分類學鑒定病源微生物及其毒性蛋白的制作方法

專利名稱：分類學鑒定病源微生物及其毒性蛋白的制作方法
背景技術：
本發明涉及一種分類學鑒定病源微生物并檢測其蛋白毒素的方法。
病源微生物，尤其是能夠自然產生或獲得毒性因子的病源細菌，是導致很多人類疫情疾病的原因。很多這種細菌可被用作生物戰爭試劑(biowarfare agent)。而且，非病源微生物經過遺傳操作處理后有變為病源體的危險和可能。(例如，帶有霍亂毒素的大腸桿菌)典型的病源細菌包括那些導致肉毒中毒、黑死病、霍亂、白喉、痢疾、麻風病、腦膜炎、猩紅熱、梅毒和結核等很多疾病的細菌。最近幾十年來，在工業化國家公眾對這些疾病感覺淡漠，可能主要是因為使用抗生素治療這些疾病取得很大的成功。然而，這些細菌正令人擔憂的變得耐受抗生素。而且，最近關于細菌在人類疾病中的作用也有新的發現，如，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是胃潰瘍的引發物，洋蔥伯克氏菌(Burkholderia cepacia)是一種新的肺病源體，而肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)是冠心病的一種可能的誘因。除去那些病源體，世界范圍內細菌感染食品的增加也同樣導致了很多社會經濟變化，這些細菌有大腸桿菌，沙門氏菌，弧菌和空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)等。
在醫療戰線，潛在的感染也是重要的考慮。一些細菌病源體，包括炭疽芽孢桿菌(Bacillis anthracis)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)和它們的外毒素被用作武器。而且總是存在非病源微生物被工程改造為病源性的，并用于生物戰爭試劑的危險。
病源微生物對家畜、家禽產業及野生動植物管理也值得重視。例如，流產布魯氏菌(Brucella abortus)導致牛流產。有時鳥、魚、獸群的死亡可能是因為水源污染了產生外毒素的微生物。近來查出瘋牛病是經口傳染的一種不能被過濾出來的蛋白顆粒引起的。因此，顯然需要一種快速而且便宜的技術來現場化驗導致動物及人類疫情的毒性蛋白和病源微生物。
作為常規建議，用普通光學顯微鏡檢測細菌感染。然而這種技術只有有限的分類學價值，對大于微米的區域進行研究和定量就比較困難并且費時。許多以商品形式出售的系統靠細菌培養來得到足夠大的樣品(培養生成物)，然后運用不同的代謝測試進行種屬鑒定。但是，需要細菌培養物的技術可能檢測不到存活卻不能被培養的細胞。相反，所用的培養基可能只利于某些特異表型的細菌的生長。
在“加速運用基因擴增操作流程對肉和肉制品進行病源體檢查的策略”(Strategies to Accelerate the Application of Gene AmplificationProtocols for Pathogen Detection in Meat and Meat Products)(byS.Pillai and S.C.Ricke(Crit.Rev.Microbiol.21(4)，239-261(1995)))和“環境監測微生物的分子方法(Moleculer Approaches forEnvironmental Monitoring of Microorganism)”(by R.M.Atlas，G.Sayler，R.S.Burlage and A.K.Bej(Biotechniques 12(5)，706-717(1992)))中介紹了更靈敏、更快速的分類方法。那些方法使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增細菌DNA或RNA，然后核酸測序來檢測是否存在某種細菌。這樣常規的擴增和測序要求專門的技術而且不容易適應實驗室專門條件以外的環境。基于PCR的技術利用了微生物存在的推論，因為這些技術通過檢查完整的核酸序列，而不需要微生物本身，僅僅提供陽性分析。PCR也不能檢測到是否存在微生物的毒性蛋白。而且，從環境樣品中檢測某種微生物會因為在“臟的”樣品中有干擾有效擴增目標DNA的其他物質而變得十分困難。
在樣品裂解或高溫裂解之后用質譜分析不穩定的細胞成分(如，脂肪酸)來檢測細菌和病毒的存在。“Characterization of Microorganismsand Biomarker Development from Global ESIMS/MS analyses of CellLysates”by F.Xiang，G.A.Anderson，T.D.Veenstra，M.S.Lipton andR.D.Smith(Anal.Chem.72(11)，2475-2481(2000))記述了用這種方法檢測微生物。可是，當微生物的不穩定成分隨環境生長條件改變而變化以后，對分析物的鑒定就不可靠了。
