一種檢測目標微生物和靶分子的方法及其檢測設備的制作方法

專利名稱：一種檢測目標微生物和靶分子的方法及其檢測設備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用免疫電化學方法檢測目標微生物和靶分子的方法，還涉及為該檢測方法而設計的檢測設備。
背景技術：
對目標微生物和靶分子的檢測，被廣泛應用于各種微生物的檢測領域，例如在可能的疫病流行、暴發控制方面，需要對病原微生物作出迅速的檢測和識別，以便控制疫情，保障人民的身體健康和社會穩定。特別是象檢疫部門和海關這種對致病微生物檢測有快速要求的場所，對于微生物的自動化檢測需求也越來越高。目前，ELISA廣泛用于微生物的檢測，但這種方法的主要缺點是比較耗時，而且也需要很多的人工操作，同時，這種分析方法的靈敏度也不足以對原始樣品進行直接分析。對這種方法的一個改進是基于多孔膜的酶聯免疫滲濾法(Enzyme-linked immunofiltrationassay，ELIFA)，雖然這種方法對ELISA有很大改進，但在用于原始樣品檢測時，由于其靈敏度尚不夠高，仍然難以實現對原始樣品的檢測。對目標微生物和靶分子的檢測技術當中，通常會使用到生物傳感器。有人采用“流過式免疫滲濾膜技術”制備了電化學免疫傳感器系統(Ihab Abdel-Hamidetc.，Flow-through immunofiltration assay system for detection ofE.Coli O157H7，Biosensors & Bioelectronics 14(1999)309-316；IhabAbdel-Hamid etc.，Highly sensitive flow-injection immunoassay systemfor rapid detection of bacteria，Analytica Chimca Acta 399(1999)99-108)，該系統采用了傳統的生物傳感器結構，其生物敏感元件與換能器(電極)緊密結合在一起，同時僅進行了單通道的設計，搭建了一個簡單的半自動化的檢測裝置，主要由一個蠕動泵和一個樣品注入閥及相應流路所組成，催化底物液為人工現用現配，采用了辣根過氧化物酶(HRP)催化過氧化氫氧化碘化鈉生成碘分子的催化體系。實驗證明這套體系是不穩定的。發明人在實驗中發現，即使沒有HRP催化，過氧化氫也很快氧化碘化鈉生成碘分子。另外，現有技術采用了小孔徑的尼龍膜和單向的流路操作，以致于出現了膜的堵塞(參見[B.C.Weimer，M.K.Walsh，C.Beer，et.al.，Solid-phase Capture of Proteins，Spores and Bacteria，Applied andEvironmental Microbiology，Mar.2001，vol.67，No.3，1300-1307])。由于存在著上述諸多技術上的問題，所以上述的檢測方法在儀器化和實用化上未能取得突破，達不到實用化的目的。

發明內容
本發明目的是研制一種用于檢測目標微生物和靶分子的測定方法，同時還提供一種便攜式免疫電化學生物傳感器系統。它可以對檢測樣品直接進行檢測，無需培養富集，具有檢測快速、靈敏和自動化操作的特點。通過多通道、多探頭設計，它可同時對多種目標分析物進行檢測。
本發明方法的原理如下利用抗原抗體特異性結合的特點，首先用目標微生物免疫動物，獲得抗體，將該抗體共價結合在固相載體表面上，例如尼龍膜和玻璃珠，當含有該目標微生物的樣品溶液流過此抗體膜(或玻璃珠)時，便與抗體結合。漂洗后，再與流過的含有堿性磷酸酶(AP)標記的該目標微生物抗體的反應液作用，形成抗體-目標微生物-酶標抗體(AP)復合物。
