卒中的早期診斷的制作方法

專利名稱：卒中的早期診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過對體液例如全血、血漿和血清中未結(jié)合游離脂肪酸的測量來診斷卒中。
背景技術(shù)：
卒中(stroke)被定義為腦組織的血流量中斷。這種中斷可以是大腦特殊部位的中斷或者是例如當(dāng)心臟泵送血液完全失敗時，實(shí)際上所有血液流動的降低。更頻繁的是情況是，當(dāng)流向大腦特殊部分的血流被大腦血管的阻塞或者破裂所中斷時，卒中發(fā)生。血管的阻塞，例如通過栓塞或者通過通常形成在將血液提供給大腦的動脈中的血栓，被稱為缺血性卒中。通常經(jīng)由動脈瘤的腦血管破裂被稱作出血性卒中。
對于缺血性卒中的情況，血流量的中斷可能是暫時的；這被稱作暫時性缺血事件(TIA)。在這種情況下，患者通常不會經(jīng)歷臨床上或者可以測量到的有害結(jié)果，但是卻處于繼發(fā)卒中的高風(fēng)險(xiǎn)中。相反，其阻塞在數(shù)小時內(nèi)沒有被溶解的患者會受到永久性損傷，常常會引起死亡。這是腦細(xì)胞(組織)死亡的結(jié)果，所述的這些腦細(xì)胞(組織)通常由如今被阻塞的血管來提供養(yǎng)料和氧氣。通過計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT掃描)或者通過核磁共振(MRI)可以檢測所述組織的死亡或者梗塞，但是只有在卒中(第一癥狀)開始很多小時以后才可以進(jìn)行這種檢測。在出血的情況下，大腦開始充滿導(dǎo)致組織破壞的血液。
在發(fā)達(dá)國家，卒中是死亡的第三原因。僅在美國，每年大約有750,000個新病例。在美國，治療卒中的費(fèi)用和因由卒中引起的死亡和發(fā)病所導(dǎo)致的生產(chǎn)力損失是大約400億美元。對于卒中，唯一可用的治療是向患者給予血栓溶解劑例如組織纖維蛋白酶原激活物(t-PA)，該激活物通過將有助于形成凝塊的蛋白酶解來破壞此凝塊。因?yàn)槿绻褂玫锰頃a(chǎn)生有害作用(出血)，所以T-PA只能在第一癥狀出現(xiàn)的3小時內(nèi)使用。而且，t-PA只能用于缺血性卒中；在出血性卒中中使用t-PA通常會引起死亡。
因此，如果診斷迅速并且只有在排除出血性卒中的情況下，才可以使用血栓溶解療法。目前的診斷方法實(shí)際上完全依賴于臨床癥狀，通?？康氖羌痹\大夫的意見。如果大夫懷疑卒中并認(rèn)為患者可能是血栓溶解劑治療的候選者，那么隨后必須讓患者進(jìn)行CT掃描以排除出血(CT掃描可以在早期進(jìn)行檢測)。通常，由于這些決定和手續(xù)需要時間，極少數(shù)具有候選資格的患者可以接受血栓溶解療法。
因此，長期存在著這樣的需要能夠進(jìn)行簡單且快速的驗(yàn)血，其能夠確定在個體中出現(xiàn)或者未出現(xiàn)缺血性卒中，并可以區(qū)別缺血性和出血性卒中。本發(fā)明描述的測定體液例如血液、血清或者血漿中未結(jié)合游離脂肪酸的診斷方法，涉及簡單的、廉價的、實(shí)際上即時的、而且容易達(dá)到的測量方法，該方法很有可能揭示缺血事件。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，未結(jié)合游離脂肪酸在卒中期間升高。這一發(fā)現(xiàn)提供了一條檢測和診斷卒中的便利途徑，而且可以將缺血性卒中與其它呈現(xiàn)出類似癥狀的情況諸如出血性卒中、偏頭痛和抽搐發(fā)作區(qū)分開來。
在一個實(shí)施方案中，描述了在哺乳動物中檢測卒中的方法，該方法包括下列步驟提供來自哺乳動物的體液樣品，該哺乳動物呈現(xiàn)出與缺血性卒中相符合的癥狀；將所述樣品與一種水溶液和一種試劑混合，該試劑包括使用熒光部分標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白，其中該試劑在一種水溶液中顯示出第一熒光，并且當(dāng)脂肪酸結(jié)合蛋白與脂肪酸結(jié)合之后，在一種水溶液中顯示出一種可以被測量到的不同的第二熒光；和在將體液樣品與水溶液和所述的試劑混合以后測量第二熒光，以確定體液樣品中未結(jié)合游離脂肪酸的濃度。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，體液選自全血、血清和血漿。
在另一個實(shí)施方案中，描述了一種使用體液水平的未結(jié)合游離脂肪酸來監(jiān)測患者的卒中治療過程的方法，該方法包括下列步驟在整個卒中治療過程中的不同時間，測量來自所述患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸的水平；將所測得到未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測定無卒中癥狀正常群體體液中的未結(jié)合游離脂肪酸所確定；和在卒中治療過程中的任意特定時間點(diǎn)，確定來自患者體液樣品的未結(jié)合游離脂肪酸水平是否趨向于表示治療成功的來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平。
在一個實(shí)施方案中，描述了一種在呈現(xiàn)與卒中相符合癥狀的患者中確定出現(xiàn)卒中的方法，該方法包括下列步驟測量來自所述患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸的水平；將所測得到未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測定無卒中癥狀正常群體體液中的未結(jié)合游離脂肪酸所確定；和確定是否來自患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸相對于來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸閾值水平升高，其中相對升高指示卒中風(fēng)險(xiǎn)增高。在一個實(shí)施方案中，體液可以是血液、血清、或者血漿。