另一種方法利用“The Use of Immunological Methods to Detectand Identify Bacteria in the Environment”by M.Schlotter，B.Assmusand A.Hartmann(Biotech.Adv.13，75-80(1995))中記述的免疫化學捕捉，然后再光學檢出被捕捉的細胞。最常用的免疫化驗方法，酶聯免疫吸附化驗(ELISA)，有一個幾百細胞的檢出限。正好低于幾種極具感染性的細菌，如弗氏志賀氏菌Shigella flexneri的ID50。如“Development of aPiezoelectric Immunosensor for the Detection of Salmonellatyphimurium”by E.Prusak-Sochaczewski and J.H.Luong(EnzymeMicrob.Technol.12173-177(1990))中所介紹的壓電(Piezoelectric)檢出技術，更不靈敏，檢出限大約5×105細胞。一個近期的報道“BiosensorBased on Force Microscope Technology”by D.R.Baselt，G.U.Lee andR.J.Colton(Biosens.& Bioelectron.13，731-739(1998))介紹使用原子力顯微鏡(AFM)檢測免疫捕捉的細胞；但是這種方法不適用于實驗室之外，及樣品量較大的情況。
免疫公驗目前也用于肽和蛋白的痕量分析。
而且，現有技術在捕捉肽/蛋白/微生物的時候都需要廣泛使用已固定位置的抗體。那些類似的技術都有因為所用抗體對pH、離子強度、溫度的變化非常敏感而產生的重要問題。抗體還很容易被“臟的”樣品中含有的蛋白水解酶的宿主降解。另外，支持于(如，小孔盤或磁珠)表面的抗體分子密度總是不及常需水平。“Microbial Detection”byN.Hobson，I.Tothill and A.Turner(Biosens.& Bioelectron.11，455-477(1996))中對本領域最新的當前技術狀況做了很好的總結。
醫療和軍用要求更好的毒素及病源體的檢測技術。通過遠程感受裝置時時評定戰場感染程度可以允許和便于快速診斷來決定對策。適于這種情況的微生物/毒蛋白感受器要能夠廣泛區別病源體和非病源體。而且，這種技術要求有很高的靈敏度，可以檢出少于100個的細胞，并且實地的分析工作應能在15分鐘以內完成。這種技術應該能夠識別病源體，并對菌株的毒性或產毒性作出一定的評估。
當前，用于鑒別病源微生物及其蛋白毒素的普通方法都運用免疫學的方法學。免疫學方法的缺點是抗體對pH、離子強度、溫度的敏感性；抗體自身容易被水解，要求苛刻的儲存條件。為了克服這些問題，本發明記述使用非抗體配體捕捉微生物及其蛋白毒素的方法。相應的，本發明的一個目的就是為克服前述依賴抗體的技術的缺點，提供一種分類學評價微生物和蛋白的方法。
本發明更為具體的目的是提供一種分類學評價微生物和蛋白的方法，能夠區分確定的微生物種，病源與非病源體，并能類似的用于鑒定有診斷效用的微生物蛋白質。發明簡述本發明說明血紅素復合物(heme compounds)、鐵載體、多糖和肽能夠和病源微生物及其蛋白毒素結合；通過分析某種微生物所結合的配體的數量和種類實現對該微生物的分類學鑒定。開發這種方法是為了克服前述抗體依賴技術的局限性。本發明的概念在于一種通過微生物受體與特異的配體結合來捕獲微生物的微生物分類學鑒定方法。用系于表面或綴合標記的配體接觸含有微生物的樣品。通過洗滌、磁性分離或色譜法，將目標微生物(細菌、病毒、真菌、原生動物、立克次氏體或其他細胞)或者蛋白物質(毒素)同非結合的樣品成分及未結合的配體分離開來。最后，通過合適的方法檢測目標或標記的內源信號，判斷配體是否與目標結合，而完成對樣品的檢查。
電磁輻射是一種根據本發明，用檢測活的微生物的特征性代謝物的存在來檢測所捕獲微生物或/和毒素存在與否的方法。這些代謝物有，例如，還原性的嘧啶核苷酸或其他熒光性代謝物，或其他生物分子如，蛋白中較顯著的色氨酸或酪氨酸，或結合的染料等。例如，如果配體含有熒光染料，洗滌后樣品就會發熒光，因為配體跟細胞結合而多余的成分已被洗掉。其他標記，包括發冷光的，發磷光的，放射性的和/或能夠比色的化合物，都可以結合在配體上，以類似的方式用于鑒定微生物和/或蛋白毒素。