我們選用的AP催化底物是α-萘酚磷酸鹽，其水解產物是α-萘酚，后者在電化學電極上在一定的電位下被氧化，產生相應的電流信號。電流的大小與膜上結合的目標微生物量在一定范圍內成一定比例，從而實現對目標微生物的檢測。
如果待測樣品中不含有目標微生物，則不會形成抗體-目標微生物-酶標抗體(AP)復合物結構，也就不會產生酶催化水解產物引起的電化學電流。
AP催化體系中的α-萘酚磷酸鹽相當穩定。本發明實驗采用這套體系獲得了很好的結果在工作電位為350mv下，將經梯級稀釋的0.002微升量的AP-抗體結合物(羊抗兔IgG-AP)固定在膜上，在其底物流過此膜時，仍可檢測到明顯的電流信號變化。
為了實現上述的免疫測定方法，本發明還設計了一套檢測系統設備，該設備的組成如下所述部件按照如

圖1所示相互連接，其中Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15均為三通(參見圖4)，I5為二通閥(參見圖4)。符號0為四通。圖1中直線部分為內徑為1mm的管路，其中1和2為二個微型泵(見附圖2、3)，各與二個二通閥(在泵的兩側，未標出)相接后，可實現流路內液體流動的正反方向變換。本發明所采用的泵和二通閥及三通閥均購買于美國的The lee Company。3為生物敏感元件(見圖8和圖9)，內部有固定化抗體的膜或玻璃珠，在這里稱作反應池。4為樣品池(見圖12)，內部裝有底物α-萘酚磷酸鹽。5為電化學檢測器(見圖11)，由工作電極(W)、參比電極(R)和對電極(C)組成，形成一個流動電解質的電解池。6對應由三氯乙酸配制的洗液。7，17，13，19，20表示與底物緩沖液(pH為9.8的二乙醇胺溶液)相接。8，10，11，15，18(其中10可通過三通Y11與11相通)表示與廢液相連。9為PBS溶液。12為待檢測樣品。14為酶結合物。16為底物溶液。
二通可進行開、關操作。由于每個三通都有一個公共端，與另兩端相通，而另兩端卻不互通，所以三通在流路中的連接對控制內部溶液的走向非常重要。圖5是各三通閥的標識圖，各閥的端口方向均與圖1中各閥的相應位置對應，是一種平移關系。在進行流路安裝時，一定要注意所有各閥的A端均為公共端。
圖1中泵1與泵2均為可變流量體積的微型泵。每個泵的重量只有300克，流速在0-7500微升/分鐘之間可調。這種微型泵完全可以替代蠕動泵。微型泵、閥技術的成熟與商品化，也是我們能夠進行自動化、便攜式微生物檢測器設計的前提之一。
本發明檢測設備所使用的電化學檢測器(圖1中的5)，其結構如圖10和圖11所示，它主要由三部分組成，即工作電極66(W)、參比電極68(R)和輔助電極69(C)。這三個電極的形狀一樣(見圖11中右下側的電極元件71、72、73)，中間孔徑為1mm，柱高12mm，柱外徑10mm，其制作方法是在有機玻璃柱的全部表面涂上一層導電材料，工作電極和輔助電極涂上導電碳漿，參比電極涂上一層Ag-AgCl漿，這三個電極組裝到一個設計好的有機玻璃腔體內，形成左側的電化學電極檢測器，在中間形成一個流路通道，構成一個流動反應液的電解池。
圖中66、68、69為三個電極的引線孔，在實際應用中采用了導電的銅螺絲，擰入三個孔后，分別與71、72、73導電的表面相連接，銅螺絲的外部再分別與恒電位儀相接。各部件的關系是71裝入部件65的上部內腔中，然后擰上64，然后72裝入67的上部內腔中，65再擰到67上部，接下來73裝入67的下面內腔中，70再擰到67的下端上，從而形成了一個電化學檢測器。
本發明檢測設備當中使用的底物樣品池(圖1當中的4)，其結構如圖12所示。該樣品池的設計有兩方面的目的，一是為了便于流路中樣品的充分有效混合，二是為了便于儲存底物。圖12中74為閥門，在接入流路后打開，在儲存時關上，避免底物溢出，也可避免水份等進入。75、76為有機玻璃材料，這兩部分可通過螺絲擰合在一起，77對應所指為兩部分的螺紋。內腔中間孔柱部分的直徑為8mm，上下高8mm，內腔上下總高為20mm。