在一個實(shí)施方案中，測量步驟還包括下列步驟將體液樣品與一種水溶液和一種試劑混合，該試劑包括使用熒光部分標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白，其中該試劑在一種水溶液中顯示出第一熒光，并且當(dāng)脂肪酸結(jié)合蛋白與脂肪酸結(jié)合之后，在一種水溶液中顯示出一種可以被測量到的不同的第二熒光；和在將體液樣品與該水溶液和所述的試劑混合以后測量第二熒光，以確定體液樣品中未結(jié)合游離脂肪酸的濃度。在一個實(shí)施方案中，在不同于所述試劑顯示第一熒光的波長處，進(jìn)行第二熒光的測量步驟。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，測量第二熒光的波長是大約420nm-大約460nm，而且所述試劑顯示第一熒光的波長是大約495-大約560nm。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸結(jié)合蛋白是大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白、人脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白、或者大鼠心臟脂肪酸結(jié)合蛋白。熒光部分可以選自但不限于阿奎羅丹(acrylodan)，丹子基(danzyl)氮丙啶，4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基]-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑酯(IANBDE)，或者4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基]-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑(IANBDA)。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，混合和測量步驟中的試劑是被阿奎羅丹標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白，并且該脂肪酸結(jié)合蛋白是一種突變體蛋白，其選自但不限于在殘基27，81，82或者84具有Cys或者在殘基72具有丙氨酸的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白，或者在殘基27具有賴氨酸的大鼠心臟脂肪酸結(jié)合蛋白。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，混合和測量步驟中的試劑是被阿奎羅丹標(biāo)記的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白。在一個備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑是在殘基72具有丙氨酸的、被阿奎羅丹標(biāo)記的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白。
在一個實(shí)施方案中，指示卒中的未結(jié)合脂肪酸的濃度，超過確定自非缺血群體的未結(jié)合游離脂肪酸的濃度平均值兩個標(biāo)準(zhǔn)差單位。在另一個實(shí)施方案中，指示卒中的未結(jié)合脂肪酸的濃度，超過確定自非缺血群體的未結(jié)合游離脂肪酸的濃度平均值兩倍。
在一個實(shí)施方案，所述方法還包括下列步驟測量血液樣品中的總游離脂肪酸和自蛋白；和確定總游離脂肪酸與白蛋白的比率。
也可以使用其它結(jié)合脂肪酸的蛋白，在一個實(shí)施方案中，在呈現(xiàn)與卒中相符合的癥狀的患者中，確定卒中出現(xiàn)的方法可以包括下列步驟將體液樣品與一種水溶液和一種試劑混合，該試劑包括使用熒光部分標(biāo)記的白蛋白，該熒光部分可以是例如7-羥基香豆素或者氨茴酰，其中所述的試劑在一種水溶液中顯示出第一熒光，并且當(dāng)白蛋白與脂肪酸結(jié)合之后，在一種水溶液中顯示出一種可以被測量到的不同的第二熒光；和在將體液樣品與該水溶液和所述的試劑混合以后測量第二熒光，以確定體液樣品中未結(jié)合游離脂肪酸的濃度。
在一個實(shí)施方案中，描述了一種高危出血患者的鑒定方法，其包括下列步驟測定來自患者的體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸水平；將所測得的來自患者的未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測定沒有局部缺血的正常群體體液中的未結(jié)合游離脂肪酸而確定；和確定是否來自患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸相對于來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸閾值水平升高，其中相對升高指示出血風(fēng)險(xiǎn)增高。
在另一個實(shí)施方案中，描述了一種鑒定在卒中以后3年內(nèi)患者高風(fēng)險(xiǎn)死亡的方法，該方法包括下列步驟測定來自患者的體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸水平；將所測得的來自患者的未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測定沒有卒中的正常群體體液中的未結(jié)合或水溶性游離脂肪酸而確定；和確定是否來自患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸相對于來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸閾值水平升高，其中相對升高指示卒中后3年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)增高。