美國專利第5760406號和第5968766號中介紹了一種檢測所捕獲的微生物或毒蛋白的具體方法。其中例如，以上述方式用含有分析物的溶液處理綴合有配體的基質后，對其表面進行電磁輻射。這種檢測方法可用于判定分析物是否被結合上了。其他檢測方法，如果適合于某種綴合于配體的標記，也可以用于判定配體是否特異性地與某種微生物或毒蛋白發生結合了。前面提到的一個例子中，應用與偶聯配體綴合的熒光染料，在步驟(1)配體與微生物接觸和(2)洗掉多余的綴合有染料的配體之后，通過染料特征性的熒光來檢測微生物。應該注意，如果使用光學方法檢測捕獲的微生物或蛋白，配體與底物的聯系不應該是光易裂解的。
因此，本發明的方法不依賴經典的抗原-抗體識別。相反，本發明的概念是利用相對不貴的試劑，捕捉樣品中所含微生物和微生物蛋白。
在本發明的一個實施方案中，使用傳感芯片(sensor chips)(或珠)。這些芯片應該由適合的支持材料，如玻璃或塑料基質(如，聚(丙稀)或聚(乙酸乙烯酯))制得，而且材料必須同將接頭和配體綴合于其表面的化學反應及所用的檢測方法相容。傳感芯片制成為，其表面上有很多不同部分并且這些部分排布成某種模式的陣列(array)。每個部分結合不同的配體，該配體能夠分子識別確定的微生物蛋白或微生物受體，并由此識別微生物本身。微生物受體包括例如微生物暴露于細胞周圍液體環境的細胞外膜，纖毛或鞭毛等中存在的蛋白質。結合在傳感芯片表面的用于捕捉病源體/蛋白的配體能夠并且應該可以改變。一般來說，這樣的配體可表片為能夠捕捉廣泛種類的微生物和毒蛋白的血紅素復合物、鐵載體、多糖和抗粘附肽(anti-adhesion peptide)等。這些配體可以通過適合大小的，也能與配體反應的交聯劑固定或鍵合至傳感芯片表面，由此該偶聯劑在傳感芯片表面和能與大量不同的微生物及蛋白反應的配體之間建立化學聯系。傳感芯片和陣列(1)暴露于含有微生物或毒蛋白的溶液，(2)去掉溶液中非結合的成分，(3)然后檢查聯有配體的表面，來檢測分析物的結合情況。通過分析聯有配體的表面在結合有捕獲的微生物，或完整微生物細胞所不具有的微生物蛋白之后出現的類型或模式，就能夠分類學鑒定微生物或其毒蛋白。
這樣，本發明可以用于快速的微生物鑒定，而不需要先進行微生物培養，后再顯微鏡檢所得培養物。同樣，可以類似地鑒定較低水平的毒性微生物蛋白。而且不必像本領域其他方法那樣需要用到酶或抗體。閱讀下面詳述的實施方案和所附的權利要求，就會更明白本發明的上述和其他目的、特征和優勢。
圖二顯示，在表面被有所系血紅素的顯微鏡玻璃載片上捕獲的稀釋于多種濃度枯草芽孢桿菌(Bacillus globigii)中的產氣桿菌(Enterobactor aerogenes)。用授予Powers的美國專利第5968766號所述方法和設備檢測這種病源微生物。發明詳述圖一所示，按照本發明所述方法，用所系血紅素捕獲病源微生物(鼠傷寒沙門氏菌)。(用授予Powers的美國專利第5968766號所述方法和設備檢測這種病源微生物。雖然可以使用多種適合的細菌檢測方法，而在此應用這種方法是因為它能夠在載片上檢出這樣少量的細菌。)從圖示可以看出，用所系血紅素捕獲微生物的檢出限(＜100個細胞)低于免疫學的方法(最佳條件時，約400個細胞)。微生物和血紅素配體間的結合不像和抗體的結合那樣對pH，離子強度和溫度敏感。血紅素配體也比較不貴，要求的存儲條件比較不苛刻，而且不像抗體那樣容易發生蛋白水解。
圖二所示，用所系血紅素捕獲，以相同濃度稀釋在非病源微生物(枯草芽孢桿菌)溶液中的病源微生物產氣桿菌。此圖顯示，被有所系血紅素的載片可以有效地從溶液中捕獲病源微生物，即使非病源體與病源體的比例是107∶1。用授予Powers的美國專利第5968766號所述方法和設備檢測這種病源微生物。
在本發明的一個實施方案中，首先用配體接觸含有未知被分析微生物或蛋白毒素的樣品。配體系于芯片或珠子的表面上。結合效率跟系鏈(tether)的長度有關。發現系鏈長約40埃()時，微生物與配體的結合效率最高。針對微生物的配體通過至少15埃的系鏈共價聯接于基質表面；針對蛋白毒素的配體至少長6埃。然后，將分析物與非結合的樣品物理分離。通過簡單清洗芯片或珠子的表面，分離由表面所系配體捕獲的分析物與樣品中非結合成分。然后檢查基質表面來判定是否發生了分析物同配體的結合。可以用以下方式檢測基質表面結合的微生物顯微鏡檢術、固有熒光、結合染料熒光、放射性、冷光、磷光和/或光吸收。通過鑒定配體來鑒定微生物或蛋白。應該注意到所用系鏈不應容易發生光照裂解或對清洗系有配體的表面時用的溶液化學不穩定。
在本發明的一個實施方案中，首先用傳感芯片接觸含有未知被分析微生物或蛋白毒素的樣品。傳感芯片由玻璃等基質構成，其表面有一系列部分。每個部分聯有一個不同的配體，可以結合特定的分析物。配體可通過結合來捕獲分析物，然后使用如美國專利第5760406號和5968766號中公布并要求保護的熒光檢查系統，通過蛋白毒素的固有熒光檢出被捕獲的分析物存在與否。這樣，傳感芯片的每個部分的配體能夠捕獲特定的微生物細胞或微生物蛋白。所用芯片可以保存或者用來培養捕獲的微生物。
