專利名稱：一種蛋白質芯片及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質芯片及其制備方法和應用，尤其涉及用無細胞離體一步到位的蛋白質體外合成法制備蛋白質芯片以及其在臨床診斷、醫學研究、新藥開發和檢驗、蛋白質組研究等領域相關應用。
背景技術：
在人類基因組DNA序列被測定和其它大量物種的基因組被逐步迅速測定的背景下，目前迫在眉睫的任務是發展一套高效、快捷和實用的方法或技術來研究基因組所編碼的蛋白質的功能，以獲得對細胞內各生物過程和途徑的全面完整的理解。微列陣技術作為目前一種高效、全面和快捷的方法已在研究基因表達、基因突變和基因轉錄調控等領域發揮出其特有的快速獲取大量、平行數據的作用。由于蛋白質在實現基因功能上比mRNA更進一步，所以目前研發蛋白質微列陣技術來研究大量蛋白質，甚至整個蛋白質組的功能已成為大規模和后基因組生物學的前沿。蛋白質芯片技術借用大量已成熟的DNA芯片技術，已發展出了包括低密度的金屬表面的SELDI芯片、高密度的三維凝膠片芯片、高密度圓柱狀芯片等形式。如文獻1(Zhu H.et al.Science.2001，2932101-5)報告了如何在高密度平滑玻璃表面制備蛋白質組芯片及其應用的工作。如何將蛋白質高效固定于固體表面是制作蛋白質芯片的另一重要的問題。目前存在的固體表面包括用二價鎳、環氧基或醛基活化的PDMS或玻璃表面，其他還有硝酸纖維、金屬或Poly-L-lysine覆蓋等表面。
然而，蛋白質芯片領域中最大的障礙是資金的高投入、研發的長周期及其技術的高度復雜性。目前的采用的方法包括基因克隆、活體細胞蛋白質表達、大規模高效率蛋白質提純和蛋白質芯片的制備和應用這四部分。目前這四部分都是分步單獨進行，每一步的實施均要求專門的設備和人力，每一步的產品也得分門別類地記錄和保存。其中真核生物的基因克隆一項需消耗大量的人力、物力、空間和時間；蛋白質的表達和大規模提純不但消耗大量的人力、物力，還必須掌握專門技術，目前世界上只有屈指可數的幾個實驗室可以做到，另外，蛋白質的保存期在-80攝氏度冰箱內也少于6個月；而蛋白質芯片的制作過程也因為蛋白質自身的不穩定性，必須在嚴格控制的條件下反復調試才能實現，更重要的是一旦制成蛋白質芯片，該芯片不但難于保存(＜7天)，而且無法運輸，更不能形成產品。
因此，在蛋白質芯片領域中，如何以低成本克隆大量真核生物的基因、高效獲取多種蛋白質以及蛋白質芯片的實用化和商品化仍是這個領域的瓶頸。目前已有的方法還無法適應研究像人類這樣復雜的蛋白質組的研究工作。而且，蛋白質芯片在臨床診斷、生物醫學及基礎研究中如何發揮更有效的作用還有待進一步的突破。
發明內容
本發明的目的在于克服蛋白質自身的不穩定性，必須在嚴格控制的條件下反復調試才能實現，更重要的是一旦制成蛋白質芯片，該芯片不但難于保存(＜7天)，而且無法運輸，更不能形成產品的缺陷；以及克服傳統制備方法必須先克隆基因表達片段，經細胞內表達、合成蛋白質純化的繁雜步驟的缺陷；從而提供一種保存時間長的、實用化和商品化的蛋白質芯片及其應用。以及提供一種制作過程簡單，無需利用活體細胞表達蛋白和繁瑣的純化步驟的蛋白質芯片制備方法。
本發明提供的蛋白質芯片包括一基片，基片上有親和層，以及親和層上有生物大分子層，其中生物大分子層為編碼基因片段，或編碼基因片段的產物膜層。
所用的基片是常規的生物芯片基片材料；可以是玻璃、石英或表面鍍膜的固體復合材料；該表面鍍膜的固體復合材料最好是鍍金屬膜(如金、銀、銅、鋅)的陶瓷、塑料、石墨或聚合硅烷(如二甲基硅烷)。本發明的蛋白質芯片，其基片層結構可以是平滑形(基片表面為一連續的平面)，如圖1A所示；也可以是微孔形(基片表面設有分隔設置的且不會互相滲漏的腔體，該腔體可以是由基片材料本身形成分隔裝置得到的，如圖1B，腔體也可在基片上粘貼一層格柵狀膠材得到)，根據需要腔體的直徑或長度可以為幾納米到幾百微米；基片層結構也可以是島狀突起形(基片表面為一個個柱狀的凸起物)，如圖1C所示。當微孔形芯片的腔體為0.1nm～3nm時，稱之為毛細微孔形芯片，如圖1D所示；微孔形、島狀突起形和毛細微孔形芯片尤其適用于不同樣品的同時檢測，用者可根據其需要采用適當的芯片。
基片層表面須經化學修飾而激活，以達到固定親合層的目的。在用玻璃或石英材料作基片時，可由簡單的酸堿處理而獲得表面激活的羥基，以用于共價結合硅烷化合物的親合層；在用陶瓷、塑料、石墨或聚二甲基硅烷等材料作基片時，可采用金、銀、銅、鋅等金屬鍍膜實現表面激活，以達到共價連接巰基烷類化合物單分子膜的目的。
