熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物及其制備方法

專利名稱：熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種硅納米顆粒，尤其是熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物及其制備方法。所說的熒光稀土絡合物硅納米顆粒是攙雜或者鍵合熒光稀土絡合物的硅納米顆粒。作為優異的發光材料，熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物可以廣泛應用于醫學診斷領域。
2、背景技術常用的熒光標記物熒光壽命短，難以克服背景熒光的干擾，檢測靈敏度低。利用具有長壽命的熒光稀土絡合物作為標記物，采用時間分辨檢測技術，可以消除背景熒光的干擾，使靈敏度提高幾個數量級，這種稱作時間分辨熒光檢測的技術，已成為目前生物醫學研究和臨床生化檢測中的很有前途的超微量分析方法。
稀土離子主要是銪、鋱、釤和鏑等，它們能與某些特定的配合物形成強熒光的絡合物。稀上絡合物具有以下優異的的熒光性質①熒光壽命長。一般熒光物質以及背景熒光的壽命約為1～10ns，而稀土絡合物的熒光壽命一般為10～1000μs，兩者相差5～6個數量級。因此，采用時間分辨熒光檢測技術，可以有效克服非特異性熒光的干擾，使測量的靈敏度大大提高。②激發光譜帶較寬。這有利于增加激發能，提高標記物的比活性。③發射光譜帶窄。半峰寬小于15nm，有利于提高分辨率。④Stokes位移大。稀土絡合物的最大激發光波長通常在300～380nm的紫外區，最大發射光波長在500nm以上，Stokes位移達250～350nm，有利于排除各種背景熒光的干擾，增強檢測的特異性。⑤激發波長具有配體的特性，即隨配體的變化而變化，發射波長則具有稀土離子的性質，即不隨配體的變化而變化。這樣就可能采用單一激發光，獲得不同發射波長，從而實現多組分同時檢測。
現有的熒光稀土絡合物標記物，稀土離子主要是Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+同一些有機配合物如β-二酮化合物、鄰菲咯啉類化合物、水楊酸類化合物、聯吡啶類化合物等所形成的絡合物，雖然目前已得到不同程度的應用，但是都難以同時滿足如下要求①具有很強的熒光。②穩定性好包括熱力學穩定和耐光漂白等；③易與生物活性物質，如抗體，核酸和細胞等交聯，交聯后能同時保持標記物高熒光強度和被標記物的生物活性；④易合成，價格低。
稀上離子或稀土配合物和二氧化硅攙雜的發光材料已有不少報道，Cannasa等(Cannasa.C，et al，Mat.Res.Soc.Symp.Proc.676(Y3)18.1-18.6，2001)描述了一種用溶膠-凝膠法制備直接攙雜Eu3+的Y2O3-SiO2納米發光材料的方法。Moran等(C.E.Moranet al，Langmuir 2001，17，8376-8379)合成并表征了一種摻入稀土離子Pr3+和Er3+的硅納米顆粒。由于稀土離子本身的熒光極其微弱，不添加熒光配合物難以獲高強度熒光。姚云峰等(姚云峰，等，中國稀土學報，2000，18(4)305-308)報道將MGM-41介孔分子篩與Eu3+/噻吩甲酰三氟乙酰丙酮發光稀土絡合物組裝成介孔復合體。尹偉等(尹偉，等，無機化學學報，2002，17(1)60-64)也報道了將數種熒光銪絡合物與介孔分子篩MCM-41及(CH3)3-Si-MCM-41組裝成超分子納米發光材料。
CN01133257.3號專利申請公開了一種將二氧化硅、高分子單體和部分熒光稀土絡合物混合，先生成凝膠，在進行高分子聚合，可得到塊狀的發光材料，具有優良的力學性能，可以磨制拋光。