在另一個實(shí)施方案中，描述了一種用于診斷缺血性卒中的方法，其包括下列步驟鑒定呈現(xiàn)與缺血性卒中相符合的癥候?qū)W的患者；從該患者的體內(nèi)獲取體液樣品；測定樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸水平；和確定是否所測的未結(jié)合游離脂肪酸水平被足以升高到成為缺血性卒中的指示。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所測的未結(jié)合游離脂肪酸水平是缺血性卒中的指示時，隨后給予患者血栓溶解療法。
發(fā)明詳述盡管被描述的實(shí)施方案代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不離開本發(fā)明本質(zhì)的情況下發(fā)生變體。因此僅通過后附的權(quán)利要求來確定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明描述了卒中的診斷和監(jiān)測。在一個實(shí)施方案中，通過測量脂類組分例如脂肪酸，對卒中進(jìn)行了診斷或者對卒中治療的過程進(jìn)行了監(jiān)測?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中熟知的方法，例如在下面專利中教導(dǎo)的方法來確定總脂肪酸美國專利No.4,071,413，美國專利No.5,512,429，美國專利No.5,449,607，和美國專利No.4,369,250，所有這些專利文獻(xiàn)在此加入作為參考。可以將通過這些方法獲得的總脂肪酸水平，與從正常個體中獲得的總脂肪酸水平相比較，以檢測個體中的缺血疾病。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定總脂肪酸對白蛋白的比率并將其與正常群體作比較。
在另一個實(shí)施方案中，使用下面描述的方法在體液中測定未結(jié)合的游離脂肪酸水平。優(yōu)選地，在體液中例如腦脊液、細(xì)胞間液、血液、血清、血漿、尿液、唾液、淋巴、胃液、或者膽汁中測量未結(jié)合游離脂肪酸。未結(jié)合游離脂肪酸(FFAu)是溶于水相的游離脂肪酸部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于測試樣品的流體來自腦脊液、血液、血漿或者血清。在多數(shù)體液中，游離脂肪酸(FFA)主要與蛋白質(zhì)例如白蛋白和膜相結(jié)合，很少數(shù)是未結(jié)合(FFAu)和溶于水相的。FFAu也被稱作水溶性游離脂肪酸。
可以有利地將本發(fā)明的方法應(yīng)用于選擇患者群體。因此，例如，可以從呈現(xiàn)與缺血性卒中相符合癥狀的患者中獲取，或者從具有指示神經(jīng)學(xué)機(jī)能障礙的癥狀的患者中獲取可能存在FFAu的體液樣品。本發(fā)明的方法可以隨后被用于例如區(qū)分歸因于缺血性卒中的癥候?qū)W和歸因于其它情況如抽搐發(fā)作、出血性卒中、偏頭痛等的癥候?qū)W。卒中癥狀在醫(yī)學(xué)界廣為人知，而且這些癥狀包括部分癱瘓和全癱、語言障礙、特別是在身體一側(cè)的肢麻木或者無力、一只或者雙眼視覺的突然喪失或者損傷、嚴(yán)重頭痛、平衡性或者其它運(yùn)動機(jī)能的喪失、和眩暈。
本發(fā)明的另一方面是將這里討論的診斷步驟(指示患者是否患有缺血性卒中)與卒中相關(guān)治療相結(jié)合。一種可以用于本發(fā)明的治療類型是血栓溶解療法(例如tPA或者鏈激酶)。優(yōu)選地，在缺血性卒中事件發(fā)生后的很短時間內(nèi)給予這種治療，而且優(yōu)選在分析步驟的3，2，或者更優(yōu)選的1小時內(nèi)給予，所述的分析步驟顯示出了是缺血性卒中指示的FFAu水平。
在檢測缺血疾病的診斷方法中，可以使用任何這樣的分析手段，這些分析手段提供了相對于無癥狀群體的、在體液中的FFAu水平的指示。優(yōu)選地，從沒有卒中的正常群體中確定閾值。在一個實(shí)施方案中，閾值是這樣的體液中的FFAu濃度，該體液中的FFAu濃度明顯高于沒有缺血疾病的對照群體的體液中的FFAu濃度。在一個實(shí)施方案中，閾值是在比沒有缺血疾病的對照群體體液中的FFAu平均濃度至少高出2個標(biāo)準(zhǔn)差單位的體液中的FFAu濃度。在另一個實(shí)施方案中，F(xiàn)FAu在體液中的閾值濃度是沒有缺血疾病的對照群體體液中FFAu平均濃度的至少2倍。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明使用熒光標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)，通過定量檢測與FFAu分子同熒光標(biāo)記FABP的結(jié)合相關(guān)的熒光變化，來測量與卒中相關(guān)的血液、血清、或者血漿樣品中的FFAu量的增加。本發(fā)明使用的方法主要描述于美國專利No.5,470,714中，該專利文獻(xiàn)在此加入作為參考?；蛘?，可以使用能夠指示FABP與FFAu結(jié)合的任何其它適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物。很多分析模式和標(biāo)記技術(shù)是已知的，而且在本發(fā)明的至少一些方面中，具體的標(biāo)記物或者分析模式并不重要，可以使用任何本領(lǐng)域中合適的分析模式和標(biāo)記物。