本發明檢測設備當中的生物敏感元件反應池和探頭的設計方案如下如圖8、9所示，圖中的檢測元件都由有機玻璃材料制成。圖8膜元件由55、56、57、58四部分組成，各部分的關系是抗體膜57可放在內壁有一圈平臺的底座58內，56為一有錐形孔的有機玻璃柱，可以壓在膜的周邊上，55為一帶有螺紋的有機玻璃罩，可以擰在58(也有螺紋)上，在擰55時，可產生一個向下的壓力，使56壓緊中間的膜，從而在檢測時不致于被水流沖下來。
圖9與圖8類似，幾部分之間也是壓接在一起的。在部件62和59內都有一個內壁平臺，當下面的圓形不銹鋼網60放在62的平臺上后，放入圓形孔柱61，其下沿壓在底下的鋼網周邊部分，然后在61的空腔內裝入玻璃珠，上面蓋上第二個鋼網60，接下來蓋上部件59，59的螺紋擰到62的螺紋上，59的平臺可產生一個向下的壓力，使各部件間相互壓緊在一起。
兩種元件的設計外形尺寸一致，可以在流路的多探頭設計中互換。設計元件內膜和玻璃珠與溶液有效接觸面的直徑為6-8mm。元件內腔高(上下出入口間距)為16mm。玻璃珠層厚為5mm左右，玻璃珠的直徑為0.6mm-1mm，固定于兩層薄不銹鋼絲網之間。
對于上述這兩種元件的結構和雙錐形幾何形狀進行如此設計，目的是為了增大膜或玻璃珠與溶液的作用面積，提高酶催化反應的效率和產量，提高靈敏度。另外也有利于徹底的漂洗和反應，使其不存在死角。
對于上述元件，在選用玻璃珠的尺寸上，發明人考慮到相同重量的玻璃珠，珠的直徑越小，其表面積與體積比越大，因此，流過小玻璃珠元件的樣品溶液中的檢測物與玻璃珠表面上抗體結合的概率更大。在兼顧便于抗體固定化操作和元件通透性好的前題下，本發明選用了直徑為0.6mm-1mm的玻璃珠。
本發明上述兩種元件當中使用的尼龍膜和玻璃珠固相載體表面，需要進行修飾，對于修飾方法的選擇，我們考慮了如下因素本發明采用孔徑為3μm和5μm的尼龍膜(購于美國的PallCorporation)。根據現有技術報道，可供選用的尼龍膜有兩種，一種表面帶有羧基(C膜)，另一種帶有胺基(B膜)，帶有羧基的需用碳二亞胺活化，與抗體形成-CONH-酰胺鍵的共價連接。而帶有胺基的尼龍膜可用戊二醛法與抗體生成亞胺結構-CH＝N-的共價鏈接，此不飽和鍵可用NaBH4或NaCNBH3還原，生成-CH2-NH-，這種飽和鍵要穩定的多。發明人在實驗中對兩種膜的兩種抗體固定化方法進行了研究，結果表明，在控制好實驗條件的情況下，二者均能有效用于檢測體系。由于本發明使用堿性磷酸酶體系，檢測工作的pH值為9.8，且在檢測過程中需用pH為3-3.5的三氯乙酸洗液漂洗膜片，在這樣的酸、堿性條件變化下，通過酰胺鍵而形成的抗體鏈接在操作方法不當時可能會水解或部分水解。比如，發明人在實驗中發現，在用三氯乙酸洗液漂洗膜后，如果接下來在流路內直接泵入pH為9.8的底物緩沖液，就會出現酰胺鍵的水解，而當在這兩個步驟之間加一個pH為7.2的PB緩沖液的泵入操作后，就可避免酰胺鍵的水解。
對于玻璃珠，本發明先進行了胺基化，使玻璃珠表面帶有可利用的胺基，后面可用戊二醛法鏈接抗體，不過需用一個較長的連接臂(linker)，如2HN-PEG-NH2分子量為3400，這樣可減少抗體與抗原結合的空間位阻，也可增加抗體的活性。另外一個不用戊二醛的方法是用半氧化狀態的葡聚糖(分子量約為4000)法，在這個分子上有豐富的醛基，可直接與抗體和玻璃珠的胺基結合，然后再用還原劑(NaCNBH3)還原，從而使抗體和玻璃珠共價偶聯。關于這方面的方法技術參見Biotechnol.Bioengineering，24，1069-1080；J.Biochem.Biophys.Methods 45(2000)211-219；Applied and Environmental Microbiology.Mar.2001.p.1300-1307.