在本發明的另一個實施方案中，首先用聯有包括但不限于熒光染料等標志的配體接觸含有未知分析物(微生物、蛋白毒素或其他蛋白)的樣品。將結合配體的分析物與非結合的樣品成分及多余的配體分離開；可以通過離心(對細胞)，磁性沉淀或色譜法(對蛋白)進行分離。通過檢測標記(如，上例中所綴合的染料的熒光)，來檢測分析物和配體的結合，而由此分類學鑒定分析物。
在本發明的另一個實施方案中，首先用以上文所述適合長度的接頭系于基質表面的配體接觸含有未知分析物(微生物或蛋白)的樣品。物理分離并洗掉溶液中非結合成分。正如本領域技術人員將理解的，用反應性標記處理捕獲的微生物或蛋白，前提是所用標記不能同基質表面或配體發生反應。檢測聯有接觸了分析物的配體的表面區域上的標記，可指示特定的分析物存在與否。
在本發明的一個優選實施方案中，本發明所用配體可以選自血紅素復合物、鐵載體、多糖(包括寡糖)和肽。
如本領域技術人員所知，動物病源體一般有吸受血紅素的能力，因此血紅素復合物可用于捕獲許多種類的病源體。除血紅素復合物，其他形式為對鐵有高親和性的螯合劑的配體，一般稱作鐵載體，也可用于捕獲許多種的病源細菌。這樣的鐵載體包括有產堿桿菌素(alcaligin)、分枝菌素類、綠膿桿菌螯鐵蛋白、葡萄球菌肝褐素(staphyloferrin)、弧菌素(vibriobactins)和耶爾森氏菌素(yersiniabactins)。
上文所述，且如本領域技術人員所知，通過與標有標記的血紅素復合物或鐵載體的結合，可以區別動物病源體。例如，用聯有熒光性、發光性、磷光性，化學發光性或放射性化合物的鐵載體或血紅素復合物培養含細菌的溶液。清洗細胞之后，可以通過熒光、比色或放射檢測等技術檢測動物病源體。還可以利用系于支持物表面的鐵載體或血紅素復合物結合動物病源體來將這些微生物從環境樣品，如水中分離出來，實現富集或純化的目的。
在本發明的操作中，除鐵載體或血紅素復合物以外，真核生物表面被微生物細胞受體識別的表位(肽或碳水化合物)，也可以類似地用作配體。這些配體包括天然的和可以化學合成產生的寡糖和多糖。K.A.Karlsson在“Microbial Recognition of Target CellGlycoconjugates”(Structural Biology 5622-635(1995))中介紹了其他寡糖及其與病源體的親和性。
表1列舉了許多病源細菌的性質，包括每種菌引發的疾病和它們對鐵載體、寡糖和血紅素復合物的結合性質。這些性質可以用于對這些種類細菌的捕獲和鑒定。
通過親和篩選寡肽庫可以確定典型的肽配體，然后可以化學合成得到。鐵載體配體可以通過化學合成生產或者從用過的微生物培養基中分離得到。寡糖配體可以化學合成或者從真核組織中分離得到。血紅素復合物可以典型地用原卟啉IX作起始試劑而化學合成得到。
表1 細菌結合鐵載體、寡糖和血紅素的性質
每分子中含有至少一個色氨酸或少量酪氨酸的毒素，在被所系肽捕獲以后，可以通過色氨酸/酪氨酸熒光被檢出。多種微生物，包括藻類、真菌和細菌，分泌可用這種技術檢測的外毒素。
表2包含(1)可由本文所述技術捕獲的，和(2)最終通過其固有熒光被檢出的毒素和細菌蛋白實例。應該注意，對于代表表2中最不有利情況(因為只存在一個色氨酸和22個酪氨酸)的金黃色葡萄球菌腸菌素B，接著還研究了其單個色氨酸殘基的熒光在B.R.Singh，M.L.Evenson和M.S.Bergdahl的“對金黃色葡萄球菌腸菌素B和C1用循環二向色性和熒光光譜進行結構分析”(“Structural Analysis ofStaphylococcal Enterotoxins B and C1 Using Cirular Dichroism andFluorescence Spectroscopy”(Biochemistry 278735-8741(1988)))。如本領域技術人員所熟知的，檢測色氨酸/酪氨酸熒光(標化為散射的激發信號)，足以指示在傳感芯片某個部分的表面上孢子、不能生活的細胞、營養生長的細菌或真菌的活細胞、病毒或微生物病毒的存在。(也即，結合于配體)。
表2 細菌毒素選例的氨基酸計數
如上所述，在傳感芯片的每個部分聯接不同的配體。然后用傳感芯片接觸含有未知微生物或蛋白的樣品，芯片表面特定的配體結合特定的分析物，選擇性地將其捕獲。然后用適合的溶液(如磷酸-緩沖鹽溶液)將未結合的分析物洗掉；并以適合的技術檢測傳感芯片。美國專利第5706406號和第5968766中公布了一種可以用來檢測傳感芯片表面是否存在細菌的技術，其中所述設備利用適合波長的電磁輻射激發出存在結合的分析物時所特有的熒光。