多種FABP和熒光標(biāo)記可以被用于檢測體液例如血液、血清、或者血漿中的、指示卒中的FFAu水平。它們包括但不限于，大鼠腸FABP(I-FABP)、人脂肪細(xì)胞FABP(A-FABP)和大鼠心臟FABP(H-FABP)。這些FABP的位點(diǎn)特異的突變體類型在所述方法中同樣有用，在這些所述的突變體類型中有一個或者多個氨基酸殘基已經(jīng)發(fā)生改變(插入、缺失、和/或取代)，例如在I-FABP的27，81，82，84位置的Cys取代，在I-FABP殘基72的Ala取代，和在H-FABP殘基27的Lys取代。
可以通過使用多種已知的標(biāo)記物對FABP分子進(jìn)行熒光標(biāo)記，這些標(biāo)記物包括但不限于阿奎羅丹，丹子基(danzyl)氮丙啶，4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基]-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑酯(IANBDE)，和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑(IANBDA)。也可使用其它的結(jié)合FFA并且在FFA結(jié)合之后改變其熒光的蛋白質(zhì)，這些蛋白包括但不限于白蛋白。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，白蛋白具有熒光標(biāo)記例如7-羥基香豆素或者氨茴酰。可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用任何標(biāo)記物，只要其能夠在與游離脂肪酸結(jié)合之后檢測到可以測量得到的區(qū)別。例如，可以監(jiān)測在波長和信號強(qiáng)度上的差別?？梢允褂玫臉?biāo)記物的另外實(shí)例包括但不限于產(chǎn)生吸光或者光學(xué)活性改變的生色團(tuán)，和其變化可以通過電子自旋共振檢測到的自旋標(biāo)記物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記的FABP是阿奎羅丹衍生的重組大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白(被稱為ADIFAB)。主要使用在先前描述過的方法(美國專利No.5,470,714和Richieri，G.v，等.，J.Biol.Chem.，(1992)27623495-23501)進(jìn)行阿奎羅丹的衍生作用，而且ADIFAB可以商購(FFASciences LLC，San Diego，CA)。可以通過FFAu與熒光標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的結(jié)合來確定FFAu的濃度。當(dāng)沒有FFA結(jié)合熒光標(biāo)記的FFAB時，顯示出不同的熒光?？梢詮臒晒獾牟顒e確定FFAu的濃度。熒光標(biāo)記的FABP發(fā)出的波長，取決于所使用的標(biāo)記物和蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是I-FABP或者在其位置72處Ala取代Leu的I-FABP，標(biāo)記物是阿奎羅丹。這些種類分別被稱為ADIFAB和ADIFAB2。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ADIFAB2的結(jié)合親和力大約比ADIFAB大10倍。這些熒光標(biāo)記的I-FABP在沒有FFA時發(fā)出的最大強(qiáng)度的波長是大約420-440nm。結(jié)合到熒光標(biāo)記的FABP的FFA所發(fā)出的最大強(qiáng)度的波長是大約495-580nm。應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地在本發(fā)明公開的分析方法中使用其它熒光標(biāo)記的FABP。
用于確定含水樣品中FFAu水平的分析方法，測量從第一波長到第二波長的熒光中的變化強(qiáng)度，其中在第一波長時衍生的FABP在沒有FFA結(jié)合的時候發(fā)熒光，在第二波長時衍生的FABP在FFA的分子被結(jié)合時發(fā)熒光；而后從兩種熒光波長強(qiáng)度的比率(“R”值)來確定FFAu的濃度，如美國專利No.5,470,714和Richieri，等.(1995)J.Lipid Research，vol.36229-240頁中所述，將這兩篇文獻(xiàn)在此加入作為參考。簡單的說，用下面的公式來計(jì)算比率
其中，I(1)和I(1)空白分別是在波長“1”時，對含有ADIFAB或ADIFAB2的樣品和含有除了ADIFAB或ADIFAB2之外所有試劑的空白樣品所測的熒光強(qiáng)度；I(2)和I(2)空白分別是在波長“2”時的相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。對于ADIFAB，波長“1”優(yōu)選(但不是絕對的)范圍在495-515nm，波長“2”在422-442nm。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度的測定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識到，在適當(dāng)?shù)臈l件下，所述方程式中的I空白強(qiáng)度可以忽略不計(jì)。