所述的蛋白質芯片，其基片上的親和層是一種與蛋白質能高度特異親合的單分子膜，該單分子膜為有機長鏈，其上共價結合有親和分子(見圖3中標號4所示)，親和分子可以是生物素、抗生物素蛋白(Avidin)、抗體變異區、谷胱甘肽、聚丙烯酰胺膠、瓊脂糖凝膠或螯合劑，這些螯合劑螯合金屬離子Ni2+、Fe3+、Cu2+、Ga2+或Ca2+等，如EDTA，EGTA，NTA(tetradentatenitrolotriacetic acid)，IDA(iminodiacetic acid)或TCE(tris(carboxymethyl)ethylenediamine)，三亞氨乙酰乙酸(tridentate iminodiacetic acid)等。這些解離常數(Kd)在10-7以上的分子可與合成的蛋白質上的親合標記非常選擇性地牢固結合，從而實現高度特異地固定蛋白質的目的，避免了非特異性結合造成的高背景。而且，由于不同編碼基因產物上的親合標記總在同一位置出現，蛋白質能以完全一致的空間取向通過特異親合標記固定于芯片表面，從而最大限度地保持了生物大分子的自然構相。
本發明的蛋白質芯片，其親和層上的生物大分子層為編碼基因片段，或編碼基因片段的產物。編碼基因片段在實施例中選用RNA或DNA，選用的RNA可以是mRNA、tRNA以及人工合成的RNA等，選用的DNA可以是cDNA、PCR擴增產物、人工合成的DNA以及基因組中的核苷酸片段等。也可以采用逆向PCR(RT-PCR)技術直接從活體組織內提取的mRNA中擴增目標基因表達片段。該編碼基因不拘泥于用來合成蛋白質，還可設計模板用于合成人工隨機短肽(Random peptide)，抗體隨機變異區(如Phage display技術所描述的)，或含有其它蛋白結合變異區(如Affibody技術所描述的)的人工隨機短肽或蛋白質。
本發明進一步提供了一種所述蛋白質芯片的制備方法，包括如下步驟(2)基片表面的處理和活化清潔固體基片，并將基片表面進行活化使其共價連接親和層的單分子膜。基片層表面須經化學修飾而激活，以達到固定親合層的目的，在用玻璃或石英材料作基片時，可由簡單的酸堿處理而獲得表面激活的羥基，以用于共價結合親合層；在用陶瓷、塑料、石墨或聚二甲基硅烷等材料作基片時，可采用金、銀、銅、鋅等金屬鍍膜實現表面激活，以達到共價連接巰基烷類化合物單分子膜的目的。
(3)生物大分子層的制備將基因擴增產物加到上述步驟(1)得到的結合有親和層的基片上，制得生物大分子層為編碼基因片段的蛋白質芯片。
由該方法制得的蛋白質芯片是一種前體蛋白質芯片，在使用的時候必須通過如下步驟利用無細胞體外轉錄-翻譯系統把從DNA到mRNA、mRNA到蛋白質、溶液中游離蛋白質到表面固定蛋白質這一系列反應和變化在同一反應體系內一步完成，即一步到位完成。該使用方法具體包括步驟(3)即基因擴增產物的翻譯過程(參見圖3)1)體積比(20～200)∶(1～10)∶1將體外轉錄翻譯反應液，100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合；2)將本發明制得的生物大分子層為編碼基因片段的蛋白質芯片浸沒于上述步驟1)制成的混合液中，30℃溫育1到3小時，實現從編碼基因片段到蛋白質的生化反應，并同時完成從游離蛋白質到表面固定蛋白質的轉化。
3)用緩沖液清洗步驟2)得到的蛋白質芯片，制得的蛋白質芯片即可使用或冷藏待用。
所述的使用步驟進一步優選在步驟2)中將蛋白質芯片浸沒于步驟1)制成的混合液之后，還包括用震蕩或超聲波清洗儀除去芯片表面的氣泡。
該發明還可在2cm×5cm的固體表面內形成1000到100000個蛋白質點，即高密度蛋白質芯片或高密度蛋白質微列陣。
本發明進一步涉及所述的蛋白質芯片在臨床診斷、醫學研究、新藥開發和檢驗、蛋白質組研究等領域的用途。例如，該蛋白質芯片可用于勾勒小到細胞器、細胞、大到各種體液、組織、器官、系統，甚至整個生物的蛋白質組成輪廓，從而發現疾病特異的生物標記，以用于對各種惡性疾病的早期臨床診斷；又如，該蛋白質芯片可用于發現組織或疾病特異表達的蛋白質，從而促進基礎醫學的研究；又如，該蛋白質芯片可用于新藥開發和檢驗，通過對蛋白質與藥物小分子間相互作用的研究，可以發現哪些藥物小分子具有能與某種疾病或癌癥相關蛋白作用而達到抑制病變的目的，從而發現新藥；又如，該蛋白質芯片可用于蛋白質組的基礎研究，蛋白質芯片可作為實驗平臺來研究蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA、蛋白質-脂肪、蛋白質-抗體、蛋白質-短肽、蛋白質-多聚糖之間的相互作用，蛋白質芯片還可作為實驗平臺來研究真核生物蛋白質的轉錄后修飾和尋找各種酶的下游底物，從而為勾勒生物體內的各種生物途徑的網絡圖提供豐富的實驗依據。
本發明拓展了蛋白質芯片與下游實驗的結合配套，如在表面金屬覆蓋的蛋白質芯片上可以用表面等離子體共振(SPR)的檢測手段研究蛋白質與其它分子間的結合和解離常數，從而解決了以往無法大規模同步測定多種蛋白質與其它分子間的結合或解離常數的難題。還可在表面金屬覆蓋的微孔蛋白質芯片上可以結合質譜的檢測手段確定何種分子與蛋白質芯片上的蛋白質結合，從而大大縮短了檢測周期，提高了檢測效率。