CN98116430號專利申請提供了一種含稀土有機/無機納米雜化發光材料的合成方法，采用Sol-Gel方法將前體化合物N-(丙基-γ-三乙氧基硅酯)-4-羧基-鄰苯二甲酰亞胺在鹽酸催化下形成溶膠，再將稀土離子或稀土離子及有機染料N-(丙基-γ-三乙氧基硅酯)-4，4’-聯苯四甲酸雙酰亞胺加入該溶膠中，旋涂成膜，凝膠化，獲得能發出紅、綠、黃及白色熒光的有機/無機納米雜化光學透明固體薄膜。
CN01133257號專利申請公開了一種高聚物/稀土化合物納米雜化發光材料的合成方法，采用Sol-Gel反應，將無機組分的前驅體正硅酸乙酯、乙烯基單體和稀土化合物都加入到溶膠體系中，在弱酸，如乙酸的存在下水解和縮合，攪拌反應成為均相溶膠，然后凝膠化。之后利用熱聚合方法引發單體聚合，從而獲得有機/無機納米雜化發光材料。
CN01133258號專利申請提供了一種無溶劑型高聚物/稀土化合物納米雜化發光材料的合成方法，采用Sol-Gel反應，將無機組分的前驅體正硅酸乙酯、乙烯基單體和稀土配合物都加入到溶膠體系中，在弱酸，如乙酸的存在下水解和縮合，弱酸在此即是調節pH值又起到增進兩相相溶性的目的。攪拌混合成為均相溶膠，然后凝膠化。之后利用熱聚合方法引發單體聚合，從而獲得有機/無機納米雜化發光材料。
以上報道或者專利申請都未考慮這些雜化材料作為醫學診斷標記物的可能性。而且，上述專利申請中，雖然提及“納米”材料，其終產物實際上都是塊狀材料。
US 4,283,382號專利公開了將稀土銪絡合物摻入乳膠顆粒的方法，可作為醫學診斷標記物。所述方法乃是通過降低溶劑的疏水性，將溶解在有機溶劑中的Eu3+絡合物嵌入一種特殊的稱作“可負載的聚合物乳膠顆粒”中。所謂的“可負載的聚合物乳膠顆粒”屬有機高分子材料，乳膠顆粒尺寸沒有明確的描述。
US 5,442,021號專利公開了一種可作為醫學診斷標記物用的發光共聚物，采用了可聚合的稀土離子配合物，該配合物含有和稀土離子配合的部分，同時含有雙鍵；前者可以和Eu3+形成熒光稀土絡合物，后者可以生成高分子聚合物。該標記物仍屬有機高分子材料，并且獲得的顆粒直徑都大于100nm(分別是140nm和130nm)。
3、發明內容本發明的目的之一是提供一種新的熒光稀土絡合物硅納米顆粒。
本發明的另一目的是提供一種與普通的熒光稀土絡合物標記物相比，具有更高的熒光強度，更高的穩定性，更容易標記，且制備簡單的含有熒光稀土絡合物的硅納米顆粒類標記物。
本發明的另一個目的是提供熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物，其中的熒光稀土絡合物既可以用攙雜的形式，也可以用鍵合的方式固定于硅納米顆粒中。攙雜的方式可以與硅納米顆粒的形成同步進行，也可以在納米顆粒形成以后進行。鍵合的方式既可以是在納米顆粒形成之前進行，也可以在納米顆粒形成之后進行。
本發明的另一個目的是提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物，其特點是能發出稀土離子的特征熒光。標記的熒光稀土絡合物具有廣泛的選擇性，既可以是水溶性的，也可以是水不溶性的。既可以是穩定存在的，也可以是在溶液中直接形成的。
本發明的另一個目的是提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒，可以同時攙雜或鍵合多種熒光稀土絡合物，通過調制稀土離子的種類和各個稀土離子絡合物的相對量，可獲得數目龐大的具有不同熒光性質的硅納米顆粒類標記物。
本發明的另一個目的是提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒，可以是表面無修飾的，也可以是表面攜帶各種功能團的。功能團可以利用含有這些功能團的硅烷單體，也可以是在硅納米顆粒形成后再進行表面修飾。
本發明的另一個目的是提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒，可以通過物理吸附的方式或通過表面的多種功能基團化學交聯的方式與感興趣的分子，如抗體，抗原，核酸等結合。