對高過在正常健康個體中發(fā)現(xiàn)的血液、血清或者血漿FFAu水平的血液、血清或者血漿FFAu水平的定量檢測，可以被用于診斷卒中。在一個實(shí)施方案中，用血液、血清、或者血漿樣品中FFAu的濃度來指示卒中，此濃度明顯地高于在沒有卒中的對照群體的血液、血清或者血漿中的FFAu的濃度。在一個實(shí)施方案中，用血液、血清或者血漿樣品中FFAu的水平來檢測卒中，此水平超出血液、血清或者血漿中的FFAu平均正常水平大約2個標(biāo)準(zhǔn)差。在另一個實(shí)施方案中，超過對照群體中FFAu平均濃度2倍的FFAu水平，是卒中的指示。血液、血清或者血漿樣品中升高水平的FFAu也可以被檢測到，這些水平是相當(dāng)高的。
本發(fā)明的診斷方法基于這樣的發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷卒中的患者，與健康個體中正常的血液、血清或血漿FFAu水平相比，在體液例如血液、血清或血漿中具有升高的FFAu水平。雖然該診斷方法可以在任何時間進(jìn)行，但是優(yōu)選地，在缺血事件的24小時內(nèi)進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，在缺血事件的10小時內(nèi)進(jìn)行測試。最優(yōu)選地，在缺血事件的3小時內(nèi)進(jìn)行測試，從而可以啟動治療。為了有效，許多缺血疾病如心臟缺血的治療必須要快速啟動(數(shù)小時之內(nèi))。反之，沒有正確診斷的治療可能對患者是最有害的。例如，在出血性卒中的情況下使用血栓溶解療法會導(dǎo)致死亡。
本測試可以被用于區(qū)分缺血性卒中和其它情況例如偏頭痛、抽搐發(fā)作和出血性卒中。至少，本測試可以向醫(yī)務(wù)人員發(fā)出警報(bào)患者患有卒中。這樣，可以更迅速地開始進(jìn)行CT或者M(jìn)RI掃描，縮短進(jìn)行血栓溶解治療的時間。因?yàn)榧痹\醫(yī)務(wù)人員可以很容易地進(jìn)行本測試，所以這種警報(bào)甚至可以在救護(hù)車上發(fā)出。另外，在救護(hù)車上進(jìn)行該測試，對于這樣的患者非常有好處它們的住處距離具有治療卒中所必需的人員和設(shè)備的醫(yī)療機(jī)構(gòu)很遠(yuǎn)；這是因?yàn)榛诒景l(fā)明的測試，救護(hù)車將會駛向可以啟動適當(dāng)治療的合適醫(yī)療機(jī)構(gòu)。在缺血性卒中的情況下，治療可以包括給予血栓溶解劑例如t-PA。在出血性卒中的情況中禁忌使用t-PA，因?yàn)槭褂盟鼤?dǎo)致死亡。
實(shí)施例實(shí)施例1血樣中的FFAu分析簡而言之，如下進(jìn)行FFAu分析和測定。將血樣在緩沖液中(20mMN-2-羥乙基-哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)，150mM NaCl，5mM KCl和1mM Na2HPO4，調(diào)節(jié)到pH＝7.4)稀釋100倍，產(chǎn)生大約6μM的血清白蛋白濃度。將加上ADIFAB或ADIFAB2的不含脂肪酸的白蛋白溶液作為陰性對照。對于每個供體，制備兩個等分試樣的血清一個是1％血清的“背景”或者“空白”樣品，一個是1％血清加上ADIFAB或者ADIFAB2的“實(shí)驗(yàn)”樣品。在22℃或者37℃測量陰性對照，空白和實(shí)驗(yàn)樣品。
對每個樣品，對ADIFAB在大約432nm和505nm、對ADIFAB2在大約450nm和550nm收集強(qiáng)度對的多次測量，在減去空白樣品的強(qiáng)度以后確定R值。在不同的日子對每個血清樣品至少進(jìn)行兩次分別的測定，確定FFAu濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。為了確定測量組之間的差別的概率，使用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)者測試(Student′s test)評價平均差值，其中p值小于0.05被認(rèn)為是有意義的。
實(shí)施例2在急診室中，呈現(xiàn)卒中癥狀的患者中的[FFAu]升高在入院時和接下來幾天的幾個后來的時期，從39位進(jìn)入醫(yī)院急診室的患者中獲取血樣。使用描述在美國專利No.5,470,714中的熒光修飾的脂肪酸結(jié)合蛋白來測定未結(jié)合游離脂肪酸(FFAu)水平。在每個樣品中同時測定FFAu水平和肌酸激酶(CK-MB)水平。一位患者最終被診斷為患有卒中。在這個時期中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAu值超過正常水平的2倍，而CK-MB值均在正常范圍內(nèi)。
實(shí)施例3在病灶腦缺血大鼠模型中，[FFAu]升高用大鼠模型來監(jiān)測與病灶腦缺血相關(guān)的血漿FFAu水平。使用描述在Jackson-Friedman，等(1997)Neurology vol.147pages 346-352中的腔內(nèi)阻塞來誘導(dǎo)可逆的左大腦中動脈(MCA)腦缺血病灶。從外周循環(huán)中進(jìn)行血漿取樣。將成年大鼠麻醉。將4-0尼龍縫合線(熱鈍尖)插入頸總動脈并且向前通過頸內(nèi)動脈以使尖端到達(dá)大腦前動脈，從而阻塞了MCA的起點(diǎn)而沒有進(jìn)入其管腔。在動脈切開結(jié)束以后，縫合線絲的自由近端被暴露在外部。在特定時間，將該縫合線絲向后拉動，從而恢復(fù)流向MCA的血流。在阻塞前后的不同時間，抽取大約0.1ml血液。將血液抽入含有緩沖鹽水的、被肝素化的注射器中并且立即置于冰上以將溶血作用降低到最小。將稀釋的血液離心，并且在22℃使用ADIFAB2，將稀釋到1％的血漿用于確定FFAu，基本上如Richieri等(1999)Mol.CellBiochem.vol.192，87-94頁中對ADIFAB的描述。