如本領域技術人員所熟知，如果用于捕捉分析物的所系配體具有固有熒光，那么在結合分析物之后其熒光可能改變。(這種熒光的改變可能表現為強度變化或者特征熒光能量的移動。)所系配體熒光的變化可進一步證實分析物的檢測。
在本發明中，含有未知微生物的樣品接觸傳感芯片，細菌的一種或多種受體同系于芯片多個部分的不同配體反應。然后，可以用探測器測量芯片的熒光，來檢測傳感芯片的哪些部分結合有分析物。例如，可以用分枝桿菌鐵載體捕捉分枝桿菌，如結核分枝桿菌。用所系的N乙酰neuro aminyl-α-2，3-乳糖捕捉幽門螺桿菌。肽GADRSYLSFIHLYPELAGAGGGC可以通過末端的半胱氨酸被聯接來快速捕捉游離的金黃色葡萄球菌中毒性休克毒素-1。肽GHHKHHHGGGC也可以通過末端的半胱氨酸聯接來特異性的捕捉金黃色葡萄球菌暴露于表面的蛋白質A，并由此捕捉到金黃色葡萄球菌。A.Sato等在“從噬菌體展示文庫中確定結合毒性休克癥狀毒素-1并抑止其結合主要組織相容性復合物(MHC)II類分子的肽”(Identification from a Phage DisplayLibrary of Peptides that Bind to Toxic Shock Syndrome Toxin-1 andInhibit Its Binding to Major Histocompatibility Complex(MHC)ClassII Molecules)(Biochemistry 35，10441-10447(1996))中介紹了金黃色葡萄球菌中毒性休克綜合征毒素-1的結合肽。
如上所指，可以通過確定某一種捕獲的微生物或分散的微生物蛋白鑒定一些所關注的分析物。然而其他情況中，一系列的兩種或更多捕獲的目的分析物可用于確定某一種分析物。例如，某傳感芯片的一個區域在水平和垂直軸各有3部分，如下圖
此例中，按照下表的方式將下述配體聯接于特定的部分
發現當檢測出A1，A2，A3，B1和C3部分的分析物時可以確定該微生物是銅綠假單胞菌。類似的，當A2，B1，B3，C1，C2和C3部分中含有捕獲的分析物時，可以確定是金黃色葡萄球菌。這種情況下，在C1部分捕獲分析物就足夠進行分類學鑒定。A2，B1，B3，C2和C3部分對細胞的捕獲進一步證實了結果。將捕捉某種給定分析物的多種配體整合到一個傳感芯片上，事實上，允許對單一樣品進行多個獨立的分析。這就增加了分析結果的統計可靠性。
將多種配體聯接到基質上時，優選使用本領域技術人員所熟悉的有機偶聯劑。以表面有化學氧化所致暴露羥基的玻璃或塑料基質作傳感芯片，在本發明的實施中，通常優選使用具有如下一般結構的有機硅烷化合物 其中，R1到R4勻選自基團氫、含1到6個碳原子的烷基，含6到12碳的的芳基和含1到4碳原子的烷氧基，且R1，R2和R3中至少有一個是烷氧基。R4是含至少3個碳原子并含有帶有能與配體反應的官能團的長接頭。不限制本發明，適合的帶接頭的有機基團包括胺、聚醚和多聚(甘氨酸)。偶聯劑含有其他如環氧基、氨基和不飽和官能團，羥基，巰基及類似的能與多種配體反應的官能團時，也可用于本發明的實施。有關理論，不限制本發明，認為配體與有機硅烷的官能團，優選末端官能團反應，而硅原子所直接連接的容易水解的烷氧基能夠直接與玻璃或塑料基質的表面反應。這種偶聯劑(廣義的(extended)硅烷)也可以這樣在原位構成，首先將母體硅烷與傳感芯片表面反應，然后以化學反應將接頭接在固定的硅烷上。再通過偶聯劑(即，帶有機接頭的硅烷)把配體系于玻璃或塑料的表面。而且，接頭應該有足夠的長度以最佳距離(40)從芯片表面呈現配體。這一原則基于我們對較短距離導致細菌細胞捕捉效率降低的確定。
這樣，系于玻璃表面的配體可以下述例子說明 系于氧化的塑料表面的配體也可以上例說明，只要將“玻璃-O-Si”部分換成C(塑料聚合物的碳)。用于將配體系于傳感芯片表面的化學反應為本領域技術人員所熟知并在文獻中有記述。可以在下述文獻中找到這類反應G.T.Hermanson Bioconjugate Technique(San DiegoAcademicPress，1996)；Hansson等.，“Carbohydrate-Specific Adhesion of Bacteria toThin Layer ChromatogramsA Rationalized Approach to the Study ofHost Cell Glycolipid Receptors”(Analytical Biochemistry 146158-163(1985)；和Nilsson等，“A Carbohydrate Biosensor Surface for theDetection of Uropathogenic Bacteria”(Bio/Technology 121376-1378(December 1994))。