本發明的另一個目的是提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒，可以作為標記物質用于時間分辯熒光免疫分析，核酸探針標記，細胞標記等。
本發明所說的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物是攙雜熒光稀土絡合物的硅納米顆粒。所說的硅納米顆粒是由硅醇經水解凝聚(溶膠-凝膠反應)形成的顆粒。
本發明所說的熒光稀土絡合物硅納米顆粒的制備方法是
將熒光稀土絡合物攙雜于硅納米顆粒中，所說的攙雜可以是物理包裹也可以是化學鍵合。所說的物理包裹是指熒光稀土絡合物嵌入在硅納米顆粒硅氧網格中；而化學鍵合則是通過修飾的硅醇與常有活性基團的配體化學交聯，使熒光稀土絡合物通過化學鍵與硅連接而被鍵合在硅納米顆粒中。
所說的熒光稀土絡合物硅納米顆粒的用途是可作為熒光標記物。它是由硅納米顆粒和稀上絡合物組成的新型熒光標記物質。
“稀土絡合物硅納米顆粒類”熒光標記物中對熒光稀土絡合的要求是能夠按一定的方式摻入納米顆粒形成符合要求的熒光標記物。熒光稀土絡合物可以是水溶性的，如多數Tb3+的絡合物和部分Eu3+的絡合物，它們可以通過O/W反相微乳攙雜在硅納米顆粒中；熒光稀土絡合物也可以是水不溶性的，如大部分Eu3+絡合物和一部分Tb3+離絡合物，它們可以通過后摻入的方式攙雜在已經形成的硅納米顆粒中。對于另外一些帶有活性基團的稀土配體，則可以通過和修飾的硅醇(R-Si(OR’)3)反應化學鍵合在硅納米顆粒中。
從熒光標記物的角度來說，熒光強度、穩定性和易標記是這種攙雜物質的最重要指標。在一定范圍內，摻入的熒光稀土絡合物越多，納米顆粒的熒光強度越強，作為標記物的靈敏度就越高。穩定性主要是指攙雜的熒光稀土絡合物的熒光強度能保持足夠穩定，在使用環境中不發生熒光強度的改變。易標記反映在與不同物質偶聯的能力，這種偶聯可以是物理吸附，也可以是化學交聯。
本發明提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物具有較一般熒光稀土絡合物標記物更多的優點。
首先，熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物以摻入或鍵合的方式包裹了大量的稀土絡合物，因此單個硅納米顆粒的熒光強度相當于多個稀土絡合物的集合。由于熒光稀土絡合物處在無水的固相介質中，大大減少了各種熒光淬滅效應的影響，使稀土絡合物的熒光強度進一步提高。稀土絡合物硅納米顆粒的熒光強度大大高于單個稀土絡合物，也就避免了標記單個稀土絡合物時不得不采用的多重標記的麻煩。
其次，硅納米顆粒類標記物中稀土絡合物或者摻入在二氧化硅網格中，或者與硅烷單體以化學鍵合的方式共存。在物理摻入方式中，不同的稀土絡合物和二氧化硅網格存在多種不同形式的作用，有時能表現出很強的穩定性。而化學鍵合的方式，泄露問題則可以得到根本解決。穩定的硅納米顆粒對稀土絡合物提供了很好的保護，使得這類標記物穩定性大大高于常規稀土絡合物。
硅納米顆粒可以和蛋白質發生物理吸附作用，在很多情況下，可以直接以物理吸附的方式標記物質。另外，利用各種攜帶活性基團(如氨基、巰基、羧基、醛基、羥基、環氧基等)的硅烷試劑，獲得的表面帶有相應活性基團的硅納米顆粒，則可以與生物分子進行靈活的化學交聯。
熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物易合成和成本低的優點主要反映在如下幾個方面目前的熒光稀土絡合物標記試劑，為獲得高熒光效率和高穩定性，需要多種基團的協同作用，造成此類配合物結構復雜，尤其作為標記物，還須引入活性基團，合成難度加大。使此類稀土絡合物標記物十分難得，現尚難見到單獨的稀土絡合物標記物的商品試劑出售。硅納米顆粒類標記物，本身具備的集成性，使其對稀土絡合物的要求大大降低，從而增加了稀土絡合物的選擇范圍，加上硅納米顆粒本身的制備技術已成熟，制備過程相對簡單。