本發明的蛋白質芯片和現有的蛋白質芯片相比，具有如下優點(1)本發明提供的蛋白質芯片是一種前體蛋白質芯片，在保持了現有的蛋白質芯片的高密度、高效率的特點，其蛋白質點陣密度可達1000-100000個蛋白質、抗體或人工短肽點每10平方厘米。本發明只需將編碼目標蛋白質或短肽的編碼序列制成前體芯片，然后實現原位蛋白質轉錄、合成，完全省略了傳統方法的克隆基因活體細胞表達合成蛋白質和用芯片制備儀來制備蛋白質芯片的四大步驟的全新的一步到位制備方法。該方法有效地解決了蛋白質不易保存和隨時間降解的問題。使用者可根據需要隨時由前體蛋白質芯片轉化為新鮮的蛋白質芯片，最大程度地避免了蛋白質不穩定的問題，該前體芯片可于室溫下保存(～5年)和運輸，大大促進了蛋白質芯片的實用化和商品化。
(2)本發明提供的由基片層、特異親合層和編碼基因片段層構成的蛋白質芯片，節省了大量消耗在克隆真核生物基因外顯子的人力、物力、費用和時間，而且節省了保存這些克隆的大量空間，也省略了用活體細胞表達蛋白質和繁復的蛋白質提純步驟，有效避免了由于保存多套克隆帶來的交叉污染的可能，并解決了由于細胞株的生長差異而造成的蛋白質產量不均一的情況，進而消除了由此導致的固定在芯片表面上的蛋白質量的巨大差異，從而大大降低了因固定在芯片表面蛋白質數量和質量上的差異而造成的實驗誤差。
(3)本發明的蛋白質芯片采用了具高度特異性的親合層，可使編碼基因產物以完全一致的空間取向通過特異親合標記固定于芯片表面，從而最大限度地保持了生物分子的自然構相。固定于表面的模板可用于合成蛋白質、短肽、抗體變異區等生物分子，本發明極大地提高了蛋白質芯片在實際應用上的靈活性。
(4)本發明進一步拓展了蛋白質芯片與各種下游實驗的結合配套，如在表面金屬覆蓋的蛋白質芯片上可以用表面等離子體共振(SPR)的檢測手段研究蛋白質與其它分子間的結合和解離常數，從而解決了以往無法大規模同步測定蛋白質與其它分子間的結合和解離常數的難題；該蛋白質芯片可以結合質譜的檢測手段研究何種分子與蛋白質芯片上的蛋白質結合，從而大大縮短了檢測周期，提高了檢測效率。
(5)本發明還拓展了蛋白質芯片在藥物篩選、藥效測定、藥物目標蛋白的確定、藥物副作用的測定等領域中的應用，為實現實時臨床監測、新藥發現和普及蛋白質組的基礎研究打下了堅實的基礎。
圖1A為平滑基片蛋白質芯片的構造截面1B為微孔基片蛋白質芯片的構造截面1C為島狀突起基片蛋白質芯片的構造截面1D為毛細微孔基片蛋白質芯片的構造截面圖其中，1為基片2為親合層3為生物大分子層I表示放大圖2為實施例1中基片表面的處理其中1為基片 2為金屬鍍膜3為親合層S1為鍍膜步驟S2為結合親和層步驟圖3為一步到位法制備蛋白質芯片其中1為基片2為金屬鍍膜 3為親合層4為親和分子5為蛋白質6為親和標記具體實施方式
實施例1在高密度島狀突起玻璃基片上制備蛋白質芯片步驟一基片表面的處理和活化(參見圖2所示)
1)用純水將高密度島狀突起石墨基片沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)于真空蒸發臺內將待鍍的石墨基片置于樣品臺上，把待鍍金屬置于蒸發舟內，在金的熔點下于10-2Pa將金鍍于石墨基片的表面。
3)鍍好的石墨基片置于含有10-巰基癸烷-NTA(Ca2+)的溶液中，在室溫反應三小時以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗上述3)得到的基片三次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備島狀突起前體蛋白質芯片(參見圖3所示)1)儲存于-80℃冰箱內擴增基因產物于室溫融化，并于3000rpm離心5分鐘。
2)將步驟一中制備的連接有親和層的島狀突起基片排列在芯片合成儀的工作平臺上，將盛有基因產物的384孔板(見實施例4)置于機器內部的原料平臺上。
3)在芯片合成儀的控制計算機上輸入制備一步到位前體蛋白質芯片各種參數，并啟動程序。
4)取下芯片合成儀完成印制前體蛋白質芯片，于干燥無灰塵條件下保存芯片。
步驟三從島狀突起前體蛋白質芯片制備島狀突起蛋白質芯片1)80∶2∶1的比例將體外轉錄翻譯系統、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)用芯片合成儀將上一步制成的混合物點在步驟二制備的前體芯片上的島狀突起上(大約0.3納升)；或者，將該前體芯片表面置于步驟三1)制成的混合物中，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內，于30℃在搖床上培養1到3小時，從而制得島狀突起蛋白質芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質芯片共三到五次。制得的島狀突起蛋白質芯片可立即使用，也可儲存于4℃冰箱中待用如步驟三所述，在具有親合性的單分子膜的芯片表面可一步完成從前體蛋白質芯片到蛋白質芯片的三步反應，即從DNA模板到mRNA的基因轉錄反應，從mRNA模板到蛋白質的基因翻譯反應，從合成的處于游離狀態的蛋白質通過其上連接的親和標記特異結合親和層上的親和小分子而固定到芯片表面的過程。整個反應可在30℃保濕的條件下溫育幾小時，最后經洗滌完成蛋白質芯片的制備。