用將配體鐵草銨聯接于玻璃傳感芯片表面的例子說明這種反應。在第一階段，用2％的γ-N-(氨丙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷溶液同帶有游離羥基的玻璃表面反應，使硅烷附著于玻璃表面玻璃-OH+(C2H3)3O-Si(CH2)3NH(CH2)3NH2→(I) 反應產物在pH大約8左右再同戊二醛反應形成相應的醛 該醛再同二胺(III)反應產生IVH2N(CH2)12NH2(III) 接著，前面反應的產物同戊二醛反應來引入一個(末端)醛基 該醛基可以用NaCNBH3還原為 然后通過與deferrioxamine B(或DFA)在堿性pH反應可以將前述結合于表面的硅烷偶聯劑衍生化得到 然后，在水溶液中同鐵鹽反應，DFA就能與鐵復合形成配體。
只要不偏離本發明，尤其是下述權利要求中所定義的精神，可以對測定、步驟和制劑進行多種改變和修正。
權利要求
1.分類學鑒定生物學分析物的方法，包括(a)將含有分析物的溶液暴露給特異于目的分析物的配體，該配體為捕捉微生物，由光穩定的接頭以至少15埃的距離共價聯接于基質表面；(b)以物理分離，清洗或這兩種方法，分離結合的分析物與含分析物溶液中的非結合成分；(c)檢查系有配體的基質表面上分析物的結合。
2.權利要求1的方法，其中生物學分析物選自(a)細菌；(b)病毒；(c)立克次氏體；(d)原生動物；和(e)真菌。
3.權利要求1的方法，其中配體是血紅素復合物。
4.權利要求1的方法，其中配體是鐵載體。
5.權利要求1的方法，其中配體是多糖。
6.權利要求1的方法，其中配體是特異于外膜蛋白的肽。
7.權利要求1的方法，其中配體是特異于綴合脂的肽。
8.權利要求1的方法，其中通過顯微鏡檢術檢測捕獲的分析物。
9.權利要求1的方法，其中通過靶標的固有熒光檢測捕獲的分析物。
10.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的熒光來檢測捕獲的分析物。
11.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的熒光來檢測捕獲的分析物。
12.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性化合物的放射性來檢測捕獲的分析物。
13.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲之后暴露于樣品的反應性化合物的放射性來檢測捕獲的分析物。
14.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的冷光來檢測捕獲的分析物。
15.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的冷光來檢測捕獲的分析物。
16.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的磷光來檢測捕獲的分析物。
17.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的磷光來檢測捕獲的分析物。
18.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的光吸收來檢測捕獲的分析物。
19.權利要求1的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的光吸收來檢測捕獲的分析物。
20.權利要求1的方法，其中通過在結合分析物后，系有熒光性配體的表面的熒光淬滅來檢測捕獲的分析物。
21.分類學鑒定生物學分析物的方法，包括(a)將含有分析物的溶液特異于目的分析物的配體，該配體為捕捉蛋白由光穩定的接頭以至少6埃的距離共價聯接于基質表面；(b)以物理分離，清洗或這兩種方法，分離結合的分析物與含分析物的溶液中的非結合成分；和(c)檢查系有配體的基質表面上分析物的結合。
22.權利要求21的方法，其中生物學分析物選自(a)蛋白毒素；和(b)胞質蛋白。
23.權利要求21的方法，其中配體是特異于蛋白毒素的肽，通常長3到20個氨基酸。
24.權利要求21的方法，其中配體是特異于蛋白激素的肽，通常長3到20個氨基酸。
25.權利要求21的方法，其中配體是特異于胞質蛋白的肽，通常長3到20個氨基酸。
26.權利要求21的方法，其中通過蛋白的固有熒光檢測捕獲的分析物。
