專利名稱：一種定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高效液相色譜(HPLC)分析方法，具體涉及以HPLC定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法。
背景技術：
曲酸雙棕櫚酸酯是一種曲酸脂肪酸衍生物，近來被認為是一種效果顯著的、較為穩定的皮膚美白劑，關于曲酸脂肪酸衍生物的美白機理及其對皮膚作用過程的研究也得到相當的重視。尤其是對曲酸脂肪酸衍生物經皮滲透行為的研究，可在美白產品研制中為配方的合理性提供依據，而準確測定曲酸脂肪酸衍生物含量是這些研究工作的必要手段之一。特別是測定生物樣本如皮膚浸出液中的微量曲酸脂肪酸衍生物，要求有高精度、高靈敏度的方法。然而，目前還尚未有過曲酸脂肪酸衍生物定量測定方法的相關報導。
發明內容
由于目前尚未有相應的測定方法可以與曲酸脂肪酸衍生物在藥物代謝動力學等學科中的研究相適應，本發明的目的就在于提供一種簡便、快速、靈敏、準確度高、精確度好且回收率高的定量分析方法。
本發明提供的是一種高效液相色譜定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法，采用反相分配柱，柱溫25-45℃，流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85，流速0.8～1.5ml/分。
本發明采用的反相分配柱選擇C18色譜柱，例如，采用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm或Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等，均能得到良好的色譜分離圖譜，而從性能/價格比考慮，以YWG C18250×4.6mm 10μm為佳。
本發明的高效液相色譜定量分析方法中，采用柱溫25-45℃均能達到與雜質的有效分離，最佳柱溫為35℃。
本發明的高效液相色譜定量分析方法中，采用流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85均能達到與雜質的有效分離，而以流動相四氫呋喃/甲醇＝25/75分離效果最佳。
本發明的高效液相色譜定量分析方法中，采用的流速為0.8～1.5ml/分，以1.0ml/分分離效果為最佳。
圖1是四種不同流動相配比的曲酸雙棕櫚酸酯色譜圖。
圖2是曲酸雙棕櫚酸酯的紫外線吸收光譜圖，圖中KAD為曲酸雙棕櫚酸酯，THF為四氫呋喃。
圖3是不同柱溫下曲酸雙棕櫚酸酯色譜分離圖。
圖4是曲酸雙棕櫚酸酯液相色譜定量校正曲線。
圖5是分析條件調整前的7#、8#色譜分離圖。圖中，KAD為曲酸雙棕櫚酸酯，C-a為產品中的一種基質成分，P-II為促滲透劑。
圖6是分析條件調整后的7#、8#色譜分離圖。圖中，KAD為曲酸雙棕櫚酸酯，C-a為產品中的一種基質成分，P-II為促滲透劑。
具體實施例方式
①流動相的選擇曲酸雙棕櫚酸酯為弱極性化合物，難溶于水，微溶于甲醇、乙腈，在丙酮、四氫呋喃中有較好的溶解性，故采用非水系反相分配層析原理，用四氫呋喃/甲醇為流動相作色譜分析。
②流速的選擇取不同流動相流速作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，從保留時間、分離效果、色譜峰形等幾方面進行比較，選擇適宜的流速。
③色譜柱的選擇根據反相分配層析原理及待測成分的化學結構，確定以C18柱為首選分析柱。具體選用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm、Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等多種牌號或型號的C18色譜柱。
④檢測波長的選擇將曲酸雙棕櫚酸酯純品用四氫呋喃溶解，在波長190nm～400nm范圍內作吸光度掃描。從紫外吸收光譜圖(圖2)可見曲酸雙棕櫚酸酯在217、250nm處分別有峰值吸收，因為四氫呋喃在217nm附近也有較大吸收，故以主吸收波長250nm作為檢測曲酸雙棕櫚酸酯的首選波長。
⑤柱溫比較不同柱溫條件下所得到的樣品色譜圖，選擇合適柱溫，使待測成分與試樣中共存成分得到最佳分離。
以上所述的分析條件選擇是以曲酸雙棕櫚酸酯純品為對象而確立的，在方法的實際應用中，遇到的樣品大部分都是多組分的，出現干擾的情況很多。對于這些干擾成分可以通過樣品預處理的方法去除，如液-液萃取、固相萃取等；或者通過調整分析條件組合，如流動相配比、柱溫等，使待測成分與干擾成分得到有效分離。
實施例1 HPLC分析條件的確定本實施例采用Waters高效液相色譜系統Alliance 2690泵，YWG C18 250×4.6mm 10μm柱，2487紫外/可見光檢測器，Millennium 32軟件系統；試劑甲醇和四氫呋喃均為HPLC專用，水為蒸餾—去離子水。
(1)流動相的選擇用不同配比的四氫呋喃/甲醇為流動相作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，得到一組譜圖(圖1)。可以看到，四氫呋喃/甲醇比例從45/55～15/85時，均能達到較好的分離，而色譜峰保留時間隨甲醇比例增加逐漸后移，與雜質峰的分離度也逐次增大，以四氫呋喃/甲醇配比為25/75分離效果最好。如果四氫呋喃/甲醇比例大于45/55或小于15/85，只要能有效分離，也可使用。