實施例2在高密度微孔基片上制備蛋白質芯片步驟一芯片表面的處理和活化1)用水將高密度微孔玻璃基片(腔體是直徑為7微米的圓孔)沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)將玻璃基片置于0.2M的NaOH溶液中浸泡過夜，然后用高純水清洗3遍，再用無水乙醇沖洗一遍。
3)將清洗后的玻璃基片置于含有(CH3O)3-Si-(CH2)20-生物素的溶液中，在室溫反應三小時以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗上述3)得到的基片三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備高密度微孔前體蛋白質芯片與實施例1中步驟二完全相同。
步驟三從高密度微孔前體蛋白質芯片制備高密度微孔蛋白質芯片1)20∶8∶1的比例將體外轉錄翻譯系統、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)用芯片合成儀將第一步制成的混合物分裝于實施例5中的高密度微孔前體芯片上的微孔內(大約每孔0.3納升)；或者，將高密度微孔前體芯片表面置于第一步制成的混合物中，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去微孔中的氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內，于30攝氏度在搖床上培養1到3小時，從而高密度微孔突起蛋白質芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白質芯片可立即使用，也可儲存于4℃冰箱中待用。
實施例3在平滑基片上制備蛋白質芯片步驟一芯片表面的處理和活化1)用水將平滑形石英基片沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)石英基片置于0.2M的HCl溶液中浸泡過夜，然后用高純水清洗3遍，再用無水乙醇沖洗一遍。
3)將清洗后的石英基片置于含有(CH3O)-Si-(CH2)22-谷胱甘肽的溶液中，在室溫反應三小時以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗上述3)的基片共三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備高密度平滑前體蛋白質芯片與實施例1中步驟二完全相同。
步驟三從高密度平滑前體蛋白質芯片制備高密度平滑蛋白質芯片1)80∶5∶1的比例將體外轉錄翻譯系統、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)將高密度平滑前體芯片表面置于第一步制成的混合物中，覆蓋玻片，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內，于30攝氏度在搖床上培養1到3小時，從而高密度微孔突起蛋白質芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白質芯片可立即使用，也可儲存于4℃冰箱中待用。
實施例4在毛細微孔基片上制備蛋白質芯片步驟一芯片表面的處理和活化1)用水將毛細微孔形的二甲基硅烷基片(腔體是直徑為2納米的圓孔)沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)在真空蒸發臺內將待鍍的二甲基硅烷基片置于樣品臺上，把待鍍金屬銅置于蒸發舟內，在銅的熔點下于10-2Pa將銅鍍于石墨基片的表面。
3)鍍好銅的二甲基硅烷基片置于含有HS-(CH2)22-抗生物素蛋白的溶液中，在室溫反應三小時以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上基片三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備高密度平滑前體蛋白質芯片與實施例1中步驟二完全相同。
步驟三從高密度平滑前體蛋白質芯片制備高密度平滑蛋白質芯片1)100∶10∶1的比例將體外轉錄翻譯系統、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)高密度平滑前體芯片表面置于第一步制成的混合物中，覆蓋玻片，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內，于30攝氏度在搖床上培養1到3小時，從而高密度微孔突起蛋白質芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白質芯片可立即使用，也可儲存于4℃冰箱中待用。
實施例5基因模板的制備1)取10克活體組織用液氮研碎，迅速加入20毫升RNA抽提液，于冰上保溫30分鐘。
2)按Promega公司的mRNA抽提試劑盒的說明操作，可得到大約5微克mRNA。