“稀土絡合物硅納米顆粒類”熒光標記物較一般熒光標記物具有諸多優點，最突出之處是它具有一般熒光標記物所不具有的長熒光壽命，又具備一般稀土絡合物標記物所不具有的高熒光強度、穩定性和易標記性。與最近出現的性能卓越的量子點熒光標記物相比，“稀土絡合物硅納米顆粒類”熒光標記物也具有明顯的優勢。這不僅是因為前者合成和修飾都很困難，還在于它們的相對不穩定性。量子點的突出優點是在紫外區激發下，能夠產生譜帶很窄的不同波長的熒光，“稀土絡合物硅納米顆粒類”熒光標記物也有同樣的特點，而它的長壽命熒光則是量子點所不具備的。雖然，量子點的發射波長有更廣的選擇范圍，但從實際應用的角度，在較長波長發射熒光的標記物才有價值，稀土絡合物的熒光發射就恰恰落在這個區域。
具體實施方式
以下實施例描述了本發明的特殊實施例子，以便對本發明作進一步的說明，這些實施例只是說明而不表示本發明所有的可能性。本發明并不局限于這些實施例中提到的材料、反應條件或參數，任何在相關領域具備經驗的人，都可以按照本專利的原理，利用其它類似材料或反應條件制備出本發明所描述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒，并應用于不同的領域中。這些并不脫離本發明描述的基本概念。因此，這些修改或者不同的應用都在本發明的覆蓋范圍之內。
本發明以實施例提供上述硅納米顆粒、熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物以及它們的制備方法。本發明的一個實施例提供的制備途徑描述了水溶性熒光稀土絡合物摻入的是利用表面活性劑，水和與水不混溶的有機溶劑制備出穩定的反相微乳，向微乳中加入水溶性的稀土絡合物熒光體系，一種水解試劑和烷基硅烷物質，硅烷物質可以是攜帶功能基團的。在微乳的水相小滴中，烷基硅烷和水解試劑反應形成攙雜熒光稀土絡合物的納米顆粒。本發明的另一個實施例提供了利用可溶于有機溶劑的熒光稀土絡合物制備硅納米顆粒的途徑，首先按照Stober法或反相微乳法制備硅納米顆粒，制備硅納米顆粒的硅烷試劑可以攜帶功能團，以方便納米顆粒的標記反應。將溶于有機溶劑(如乙醇等)的熒光稀土絡合物與納米顆粒混合，然后使有機溶劑揮發，混合和揮發過程可以重復數次，最后獲得熒光納米顆粒。
本發明的另一個制備途徑是利用具備具有反應基團的熒光稀土配合物和硅烷試劑首先反應，獲得鍵合稀土配合物的硅烷試劑，然后按照Stober法或微乳法聚合形成硅納米顆粒。
可以看出，本發明充分利用了各種熒光稀土絡合物和各類硅烷試劑的不同性質，通過采用靈活的硅納米顆粒制備途徑，大大增加了制備性能優異的稀土絡合物硅納米顆粒的機會。
本發明提供的熒光稀土絡合物硅納米顆粒可以作為標記物用于各類特異反應檢測中，如作為抗原或抗體標記物用于免疫分析，尤其是高靈敏的時間分辯熒光免疫分析，以及免疫組織化學和蛋白質芯片檢測中；可以作為核酸探針標記物而用于核酸雜交分析，PCR產物檢測和DNA芯片檢測中。還可以作為細胞的標記物，用于細胞分析等。
實施例1攙雜熒光絡合物DTPA-CS124-Tb的硅納米顆粒該實施例描述了利用Tb-CS124-DTPA熒光絡合物制備硅納米顆粒，在中性酸度下，Tb-CS124-DTPA的水溶液能發出Tb3+的特征熒光。利用反相微乳技術，將該絡合物水溶液包裹于納米水滴。在水滴中，硅烷單體在氨水作用下水解聚合，形成納米顆粒的過程中，熒光絡合物Tb-CS124-DTPA被包裹其中，最終得到摻入型的熒光絡合物硅納米顆粒。
(1)合成DTPA-CS124a.稱取18mg DTPAA(0.05mmol)，溶于200μL DMSO中；b.向上述溶液加入20μL三乙胺；c.稱取8.7mg CS-124(0.05mmol)，溶于140μL DMSO中；d.將CS-124溶液逐滴加入DTPAA溶液中，反應2h。
