單獨的纖維成束以形成纖維束，并成為最緊密的堆積(從垂直于纖維截面的角度觀察)，(d)單個纖維相互之間在纖維束中的設置是不可變更地固定，使得每個纖維占據一個幾何限定位置，并得到固化的纖維束，以及(e)以所纖維的間隔按照垂直于纖維長度的方向切割所述經固化的纖維束，產生平面檢測陣列的多個相同副本，該陣列具有用于檢測目標分子的探針分子，該探針分子在切割表面上處于幾何限定的位置中。
2.如權利要求1所述的方法，其中單獨的纖維成束以形成纖維束(亞纖維束)，然后使多個所述纖維束成束以形成組合纖維束(超纖維束)。
3.如權利要求1和/或2所述的方法，其中在步驟(a)和(b)中，(i)由噴嘴束中紡出大量的纖維，或者(ii)一個連續的纖維以曲折的方式設置在多個平面中，并且可由曲折中的平行部分形成大量纖維，或者(iii)多個連續的纖維以曲折的方式分別設置在平行平面中的一個平面上，然后由曲折中的平行部分形成大量纖維。
4.如至少一個前述權利要求所述的方法，其中大量探針分子分別固定在大量纖維的相應表面上或者在這些表面上進行合成，而且每個表面由可達到的內表面和外表面形成。
5.如權利要求1-3中至少一個所述的方法，其中大量的纖維是通過擠出大量的基礎纖維材料而制得的，每個所述基礎纖維材料在其上固定有大量的探針分子。
6.如至少一個前述權利要求所述的方法，其中纖維由多孔合成材料組成，特別是聚酯、聚氨酯或尼龍、纖維素、乙酸纖維素、棉花或絲綢，特別是天然絲綢。
7.如至少一個前述權利要求所述的方法，其中形成纖維束的纖維組合是通過沿相同方向扭轉或者纏繞來實施的。
8.如至少一個前述權利要求所述的方法，其中纖維相互之間不可改變的固定設置以及纖維束的固化是通過以下方法實施的在可固化材料中嵌入或者聚合，然后進行硬化、完全聚合或者冷凍。
9.如權利要求7所述的方法，其中所述可固化的材料是石蠟、明膠、聚丙烯酰胺、環氧樹脂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇水溶液或者聚乙烯醇/PEG水溶液。
10.如至少一個前述權利要求所述的方法，其中已固化的纖維束用切片機或者冷凍切片機進行切割。
11.用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列，其中該測試陣列是通過在一個并且相同的平面上最致密地二維設置或者最緊密壓緊具有表面積、特別是相同表面積的平面單元而形成的。
12.如權利要求11所述的用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列，其中每個單元僅具有一個類型的用于檢測一個類型目標分子的探針分子，而且纖維的數量至少相應于待檢測的目標分子的不同類型的數目。
13.如權利要求11或12所述的用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列，其中具有相同表面積的單元可具有盤狀，特別是圓盤形狀、橢圓盤狀或者六邊形盤狀，而且可以最緊密壓緊、特別是六邊形最緊密壓緊(由垂直于所述盤平面的角度觀察)的方式存在于一個并且相同的平面中。
14.通過根據權利要求1-10中至少一個所述的方法制得的用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列。
15.如權利要求10-14中至少一個所述的用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列，其中目標分子是目標生物分子，特別是細胞、病毒、噬菌體、核酸、肽核酸、蛋白質、酶、受體、凝集素、糖、抗體、抗原、抗生物素、鏈霉抗生物素蛋白或生物素。
16.一種醫療或診斷裝置，其包括一個或者多個、相同或者不同的根據權利要求10-15中至少一個用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列。
17.如權利要求17所述的裝置，其是夾持、洗滌或者溫育測試陣列的裝置。
18.一種試劑盒，其包括多個相同或者不同的根據權利要求10-15中至少一個用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列。
19.一種試劑盒，其包括一個或者多個、相同或者不同的根據權利要求10-15中至少一個用于檢測目標分子的探針分子平面測試陣列以及一種或者多種用于檢測與探針分子結合的目標分子的試劑。
20.根據權利要求10-15中至少一個的平面測試陣列、根據權利要求16或17的醫療或者診斷裝置、或者根據權利要求18或19的試劑盒在檢測目標分子、特別是目標生物分子中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種用于制備探針分子的平面檢測陣列的多個相同副本的方法，其是基于被切成所期望長度的纖維束，而所述探針分子是用于檢測目標分子。
文檔編號G01N37/00GK1538873SQ02811317
公開日2004年10月20日 申請日期2002年4月5日 優先權日2001年4月5日
發明者羅納德·弗朗克, 羅納德 弗朗克 申請人:生物技術研究有限公司(Gbf)