3)將上述所得mRNA稀釋至2納克/微升，再取1微升作為RT-PCR反應模板，加入預先混好的45微升RT-PCR反應混合物中，再加入4ul基因特異引物，置于PCR反應儀中進行反應。
4)取5微升體積反應產物用作凝膠檢測，剩余DNA可用標準的PEG沉淀法或硫酸銨沉淀法除去未反應的引物，并根據凝膠檢測結果將擴增的DNA產物以0.1微克/微升重新溶于3xSSC緩沖液中。
5)將PCR產物分裝于384孔板中，并儲存于-80℃冰箱內待用。
實施例6蛋白質芯片用于藥物靶蛋白的發現1)將新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)將帶有生物素標記的人工合成的化合物納巴霉素(Rapamycin)用磷酸鹽緩沖液稀釋，取120微升化合物稀釋液加于蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標記的鏈霉抗生物素(Streptavidin)溶液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
6)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
7)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
8)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。
9)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與藥物小分子結合的蛋白質可在掃描圖上顯示熒光亮點。這些蛋白質的名稱可于數據庫中查得，例如，發現了與啤酒酵母中蛋白質Frp1具有高度同源性的人類的未知功能的蛋白質。
實施例7蛋白質芯片用于新藥發現1)新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)將帶有生物素標記的人工合成的化合物文庫用磷酸鹽緩沖液稀釋，取120微升化合物稀釋液加于蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
3)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
4)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標記的Streptavidin溶液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
5)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
6)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以確定哪些蛋白質可與藥物分子結合。
8)從新選用步驟7中的可與藥物分子結合的蛋白質制備微孔蛋白質芯片，重復上述實驗步驟，然后將反應后的芯片置于高效質譜儀中逐一鑒定與蛋白質結合的藥物分子的結構，達到新藥發現的目的。
實施例8蛋白質芯片用于確認藥物的副作用1)新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)將帶有熒光標記的藥物小分子用磷酸鹽緩沖液稀釋，取120微升稀釋液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
6)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。
7)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與藥物小分子結合的蛋白質可在掃描圖上顯示熒光亮點。這些蛋白質的身份可于數據庫中查得。
8)通過分析數據，立刻可以確認除了預期與該藥物結合的蛋白質外，還有其它哪些蛋白質可以與該藥物結合，這些附加蛋白質即構成該藥物的副作用譜。通過分析這些附加蛋白質的功能，可更加深入地了解該藥物的副作用的機理。
實施例9蛋白質芯片用于識別新的生物標記
1)新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)分別用Cy-3熒光標記和Cy-5熒光標記分別標記從癌組織和正常組織提取的蛋白質，在除去多余的熒光標記后，混合并用磷酸鹽緩沖液稀釋蛋白質混合物，取120微升混合物稀釋液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。
6)用激光芯片掃描儀在兩個頻率下掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與癌組織中的蛋白質結合的芯片上的蛋白質可在掃描圖上顯示綠色熒光亮點；能與正常組織中的蛋白質結合的芯片上的蛋白質可在掃描圖上顯示紅色熒光亮點。這些蛋白質的身份可于數據庫中查得。