(2)配制DTPA-CS124-Tb溶液a.用10mmol的HCl配制TbCl3溶液，濃度為50mmol/L；b.將TbCl3溶液與DTPA-CS124溶液等摩爾混合，配制成DTPA-CS124-Tb；c.用50mmol Tris/HCl pH7.8緩沖液稀釋，作為熒光液使用。
(3)硅納米顆粒的制備a.將3.6mL Triton X-100、1.8mL正己醇、8mL環己烷和0.4mL去離子水混合，攪勻；
b.在攪拌下，逐滴加入150μL四乙基硅烷(TEOS)或者TEOS與N’-[3-(三甲氧基硅)丙基]二乙基三胺(TSPDT)4∶1的混合物，120μL氨水(25％～28％)，攪拌0.5～1h；c.向上述體系逐滴加入1mL熒光溶液，并繼續攪拌一h；d.放置24～36h；e.加入10mL丙酮，混勻，離心分離顆粒；f.用水和乙醇洗顆粒數次，除去表面活性劑以及顆粒表面吸附的稀土絡合物。最后得到直徑在40nm左右的包裹有DTPA-CS124-Tb的硅納米顆粒或者表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例2攙雜熒光絡合物Eu3+-四環素的硅納米顆粒該實施例描述了利用Eu3+-四環素(TC)熒光絡合物制備硅納米顆粒，在偏堿性條件下，Eu3+-TC的水溶液能發出Eu3+的特征熒光。利用反相微乳技術，將該絡合物水溶液包裹于納米水滴。在水滴中，硅烷單體在氨水作用下水解聚合，形成納米顆粒的過程中，熒光絡合物Eu3+-TC被包裹其中，最終得到摻入型的熒光絡合物硅納米顆粒。
(1)配制Eu3+-TC溶液a.用10mmol的HCl配制EuCl3溶液，濃度為10mmol/L；b.稱取48.1mg鹽酸四環素(TC)，用少量NaOH溶液溶解，再用超純水稀釋至10mL，濃度為10mmol/L；c.將EuCl3溶液與TC溶液等摩爾混合，用0.1M Tries-HCl pH9.0緩沖液稀釋，作為熒光液使用。
(2)硅納米顆粒的制備方法同實施例1，最后得到直徑在40nm左右的包裹有Eu3+-TC的硅納米顆粒或者表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例3攙雜熒光絡合物Tb-Tiron的硅納米顆粒該實施例描述了利用Tb-鈦鐵試劑(Tiron)-DTPA熒光絡合物制備硅納米顆粒，在中性酸度下，Tb-Tiron的水溶液能發出強烈的Tb3+特征熒光。利用反相微乳技術，將該絡合物水溶液包裹于納米水滴。在水滴中，硅烷單體在氨水作用下水解聚合，形成納米顆粒的過程中，熒光絡合物Tb-CS124-DTPA被包裹其中，最終得到摻入型的熒光絡合物硅納米顆粒。
(1)配制Tb-Tiron溶液a.用10mmol的HCL配制TbCl3溶液，濃度為50mmol/L；
b.用去離子水配制Tiron溶液，濃度為10mmol/L；c.向30μL Tiron中加入3μL TbCl3溶液，混勻后，用1mL 0.05M Tris-HCl(ph7.8)稀釋，作為熒光液使用。
(2)硅納米顆粒的制備方法同實施例1，最后得到直徑在40nm左右的包裹有Tb-Tiron的硅納米顆粒或者表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例4攙雜型熒光絡合物Eu3+(TTA)2(phen)2硅納米顆粒本實施例描述了將易溶于有機溶劑的稀土絡合物，制成硅納米顆粒的方法。采用先合成硅納米顆粒，再摻入的方式，合成了在水溶液中穩定的能發出強烈熒光的熒光稀土絡合物硅納米顆粒。Eu3+與噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)和1，10-鄰菲咯啉(phen)能形成強熒光絡合物，但該反應體系在水中溶解度低，而易溶解在有機溶劑(如乙醇)中。在本實施例中，我們分別采用Stober法和反相微乳兩種方法，先合成硅納米顆粒，然后再摻入熒光稀上絡合物。