27.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的熒光來檢測捕獲的分析物。
28.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的熒光來檢測捕獲的分析物。
29.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于該蛋白的反應性化合物的放射性來檢測捕獲的分析物。
30.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于該蛋白的反應性化合物的放射性來檢測捕獲的分析物。
31.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的冷光來檢測捕獲的分析物。
32.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的冷光來檢測捕獲的分析物。
33.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的磷光來檢測捕獲的分析物。
34.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的磷光來檢測捕獲的分析物。
35.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的光吸收來檢測捕獲的分析物。
36.權利要求21的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于該蛋白的反應性染料綴合物的光吸收來檢測捕獲的分析物。
37.權利要求21的方法，其中通過在結合蛋白后系有熒光性配體的表面的熒光淬滅來檢測捕獲的分析物。
38.分類學鑒定生物學分析物的方法，包括(a)將含有分析物的溶液暴露給特異于目的分析物的、且與標記綴合的配體；(b)分離結合的分析物與多余的與標記綴合的配體。(c)通過檢測綴合的標記來檢查分析物結合配體的情況。
39.權利要求38的方法，其中生物學分析物選自(a)細菌；(b)病毒；(c)蛋白毒素；(d)立克次氏體；(e)原生動物；(f)真菌，和(g)胞質蛋白。
40.權利要求38的方法，其中通過色譜法分離結合的分析物與多余的綴合的配體。
41.權利要求38的方法，其中配體與磁性顆粒綴合，并且通過磁性分離而分離結合的分析物與分析物溶液中的非結合成分，所述配體為捕捉微生物以至少15埃距離系于磁性顆粒。
42.權利要求38的方法，其中配體是血紅素復合物。
43.權利要求38的方法，其中配體是鐵載體。
44.權利要求38的方法，其中配體是多糖。
45.權利要求38的方法，其中配體是特異于外膜蛋白的肽。
46.權利要求38的方法，其中配體是特異于綴合脂的肽。
47.權利要求38的方法，其中標記是熒光性的，并且通過熒光檢測。
48.權利要求38的方法，其中標記是冷光性的，并且通過冷光檢測。
49.權利要求38的方法，其中標記是放射性的，并且通過放射性檢測。
50.權利要求38的方法，其中標記是磷光性的，并且通過磷光檢測。
51.分類學鑒定生物學分析物的方法，包括(a)將含有分析物的溶液暴露給共價聯接于基質表面的不同配體的陣列，(b)以物理分離，清洗或這兩種方法，分離結合于配體陣列的分析物與溶液中的非結合成分，和(c)檢查系有配體的基質表面上分析物的結合。
52.權利要求51的方法，其中陣列所用配體為捕捉微生物，由光穩定的接頭以離基質表面至少15埃的距離共價聯接于基質表面。
53.權利要求51的方法，其中陣列所用配體為捕捉蛋白毒素，由光穩定的接頭以離基質表面至少6埃的距離共價聯接于基質表面。
54.權利要求51的方法，其中生物學分析物選自(a)細菌；(b)病毒；(c)蛋白毒素；(d)立克次氏體；(e)原生動物；(f)真菌，和(g)胞質蛋白。
55.權利要求51的方法，其中一個或多個配體是血紅素復合物。
56.權利要求51的方法，其中一個或多個配體是鐵載體。
57.權利要求51的方法，其中一個或多個配體是多糖。
58.權利要求51的方法，其中一個或多個配體是特異于外膜蛋白的肽。
59.權利要求51的方法，其中一個或多個配體是特異于綴合脂的肽。
60.權利要求51的方法，其中通過顯微鏡檢術檢測捕獲的微生物。
61.權利要求51的方法，其中通過靶標的固有熒光檢測捕獲的分析物。
62.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的熒光來檢測捕獲的分析物。
63.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的熒光來檢測捕獲的分析物。