簡而言之，用如下方法獲得ADIFAB2。首先，用攜帶Ala72突變和合適互補(bǔ)末端的限制性酶切片段來替代野生型限制性酶切片段，此片段跨越I-FABP cDNA序列211位置的SalI位點(diǎn)(Alpers，等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.81313-317)和291位置的PmeI位點(diǎn)，通過點(diǎn)特異誘變來將其引入。此突變的限制性酶切片段是通過退火部分互補(bǔ)的、攜帶所需序列的合成寡核苷酸，用DNA聚合酶Klenow片段“填補(bǔ)”單鏈區(qū)，和用SalI與PmeI消化以得到適當(dāng)末端而構(gòu)建的。將Ala72取代的I-FABPcDNA插入pET11載體中并且在BL21(DE3)株系中表達(dá)。基本使用Lowe等的方法(Lowe，等.(1987)J.Biol.Chem.2625931-5937頁)純化突變的I-FABP并且每公升大腸桿菌培養(yǎng)物生產(chǎn)出大約100mg的純化蛋白質(zhì)。如前所述(見美國專利No.5,470,714，在此加入作為參考)對ADIFAB進(jìn)行阿奎羅丹的衍生作用，使用Lipidex-5000色譜法來去除游離的阿奎羅丹。
阿奎羅丹衍生的Leu72-＞Ala I-FABP(ADIFAB2)的熒光特性與ADIFAB的熒光特性明顯不同。與ADIFAB的大約432和大約505nm相比，發(fā)射最大值的位置出現(xiàn)在較長的波長處，對apo-ADIFAB2為大約440nm且對holo-ADIFAB2為大約550nm，而且，與ADIFAB的大約為386nm的最理想激發(fā)波長相比，ADIFAB2的最理想激發(fā)波長為大約375nm。另外，確定平衡結(jié)合特性的參數(shù)Ro，Rmax，和Q(見美國專利No.5,470,714)也與ADIFAB2顯著不同，與ADIFAB相反，這些參數(shù)的數(shù)值是脂肪酸和溫度依賴的。因此，對于440nm和550nm和油酸鹽，Rmax和Q的范圍在10-37℃的溫度內(nèi)分別為1.6-2.5和7.5-12，而且對于軟脂酸鹽和硬脂酸鹽，這些數(shù)值都高大約10％。
在大約15分鐘-2小時，使用可逆MCA阻塞的動物進(jìn)行測量。在進(jìn)行手術(shù)之前、傷口閉合時、和手術(shù)以后的不同時間(例如1，2，3，4和24小時)抽取血樣。將不同阻塞的[FFAu]時程平均化。在大約1-2小時，[FFAu]水平增加并達(dá)到頂峰，隨后的24小時，[FFAu]水平逐漸下降回到基線。FFAu水平在阻塞以后快速升高并且保持升高超過4小時。這種行為是重要的，因?yàn)閷τ谌毖宰渲械奈ㄒ恢委煼椒ㄊ墙o予諸如組織纖維蛋白溶酶原激活物(t-PA)的血栓溶解藥物，而該藥物的給予必須要在始發(fā)癥狀的3小時之內(nèi)。而且，t-PA給予得越早，治療價值越高。缺血事件后FFAu水平的快速升高，提供了理想的診斷窗口。
實(shí)施例4在出血性卒中的大鼠模型中，F(xiàn)FAu水平不會保持升高診斷缺血性卒中的一個主要問題是患有非腦缺血綜合癥的患者常常表現(xiàn)出摹仿卒中的癥狀。在這些“卒中摹擬”中主要有出血性卒中和抽搐發(fā)作。由于t-PA對于出血性卒中患者可能是致命的，所以對缺血性事件的錯誤診斷，其后果是非常嚴(yán)重的。
通過將100-200ml的大鼠血液注射到尾狀核中，得到了出血性卒中的可能模型。該出血(血腫)模型顯示了[FFAu]在注射時間(0)有一個非常陡的尖峰，隨后在1-2小時內(nèi)回到基線。[FFAu]時程從時間0降低，并且經(jīng)過2小時進(jìn)入基線的30％之內(nèi)。
實(shí)施例5在抽搐發(fā)作過程中，F(xiàn)FAu水平?jīng)]有升高通過將荷包牡丹堿注入誘導(dǎo)抽搐發(fā)作的尾狀核來得到抽搐發(fā)作的大鼠模型。在此抽搐發(fā)作模型中，[FFAu]的時程揭示經(jīng)24小時，實(shí)際上沒有離開基線的變化。
實(shí)施例6卒中介導(dǎo)的血漿FFA增加是由脂肪組織脂解作用引起的早已知道在動物中誘導(dǎo)的腦缺血導(dǎo)致FFA在腦組織中累積。這種測定需要收集腦組織和有機(jī)提取物以分離該組織的脂類組分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺血大腦的FFA含量在局部缺血誘導(dǎo)的數(shù)分鐘內(nèi)增加，而且最終可能相對于對照組織增加差不多8倍(在完全局部缺血中)。因此看來血漿FFA的增加似乎好象是缺血腦組織的FFA含量增加的明顯結(jié)果。然而，與FFA的血漿水平相比，即便是在完全缺血(斷頭處理)的情況下產(chǎn)生的FFA的絕對量，也是太少了以至于不能明顯增加[FFAu]。例如，在完全局部缺血中，在大鼠腦中累積了0.8微摩爾的FFA。在可逆的腦缺血中(比斷頭處理的缺血損傷程度輕得多)，血漿FFA的量增加了大約100倍。
有足夠能力產(chǎn)生在腦缺血中觀察到的大量FFA的唯一組織是脂肪組織。我們的研究顯示大腦在腦缺血的數(shù)分鐘內(nèi)釋放一種或者多種脂肪脂解活化劑。至少兩種這樣的活化劑在腦缺血時釋放降腎上腺素(norephinephrine)和TNFα。在大鼠卒中模型的可逆的2小時阻塞(實(shí)施例2)中抽取血液標(biāo)本，相同血樣標(biāo)本中的[FFAu]和TNFα這兩種物質(zhì)的量都升高并且遵循相同的時程。
實(shí)施例7[FFAu]在呈現(xiàn)腦缺血的人患者中早期升高在卒中患者中測量[FFAu]，能夠快速且靈敏地指示卒中患者，而且可以將這樣的患者與卒中摹擬區(qū)分開來。