7)通過比較芯片上各個蛋白質點所顯示的紅綠色的比率，可確定能特異識別癌組織中超常表達的蛋白質或其它生物大分子的蛋白，這些蛋白質即可作為早期癌癥臨床診斷的生物標記。
實施例10蛋白質芯片用于傳染病的臨床診斷(以肝炎檢測為例)1)新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。該蛋白質芯片上載有可以識別甲、乙、丙、丁、戊肝炎抗原的12種抗體。每個蛋白質芯片分為30個區，可同時測試20個病人和陰性、陽性對照。
2)取20個病人和一個健康人的血樣各0.5ml，于3000轉離心5分鐘，取出血清500vl，并用磷酸鹽緩沖液稀。取120微升混合物稀釋液分別加到蛋白質芯片表面的各個區域內，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。將芯片沒入磷酸鹽緩沖液稀釋好的帶有Cy3熒光標記的抗人IgG的山羊抗體的緩沖液中，室溫溫育一小時。
6)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。
8)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，通過鑒定病人血清在蛋白質芯片上呈現的陽性類別，可確定病人感染的肝炎病毒的類型，從而達到診斷的目的。
實施例11蛋白質芯片用于確認過敏病人血清中與過敏相關的抗體1)鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。該蛋白質芯片上載有30種已知的過敏原(allergen)。每個蛋白質芯片分為30個區，可同時測試20個病人和陰性、陽性對照。
2)取20個病人和一個健康人的血樣各0.5ml，于3000轉離心5分鐘，取出血清500vl，并用磷酸鹽緩沖液稀。取120微升混合物稀釋液分別加到蛋白質芯片表面的各個區域內，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。將芯片沒入磷酸鹽緩沖液稀釋好的帶有Cy3熒光標記的抗人IgE的山羊抗體的緩沖液中，室溫溫育一小時。
6)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。
8)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，通過鑒定病人血清在蛋白質芯片上呈現的陽性類別，可確定導致病人產生過敏的類型，從而達到診斷的目的。
實施例12蛋白質芯片用于確認酶的底物(以磷酸激酶為例)1)制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。該蛋白質芯片上載有1000種人類的蛋白質。
2)取純化的人的磷酸激酶(CD2)蛋白用磷酸鹽緩沖液稀至1納克/微升。取120微升混合物稀釋液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于30度下溫育半小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。將芯片沒入磷酸鹽緩沖液稀釋好的帶有Cy3熒光標記的抗磷酸化酪氨酸的山羊抗體的緩沖液中，室溫溫育一小時。
6)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。
8)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，芯片上那些呈陽性的蛋白質即該磷酸激酶(CD2)的底物。
實施例13蛋白質芯片用于篩選特異性抗體(以白介素-1為例)1)選擇噬菌體呈現載體克隆人工重組片段，以獲得108的噬菌體呈現載體文庫。將文庫分成均一的104份，然后用PCR擴增DNA模板，最后用點樣儀制備前體蛋白質芯片。
2)采用實施例2闡述的方法制備蛋白質芯片。
3)新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
4)用生物素標記試劑盒標記白介素-1，在除去未反應的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標記好的蛋白。
5)取120微升標記好的蛋白加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
6)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
7)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
8)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與標記蛋白結合的人工抗體群可在掃描圖上顯示熒光亮點。
9)重復步驟1至步驟8，可進一步確定特異的抗白介素-1人工抗體。