(1)反相微乳法制備硅納米顆粒將3.6mL Triton X-100、1.8mL下己醇、8mL環己烷和1.5mL去離子水混合，攪勻；再在攪拌下逐滴加入150μL TEOS或者TEOS與TSPDT的4∶1的混合物，及120μL氨水，繼續攪拌1h后，靜置24h；最后，加入10mL丙酮，混勻，離心分離顆粒，用水和乙醇洗顆粒數次。
(2)Stober法制備硅納米顆粒將600μL 30％氨水，10mL無水乙醇混勻，加入300μL TEOS，攪拌過夜；然后，離心分離顆粒，用水和乙醇洗顆粒數次。得到攙雜Eu3+的熒光絡合物的硅納米顆粒或者表面帶有氨基的硅納米顆粒。
(3)制備熒光絡合物納米顆粒a.分別用無水乙醇配制0.01M的EuCl3、TTA和phen；b.按摩爾比1∶2∶2混合，其中，要求EuCl3與phen先混合；c.用上述乙醇溶液浸泡已經烘干的純納米顆粒，然后，在85℃下，真空干燥，反復3次，得到攙雜Eu3+的熒光絡合物硅納米顆粒或者表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例5攙雜型多種熒光絡合物的硅納米顆粒本實施例描述了同時將多種熒光稀土絡合物同時攙雜硅納米顆粒的例子，這里的“多種”指按照稀土離子劃分的，配合物可以是相同的，也可以是不同的，但最好是相同的。以下例子具體描述了同時攙雜Eu3+和Sm3+熒光絡合物的例子，類似的方式也適用于其它稀土絡合物，而且攙雜或者的鍵合的方式可以是多種多樣的。Eu3+和Sm3+都能和噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)及1，10-鄰菲咯啉(phen)能形成強熒光絡合物，在本實施例中，我們分別采用Stober法，先合成硅納米顆粒，然后再直接摻入熒光稀土絡合物。
(1)Stober法制備硅納米顆粒同實施例4。
(2)制備熒光絡合物納米顆粒a.同實施例4，分別用無水乙醇配制Eu3+(TTA)2(phen)2和Sm3+(TTA)2(phen)2絡合物。
b.用二者的乙醇溶液同時浸泡已經烘干的純納米顆粒，然后，在85℃下，真空干燥，反復3次。得到同時攙雜Eu3+和Sm3+的熒光絡合物的硅納米顆粒或者表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例6鍵合型Eu3+-BHHCT熒光絡合物的硅納米顆粒4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)-氯磺酰-鄰-三聯苯(BHHCT)是一種三齒型的β-二酮型稀土絡合物，能和Eu3+絡合形成穩定的發出強烈熒光的熒光絡合物。BHHCT水溶性低，但本身攜帶-SOCl2，可以與氨基共價結合。利用帶有氨基的硅烷單體TSPDT先和BHHCT反應，形成共價結合的BHHCT的硅烷單體。然后利用反相微乳聚合，制備了穩定的熒光稀土絡合物硅納米顆粒。
(1)配制BHHCT-TSPDT將8mg BHHCT加入到400μL TSPDT中，攪勻，使其充分反應，得到BHHCT-TSPDT。
(2)配制Eu3+-BHHCT-TSPDT溶液將20μL BHHCT-TSPDT與50μL EuCl3(0.01M)混合，加入1000μL 50mmol/L Tris-HClpH9.0，作為熒光液使用。