以前在Richieri等(1995)J.Lipid Res.vol.36229-240頁中，報(bào)道了對名義上健康的人受試者(正常)的[FFAu]測量結(jié)果。在37℃，使用FFAu第一熒光探針——ADIFAB進(jìn)行這些測量。這些測量的結(jié)果顯示了分別為7.5nM和2.5nM的平均差和標(biāo)準(zhǔn)差。在22℃，使用ADIFAB2探針(Richieri等(1996)J.Biol.Chem.vol.2711291-11300頁)進(jìn)行[FFAu]測量，測量結(jié)果提供了分別為2.8nM和0.7nM的平均差和標(biāo)準(zhǔn)差。這兩個探針?biāo)玫降臄?shù)值的差別，部分是由于隨溫度降低的[FFAu]降低，以及ADIFAB探針對血漿中的因子例如血紅蛋白的較高的靈敏度，與ADIFAB2探針相比，這些因子優(yōu)先吸收較短波長的ADIFAB熒光。
對患有范圍很廣的疾病的患者進(jìn)行[FFAu]測定，結(jié)果顯示除了患有腦缺血或者心臟缺血、和可能患有敗血癥的患者以外，這種疾病群體的[FFAu]分布與正常無癥狀個體的分布非常相同。與這些結(jié)果相反，腦缺血患者顯示出明顯升高的[FFAu]。
血樣來自多個不同醫(yī)院的、可能患有卒中的患者。在患者住院期間的一個或者多個時間點(diǎn)抽取血液標(biāo)本。對在就診時(第一癥狀出現(xiàn)后2-5小時)提取的樣品進(jìn)行[FFAu]測量，測量結(jié)果顯示出這樣的一種分布與無癥狀個體相比，此分布轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@較高的水平。這些結(jié)果表明，[FFAu]測量為人類缺血性卒中提供了早期且準(zhǔn)確的診斷。
本發(fā)明的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不離開本發(fā)明的精神的情況下可以作出大量且不同的變體。因此，應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明的形式僅僅是說明性的并且不是為了限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物中檢測卒中的方法，其包含下列步驟提供來自哺乳動物的體液樣品，該哺乳動物呈現(xiàn)出與缺血性卒中相符合的癥狀；將所述樣品與一種水溶液和一種試劑混合，該試劑包括使用熒光部分標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白，其中該試劑在一種水溶液中顯示出第一熒光，并且當(dāng)脂肪酸結(jié)合蛋白與脂肪酸結(jié)合之后，在一種水溶液中顯示出一種可以被測量到的不同的第二熒光；和在將所述體液樣品與所述的水溶液和所述的試劑混合以后測量所述的第二熒光，以確定在所述體液樣品中未結(jié)合游離脂肪酸的濃度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的體液選自全血、血清和血漿。
3.一種使用未結(jié)合游離脂肪酸的體液水平來監(jiān)測患者的卒中治療過程的方法，該方法包括下列步驟在整個卒中治療過程中的不同時間，測量來自所述患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸的水平；將所測得的未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中所述的閾值水平由測定無卒中癥狀正常群體體液中的未結(jié)合游離脂肪酸所確定；和在卒中治療過程中的任意特定時間點(diǎn)，確定來自患者體液樣品的未結(jié)合游離脂肪酸水平是否趨向于指示卒中治療成功的來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平。
4.一種在呈現(xiàn)與卒中相符合癥狀的患者中確定存在卒中的方法，該方法包括下列步驟測量來自所述患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸的水平；將所測得的未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中所述的閾值水平由測定無卒中癥狀正常群體體液中的未結(jié)合游離脂肪酸所確定；和確定是否來自患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸相對于來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸閾值水平升高，其中所述的相對升高指示卒中風(fēng)險(xiǎn)增高。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的體液選自血液、血清、和血漿。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的測量步驟還包括將所述的體液樣品與一種水溶液和一種試劑混合，該試劑包括使用熒光部分標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白，其中所述的試劑在一種水溶液中顯示出第一熒光，并且當(dāng)所述的脂肪酸結(jié)合蛋白與脂肪酸結(jié)合之后，在一種水溶液中顯示出一種可以被測量到的不同的第二熒光；和在將所述的體液樣品與所述的水溶液和所述的試劑混合以后測量所述的第二熒光，以確定所述體液樣品中未結(jié)合游離脂肪酸的濃度。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述第二熒光的所述測量步驟是在不同于所述試劑顯示所述第一熒光的波長處進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中用于測量所述第二熒光的所述波長是大約420nm-大約460nm，而且所述試劑顯示所述第一熒光的所述波長是大約495-大約560nm。