實施例14蛋白質芯片用于研究蛋白質-蛋白質間的相互作用10)新鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
11)用生物素標記試劑盒標記待研究的蛋白質，在除去未反應的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標記好的蛋白。
12)取120微升標記好的蛋白加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
13)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
14)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
15)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標記的Streptavidin溶液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
16)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
17)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
18)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與標記蛋白結合的蛋白質可在掃描圖上顯示熒光亮點。這些蛋白質的名稱可于數據庫中查得。
實施例15蛋白質芯片用于研究蛋白質-DNA間的相互作用1)鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)用生物素標記試劑盒標記待研究的DNA分子，在除去未反應的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標記好的DNA。
3)取120微升標記好的DNA加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
4)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
5)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
6)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標記的Streptavidin溶液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
7)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
8)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
9)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與標記DNA結合的蛋白質可在掃描圖上顯示熒光亮點。這些蛋白質的名稱可于數據庫中查得。
實施例16蛋白質芯片用于研究蛋白質-生物大分子間的相互作用的結合和解離常數1)鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)蛋白質芯片置于SPR儀中，取120微升螢光標記好的生物大分子加到蛋白質芯片表面，同時用SPR儀觀測生物大分子與芯片上固定的蛋白質之間的結合曲線。
3)待反應完成后，用含去污劑的清洗緩沖液洗脫結合在芯片上蛋白質的生物大分子，同時用SPR儀觀測生物大分子與芯片上固定的蛋白質之間的解離曲線。
4)通過數據分析，可大規模、高效測定各個生物大分子與芯片上固定的蛋白質之間的結合和解離常數。
實施例17蛋白質芯片用于研究蛋白質-脂類分子間的相互作用1)鮮制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)取120微升熒光標記好的脂類分子加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
4)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與標記多糖結合的蛋白質可在掃描圖上顯示熒光亮點。這些蛋白質的名稱可于數據庫中查得。
實施例18蛋白質芯片用于研究蛋白質-多糖間的相互作用1)制備的蛋白質芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)生物素標記試劑盒標記待研究的多糖，在除去未反應的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標記好的蛋白。