(2)流速的選擇取0.8ml/分鐘、1.0ml/分鐘、1.5ml/分鐘等不同流動相流速作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，均能達到有效分離，而從保留時間、分離效果、色譜峰形等幾方面比較后認為流速1.0ml/分鐘為最佳。
(3)色譜柱的選擇選用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm、Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等多種牌號或型號的C18色譜柱分別作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，均能得到良好的色譜分離圖譜，而從性能/價格比考慮，以YWG C18250×4.6mm 10μm色譜柱為佳。
(4)檢測波長的選擇將曲酸雙棕櫚酸酯純品用四氫呋喃溶解，在波長190nm～400nm范圍內作吸光度掃描。從紫外吸收光譜圖(圖2)可見曲酸雙棕櫚酸酯在217、250nm處分別有峰值吸收，因為流動相溶劑四氫呋喃在次吸收峰217nm附近也有較大吸收，故以主吸收波長250nm作為檢測曲酸雙棕櫚酸酯的首選波長。
(5)柱溫的選擇分別在25℃、30℃、35℃、45℃柱溫條件下作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，所得到的樣品色譜圖(見圖3)表明在25～45℃范圍內均達到很好的分離，保留時間隨柱溫的升高而明顯前移，且雜質峰的分離度也有明顯變化。實際應用中，可在25～45℃范圍內或低于或高于此范圍選擇合適柱溫，使待測成分與試樣中共存成分得到最佳分離。
實施例2 定量相關性實驗用一組不同含量的曲酸雙棕櫚酸酯標準系列樣品按上述分析條件分別作色譜分析，將得到的色譜峰面積與含量作線性回歸分析，所得到的回歸曲線具有良好的線性關系(圖4)，相關系數r＝0.9995。
實施例3 回收率與重復性實驗在兩個不含曲酸雙棕櫚酸酯的護膚霜中加入曲酸雙棕櫚酸酯，使其含量參考值分別為10.0、100μg/g，充分混合后按本方法平行測定10次，結果見表1。
表1、方法回收率與重復性實驗結果測定 標準平均平均標準 相對樣品號 次數 加入量 回收量 回收率 偏差 標準偏差次 μg/g μg/g ％ SDRSD％110 10 9.8998.91.81.8210 100 99.699.61.31 1.3
實施例4 在“幾種美白劑及其配方經皮滲透合理設計最佳配方”研究中，應用本方法測定各種促滲透劑對曲酸雙棕櫚酸酯透皮效果的影響(1)含曲酸雙棕櫚酸酯樣品的制備在甲醇∶四氫呋喃(40∶60)的溶劑中可充分溶解＜0.1mg/ml的曲酸雙棕櫚酸酯。制備樣品時根據試樣中曲酸雙棕櫚酸酯的含量范圍按所述溶解極限決定稀釋度。
(2)美白霜試樣分析美白霜試樣7#與8#基本配方組分相似，配方8#添加了促滲透劑P-II，用類似本發明條件的高效液相色譜法進行分析測定，分析條件為YWG C18250×4.6mm10μm柱、流動相配比甲醇∶四氫呋喃75∶25、流速1.0ml/分鐘、柱溫30℃、檢測波長250nm。試樣7#、8#的HPLC色譜圖見圖5，圖中可見8#配方中曲酸雙棕櫚酸酯與組分C-a(產品中的一種基質成分)、組分P-II不能完全分離，因此定量分析的準確性受到影響。利用本發明的測定方法，對流動相配比、柱溫等條件作適當調整后再對配方7#、8#作色譜分析(將流動相配比與柱溫分別調整為85∶15和40℃)，得到的色譜圖見圖6。將圖5、圖6進行比較可以看到分析條件調整后，試樣中各組分得到完全分離，可以準確定量試樣中的曲酸雙棕櫚酸酯及其它成分。
權利要求
1.高效液相色譜定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法，其特征在于采用反相分配柱，柱溫25-45℃，流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85，流速0.8～1.5ml/分，檢測波長為250nm。
2.如權利要求1所述的方法，其中反相分配柱為C18柱。
3.如權利要求2所述的方法，其中反相分配柱選自YWG C18 250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm和Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm。
4.如權利要求3所述的方法，其中反相分配柱為YWG C18 250×4.6mm10μm。
5.如權利要求1所述的方法，其中柱溫為35℃。
6.如權利要求1所述的方法，其中流動相四氫呋喃/甲醇＝25/75。
7.如權利要求1所述的方法，其中流速為1.0ml/分。
全文摘要
本發明提供一種以高效液相色譜法定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法，該方法在柱溫25－45℃、流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85、流速0.8～1.5ml/分鐘、檢測波長250nm條件下利用反相分配層析原理對樣品進行分析，具有簡便、快速、靈敏、準確的優點。
文檔編號G01N30/36GK1472530SQ0213632
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月31日 優先權日2002年7月31日
發明者蔡惠民, 周莉 申請人:上海家化聯合股份有限公司