9.權(quán)利要求6的方法，其還包括下列步驟測量所述血液樣品中的總游離脂肪酸和白蛋白；和確定所述總游離脂肪酸與所述白蛋白的比率。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述的脂肪酸結(jié)合蛋白是大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白、人脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白、或者大鼠心臟脂肪酸結(jié)合蛋白，并且所述的熒光部分是阿奎羅丹，丹子基氮丙啶，4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基]-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑酯(IANBDE)，或者4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基]-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑(IANBDA)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中在所述混合和測量步驟中的所述試劑是被阿奎羅丹標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白，其中所述的脂肪酸結(jié)合蛋白是突變體蛋白，其包括在殘基27、81、82或者84具有半胱氨酸或者在殘基72具有丙氨酸的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白，或者在殘基27具有賴氨酸的大鼠心臟脂肪酸結(jié)合蛋白。
12.權(quán)利要求6的方法，其中在所述混合和測量步驟中的所述試劑是被阿奎羅丹標(biāo)記的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的試劑是被阿奎羅丹標(biāo)記的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白，而且該蛋白在殘基72具有丙氨酸。
14.權(quán)利要求6的方法，其中超過確定自非缺血群體的未結(jié)合游離脂肪酸的濃度平均值兩個標(biāo)準(zhǔn)差單位的未結(jié)合游離脂肪酸濃度是卒中的指示。
15.權(quán)利要求6的方法，其中超過確定自非缺血群體的未結(jié)合游離脂肪酸的濃度平均值兩倍的未結(jié)合游離脂肪酸濃度是卒中的指示。
16.權(quán)利要求4的方法，其中所述的測量步驟還包括下列步驟將所述的體液樣品與一種水溶液和一種試劑混合，該試劑包括使用熒光部分標(biāo)記的白蛋白，該熒光部分選自7-羥基香豆素和氨茴酰，其中所述的試劑在一種水溶液中顯示出第一熒光，并且當(dāng)所述白蛋白與脂肪酸結(jié)合之后，在一種水溶液中顯示出一種可以被測量到的不同的第二熒光；和在將所述體液樣品與所述水溶液和所述試劑混合以后測量所述的第二熒光，以確定在所述體液樣品中未結(jié)合游離脂肪酸的濃度。
17.一種鑒定高危出血患者的方法，其包括下列步驟測定來自所述患者的體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸水平；將所測得的來自患者的未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中所述的閾值水平由測定沒有局部缺血的正常群體體液中的未結(jié)合游離脂肪酸而確定；和確定是否來自患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸相對于來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸閾值水平升高，其中所述的相對升高指示出血風(fēng)險(xiǎn)增高。
18.一種鑒定在卒中以后患者在3年內(nèi)高風(fēng)險(xiǎn)死亡的方法，該方法包括下列步驟測定來自所述患者的體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸水平；將所測得的來自患者的未結(jié)合游離脂肪酸水平與未結(jié)合游離脂肪酸的閾值水平相比較，其中所述的閾值水平由測定沒有卒中的正常群體體液中的未結(jié)合或水溶性游離脂肪酸而確定；和確定是否來自患者體液樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸相對于來自正常群體的未結(jié)合游離脂肪酸閾值水平升高，其中所述的相對升高指示卒中3年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)增高。
19.一種用于診斷缺血性卒中的方法，其包括下列步驟鑒定呈現(xiàn)與缺血性卒中相符合的癥候?qū)W的患者；從所述患者的體內(nèi)獲取體液樣品；測定樣品中的未結(jié)合游離脂肪酸水平；和確定是否所測的未結(jié)合游離脂肪酸水平被充分升高到成為缺血性卒中的指示。
20.權(quán)利要求19的方法，其還包括當(dāng)所測的未結(jié)合游離脂肪酸水平是缺血性卒中的指示時，給予所述患者血栓溶解療法。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于早期診斷卒中的方法，該方法使用一種包括熒光修飾的脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑。在結(jié)合情況和未結(jié)合情況下記錄熒光差別。將來自血液的未結(jié)合脂肪酸的水平升高用作卒中的指示。
文檔編號G01N21/78GK1524182SQ02802867
公開日2004年8月25日 申請日期2002年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者艾倫·克萊費(fèi)爾德, 艾倫 克萊費(fèi)爾德 申請人:艾倫·克萊費(fèi)爾德, 艾倫 克萊費(fèi)爾德