(3)硅納米顆粒的制備a.將3.6mL Triton X-100、1.8mL正己醇、8mL環己烷和0.4mL去離子水混合，攪勻；b.在攪拌下，逐滴加入130μL TEOS及120μL氨水，攪拌0.5～1h；c.向上述體系逐滴加入1mL熒光溶液，并繼續攪拌2h；d.放置24～36h；e.加入10mL丙酮，混勻，離心分離顆粒；f.用水和乙醇洗顆粒數次，除去表面活性劑以及顆粒表面吸附的稀土絡合物。最后得到直徑在40nm左右的共價結合有Eu3+-BHHCT的表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例7鍵合型Eu3+-TTA熒光絡合物的硅納米顆粒噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)是β-二酮型稀土絡合物，能和Eu3+絡合形成發出強烈熒光的熒光絡合物。但TTA水溶性低，引入氯磺酰基后，可以與氨基共價結合。因此，利用帶有氨基的硅烷單體TSPDT先和氯磺酰TTA(CTTA)反應，形成共價結合TTA的硅烷單體。然后利用反相微乳聚合，制備了穩定的熒光絡合物硅納米顆粒。
(1)TTA的氯磺酰化稱取0.666g TTA，加入1mL氯磺酸，置50℃磁力攪拌5h，然后逐滴加至冰水中，4℃離心，棄上清，用冰水清洗沉淀，真空干燥48h。得到氯磺酰化的TTA，即CTTA。
(2)配制硅納米顆粒將10mg CTTA加入到400μL TSPDT中，攪勻，使其充分反應，棄取未反應的沉淀。得到CTTA-TSPDT。余按實施例5進行。最后得到直徑在40nm左右的共價結合有CTTA-Eu3+的熒光的表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例8鍵合型Tb3+-對氨基水楊酸-DTPA熒光絡合物的硅納米顆粒DTPAA可以和對氨基水楊酸(PAS)共價結合，產物可與Tb3+形成穩定的熒光絡合物，利用DTPAA可同時和兩個氨基結合的性質，將帶有氨基的硅烷單體TSPDT和PAS與DTPAA反應，形成共價結合的DTPAA-PAS的硅烷單體。然后利用反相微乳聚合，制備出穩定的熒光絡合物硅納米顆粒。
(1)合成TSPDT-DTPA-PASa.將9μL PAS(0.1M)與9μL DTPAA(0.1M)混合，加入1μL三乙胺，反應2h；該反應生成DTPA-PAS。另將9μL DTPAA(0.1M)與20μL TSPDT混合，再與上述溶液混合，最后得到TSPDT-DTPA-PAS；b.加入90μL TbCl3(0.01M)，并用1000μl Tris(pH9.0)稀釋，作為熒光溶液使用。
(1)硅納米顆粒制備同實施例1，最后得到直徑在40nm左右的共價結合有Tb-DTPA-PAS的熒光的表面帶有氨基的硅納米顆粒。
實施例9納米顆粒的物理吸附法標記物理吸附是利用納米硅顆粒對蛋白質的非特異吸附作用進行。取80μL納米顆粒溶液在有微孔離心膜的離心管中用25mmol/L碳酸緩沖液(pH9.5)洗3次，其間10,000rpf離心10min后用超聲(75W)震蕩5秒鐘使納米顆粒重新懸浮。加入200μL含0.4mg/mL羊抗人HBsAb的碳酸緩沖液(pH9.5)，37℃反應3h。1％BSA封閉顆粒15min后用含0.01％ Tween-40的2mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗五次，最后將顆粒懸浮在含0.1％明膠、0.01％ Tween-40和0.04％ NaN3的2 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中，2500rpf離心除去不溶物后，4℃儲存備用。用于免疫分析時，用標記物稀釋液稀釋1000倍使用。
實施例10納米顆粒的化學交聯法標記化學交聯法利用硅納米顆粒表面攜帶的各種活性基團(如氨基、巰基、羧基、醛基、羥基、環氧基等)，將生物分子與納米顆粒進行化學交聯。這里，我們以氨基化硅納米顆粒為例。