64.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性化合物的放射性來檢測捕獲的分析物。
65.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲之后暴露于樣品的反應性化合物的放射性來檢測捕獲的分析物。
66.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的冷光來檢測捕獲的分析物。
67.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的冷光來檢測捕獲的分析物。
68.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的磷光來檢測捕獲的分析物。
69.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的磷光來檢測捕獲的分析物。
70.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之前暴露于樣品的反應性染料綴合物的光吸收來檢測捕獲的分析物。
71.權利要求51的方法，其中通過在表面所系配體捕獲分析物之后暴露于樣品的反應性染料綴合物的光吸收來檢測捕獲的分析物。
72.權利要求51的方法，其中通過在結合分析物后系有熒光性配體的表面的熒光淬滅來檢測捕獲的分析物。
73.鑒定蛋白的方法，包括(a)將含有微生物的溶液暴露于導致微生物裂解而其內容物流出到溶液中的條件下，所述條件選自化學處理、holins、酶處理、凍融循環、噬菌體感染和物理處理，(b)將含有蛋白分析物的溶液暴露于由光穩定的接頭共價聯接于基質表面的、特異于目的分析物的配體，(c)通過物理分離，將結合的分析物與含分析物的溶液中的非結合成分分離開；并且(d)檢查系有配體的基質表面上分析物的結合，其中為捕捉蛋白，以離基質表面至少6埃的距離聯接配體。
74.權利要求73的方法，其中配體是特異于目的蛋白的肽。
75.權利要求73的方法，其中通過被捕獲的蛋白的固有熒光來檢測。
76.將生物學分析物捕捉到基質上的方法，其中(a)所用配體選自血紅素復合物、鐵載體、多糖、和特異于外膜蛋白、綴合脂和微生物蛋白靶的肽；(b)為捕捉微生物，以離基質表面至少15埃的距離聯接配體；(d)基質適于柱填充；(e)生物學分析物選自細菌、病毒、立克次氏體、原生動物、和真菌；(f)通過在基質上捕獲生物學分析物，使生物學分析物從水樣品中濃縮，并且(g)通過在基質上捕捉生物學分析物，使生物學分析物從醫學樣品中濃縮。
77.以接頭將配體系于基質表面的方法，包括(a)將硅烷化合物[Si(R1R2R3R4)]同氧化的(羥基化的)基質表面反應，其中一個取代基包含帶有能與配體反應的官能團的接頭，并且(b)將配體同共價聯接的硅烷接頭的官能團反應；其中選擇接頭，使聯接的配體優選離基質表面至少15埃。
78.權利要求77的方法，其中R1到R4都分別選自氫、含1到6個碳的烷基，含6到12個碳的芳基和含1到4個碳的烷氧基，且R1，R2和/或R3中至少有一個是烷氧基。
79.權利要求77的方法，其中R4是有機基團，含至少3個碳原子，且還含帶有能與配體反應的官能團的長接頭。
80.權利要求77的方法，其中含接頭的有機基團包括胺、聚醚和多聚甘氨酸。
81.權利要求77的方法，其中接頭(R4)的偶聯劑官能團包括環氧基、氨基、不飽和官能團、羥基和巰基。
82.權利要求77的方法，其中配體同有機硅烷化合物的官能團，優選末端官能團反應，而直接與硅原子相聯的易水解的烷氧基能夠和表面基質的表面直接反應。
83.權利要求77的方法，其中通過先將母體硅烷[Si(R1R2R3R4)]與配體反應，然后由烷氧硅烷同基質表面反應，在原位構建配體系鏈。
全文摘要
本發明記述用以一定距離共價聯接于基質表面的配體結合病源微生物及其毒性蛋白的方法，其中要求結合微生物的配體系鏈的距離為至少15埃，而結合蛋白的配體系鏈的距離為至少6埃。這里所述配體包括血紅素復合物、鐵載體、多糖、和特異于毒性蛋白、外膜蛋白和綴合脂的肽。分離被分析溶液的非結合成分與結合的組分而且通過顯微鏡檢術、熒光、表面熒光、冷光、磷光、放射性或光吸收檢測分析物進一步證實結合的發生。在基質表面的陣列中以一定模式排布許多配體，可以通過分析樣品對該陣列的結合模式分類學鑒定微生物。
文檔編號G01N33/48GK1417347SQ02143520
公開日2003年5月14日 申請日期2002年9月27日 優先權日2001年11月1日
發明者L·S·鮑爾斯, W·R·小艾里斯, C·R·洛伊德 申請人:微生物系統有限合伙公司