3)取120微升標記好的多糖加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
4)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
5)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
6)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標記的Streptavidin溶液加到蛋白質芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
7)蛋白質芯片置于保濕的環境中于室溫下溫育一小時。
8)將整個蓋玻片覆蓋的蛋白質芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個蛋白質芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
蛋白質芯片用離心機在3000轉的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質芯片以獲取數據，能與標記多糖結合的蛋白質可在掃描圖上顯示熒光亮點。這些蛋白質的名稱可于數據庫中查得。
權利要求
1.一種蛋白質芯片，包括基片，基片上的親和層，以及親和層上的生物大分子層，其特征在于所述的生物大分子層為編碼基因片段，或編碼基因片段的產物膜層。
2.按權利要求1所述的蛋白質芯片，其特征在于所述的基片包括玻璃、石英或表面鍍膜的固體復合材料。
3.按權利要求2所述的蛋白質芯片，其特征在于所述的表面鍍膜的固體復合材料包括鍍金屬膜的陶瓷、塑料、石墨或聚合硅烷。
4.按權利要求1或2或3所述的蛋白質芯片，其特征在于所述的基片是平滑形、具有毛細微孔形或島狀突起形。
5.按權利要求1所述的蛋白質芯片，其特征在于所述的親和層是結合生物素、抗生物素蛋白、抗體變異區、聚丙烯酰胺膠、瓊脂糖凝膠或螯合劑作為親和分子的單分子膜層。
6.一種權利要求1所述蛋白質芯片的制備方法，包括如下步驟(1)基片表面的處理和活化清潔固體基片，并將基片表面進行活化使其共價連接親和層的單分子膜；(2)生物大分子層的制備將基因擴增產物加到上述步驟(1)得到的結合有親和層的基片上，制得生物大分子層為編碼基因片段的蛋白質芯片。
7.按權利要求6所述的蛋白質芯片的制備方法，其特征在于還包括步驟(3)基因擴增產物的翻譯過程1)按體積比(20～200)∶(1～10)∶1將體外轉錄翻譯反應液，100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合；2)將權利要求10制得的蛋白質芯片浸沒于上述步驟1)制成的混合液中，30℃溫育1到3小時，實現從編碼基因片段到蛋白質的生化反應，并同時完成從游離蛋白質到表面固定蛋白質的轉化；3)用緩沖液清洗步驟2)得到的蛋白質芯片，制得的蛋白質芯片即可使用或冷藏待用。
8.按權利要求6所述的蛋白質芯片，其特征在于編碼基因片段的產物膜層為人工隨機片段、短肽、蛋白質或抗體。
9.按權利要求6所述的蛋白質芯片，其特征在于編碼基因片段是RNA或DNA。
10.按權利要求6所述的蛋白質芯片的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)中將基片進行活化包括將玻璃或石英基片表面用酸或堿處理或鍍膜。
11.按權利要求7所述的蛋白質制備方法，其特征在于所述的步驟2)中將蛋白質芯片浸沒于步驟1)制成的混合液之后還包括用震蕩或超聲波清洗儀除去芯片表面的氣泡。
12.一種權利要求1所述的蛋白質芯片在篩選藥物靶蛋白、篩選新藥、蛋白質組研究、分析藥物副作用和臨床診斷中的應用。
13.按權利要求12所述的蛋白質芯片在臨床診斷中的應用包括為傳染病的臨床診斷、人心血管病、癌癥早期診斷或過敏病人血清中與過敏相關的抗體的確認。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白質芯片及其制備方法和應用。該發明包括以全新的概念制成可商品化的、高密度的、由基片層、特異親合層和生物大分子層構成蛋白質芯片，其蛋白質點陣密度每10平方厘米內可達1000－100000個蛋白質、抗體或人工短肽點。該發明還涉及用芯片制備儀形成高密度可進行原位基因轉錄和翻譯的基因轉錄片段的前體蛋白質芯片，然后用無細胞蛋白質表達系統在前體蛋白質芯片上一步制備高密度蛋白質芯片的方法。該發明解決了現有蛋白質芯片技術中費用高昂、周期長、步驟繁冗以及不易保存和運輸的難題，極大促進了蛋白質芯片技術的實用化和商品化。該發明在臨床診斷、醫學研究、新藥開發和檢驗、蛋白質組研究等領域內具有廣泛的用途。
文檔編號G01N33/50GK1512176SQ0215976
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優先權日2002年12月30日
發明者陳正豪, 朱衡 申請人:陳正豪