取80μL納米顆粒溶液在有微孔離心膜的離心管中用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗3次，其間10,000rpf離心10min后用超聲(75W)震蕩5秒鐘使納米顆粒重新懸浮。加入200μL含0.4mg/mL羊抗人HBsAb的上述PBS混勻，加入10μL戊二醛，混勻，4℃反應3h。離心洗滌后，用1％ BSA封閉顆粒30min，后用含0.01％ Tween-40的2mmol/LTris-HCl(pH8.0)洗五次，最后將顆粒懸浮在含0.1％明膠、0.01％ Tween-40和0.04％ NaN3的2mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中，2500rpf離心除去不溶物后，4℃儲存備用。用于免疫分析時，用標記物稀釋液稀釋1000倍使用。
權利要求
1.熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物，其特征在于是攙雜熒光稀土絡合物的硅納米顆粒。
2.如權利要求1所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物，其特征在于所說的硅納米顆粒是由硅醇經水解凝聚形成的顆粒。
3.如權利要求1所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于將熒光稀土絡合物攙雜于硅納米顆粒中。
4.如權利要求3所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于所說的攙雜是物理包裹或化學鍵合。
5.如權利要求4所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于所說的物理包裹是指熒光稀土絡合物被嵌入在硅氧網格中。
6.如權利要求4所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于所說的化學鍵合是通過修飾的硅醇使熒光稀土絡合物通過化學鍵與硅連接。
7.如權利要求1，3，4，5或6所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于所說的熒光稀土絡合物是水溶性的，為多數Tb3+的絡合物和部分Eu3+的絡合物，通過O/W反相微乳攙雜在硅納米顆粒中。
8.如權利要求1，3，4，5或6所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于所說的熒光稀土絡合物是水不溶性的，為大部分Eu3+絡合物和一部分Tb3+離絡合物，通過后摻入的方式攙雜在已經形成的硅納米顆粒中。
9.如權利要求1，3，4，5或6所述的熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物的制備方法，其特征在于所說的熒光稀土絡合物是帶有活性基團的稀土配體，通過和修飾的硅醇反應化學鍵合在硅納米顆粒中。
全文摘要
涉及一種硅納米顆粒，尤其是熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物及其制備方法。是一種攙雜熒光稀土絡合物的硅納米顆粒。其制備方法是將熒光稀土絡合物攙雜于硅納米顆粒中。單個硅納米顆粒的熒光強度相當于多個稀土絡合物的集合，減少了各種熒光淬滅效應的影響，使稀土絡合物的熒光強度進一步提高。稀土絡合物硅納米顆粒的熒光強度高于單個稀土絡合物，也就避免了標記單個稀土絡合物時不得不采用的多重標記的麻煩。穩定性高于常規稀土絡合物。表面帶有相應活性基團的硅納米顆粒，則可以與生物分子進行靈活的化學交聯，易合成和成本低。具有一般熒光標記物所不具有的長熒光壽命，又具備一般稀土絡合物標記物所不具有的高熒光強度、穩定性和易標記性。
文檔編號G01N33/52GK1400467SQ02141718
公開日2003年3月5日 申請日期2002年8月30日 優先權日2002年8月30日
發明者李慶閣, 許曄 申請人:廈門大學