除此之外，還可利用Pall Cooperation的另一種載體膜ImmunodyneABC Membrane，這種膜可直接在其表面在中性pH值下以共價方式固定化抗體，非常方便。總之，膜和玻璃珠表面的修飾及抗體的固定化方法已相當成熟，可方便地運用于生物傳感器元件的制作中。
上述元件當中的兩種免疫載體表面，在檢測過程當中會出現非特異吸附現象。因此，需要對免疫載體表面的非特異吸附進行處理。本發明采用漂洗的方法進行處理，目的是去除免疫載體表面的非特異性吸附。
同ELISA方法一樣，酶結合物的非特異吸附會有嚴重的干擾作用，主要表現在引起假陽性結果。因此在免疫學檢測中，一般采用封閉的方法來防止非特異吸附。同樣，采用尼龍膜和玻璃珠為載體的免疫學檢測也存在這個問題。采用傳統的BSA封閉的方法，在PBS漂洗液中加各種表面活性劑Tween、Triton以及脫脂奶粉封閉等，都沒能有效去除非特異吸附。經分析，如果采用常規封閉膜方法，在用于流動液路中時，其封閉效果會受到很大影響。一方面流動相的反復運動對膜的作用不均衡，可能使吸附在膜和玻璃珠表面的封閉劑脫落下來。另一方面，用于檢測中的各種溶液的pH值也會變化，這都可能導致封閉劑的脫落。在這種情況下，尋找一種有效的非特異去除方法是必須的。
本發明在抗體的固定化中使用了共價結合的方法，所以單純的物理方法不會洗掉抗體。同時，抗原抗體之間的結合也是非常牢固的，一般的漂洗方法也不能使它們拆分，在這個前提下，本發明從漂洗而非封閉的角度來去除非特異吸附。
下面是本發明的一種漂洗方法，其出發點是找到一種材料和一個相應的pH值范圍，在這個pH值范圍之內，抗原抗體的結合不被拆分，而非特異吸附引起的結合作用可以被破壞掉，從而去除非特異吸附。經一系列試驗表明，三氯乙酸在一定條件下能滿足這一條件。具體方法是配制PB溶液，濃度為30mM，pH為7.2，在其中加入三氯乙酸，使其濃度達到0.6-1M，然后調pH值至3-3.5(抗體固定化載體不同，pH值稍有變化)，即可用作兩種載體的漂洗液。三氯乙酸的作用是在一定pH值下改變非特異吸附蛋白的帶電性質，從而使其沉淀下來。
本漂洗方法對兩種免疫載體都適用。實施例2是對此漂洗液是否有效去除了非特異吸附的驗證實驗。
如前所述，現有技術中采用尼龍膜在對實際樣品進行檢測時發生了堵塞現象(見B.C.Weimer，M.K.Walsh，C.Beer，et.al.，Solid-phase Captureof Proteins，Spores and Bacteria，Applied and EnvironmentalMicrobiology，Mar.2001，vol.67，No.3，1300-1307)。由于膜用于免疫元件中有其優點，如元件易于小型化、表面積與體積比高等，本發明在繼續采用膜為固定化抗體的前提下，為解決堵塞這個問題，本發明通過控制流過免疫膜的反應液和漂洗液的方向變換與流速，可避免濾膜的堵塞問題。具體過程為當免疫濾膜與正向流過的反應液反應時，如果有較大粒子雜質存在，則會吸附在膜的正面上。這樣，本發明可以控制漂洗液的方向由膜的背面向正向流，并且加大流速，如反應階段流速通常為幾百微升/分鐘，漂洗速度可為幾毫升/分鐘，則吸附堵塞在膜正面的雜質粒子就會被沖洗掉。同時，本發明采用大孔徑的膜(5微米)也有利于避免膜的堵塞。
下面以單探頭直接檢測炭疽芽孢為例，就本發明檢測設備的工作原理說明如下在檢測開始之前，反應池(敏感元件)3中有一針對炭疽芽孢的抗體膜(或玻璃珠元件)，當待檢樣品12由泵1輸送通過反應池3時，如果樣品中有炭疽芽孢存在，則與固定化抗體生成抗體-芽孢結合物，并就地結合在膜(或玻璃珠)的表面。經漂洗后，再由泵1將酶結合物14輸送通過反應池3，與膜上的抗體-芽孢結合物反應，生成抗體-芽孢-抗體-AP結合物。然后，用漂洗液6去除可能存在的非特異吸附，尤其是樣品中不含有芽孢時，酶結合物抗體-AP的非特異吸附會引起檢測結果的假陽性。下一步是泵1將底物α-萘酚磷酸鹽溶液輸送(圖1中方向向下)通過反應池3，如果有芽孢存在，則形成的抗體-芽孢-抗體-AP結合物上的AP催化α-萘酚磷酸鹽水解，產生α-萘酚，后者在通過電化學檢測器5時，在工作電位為+350mv下被氧化，并產生相應的電流，作為檢測信號。如果樣品中沒有芽孢，則不會形成抗體-芽孢-抗體-AP結合物，也就不會檢測到電流信號。
檢測中泵2的作用是自動配制底物溶液和標定檢測的本底值，這是本發明檢測儀器實現全自動化操作設計的一部分。這種設計的考慮基于底物以溶液狀態長時間存在有可能會發生自然水解，從而影響檢測的準確性。因此，本發明將設備設計為在儀器沒有工作的情況下，其底物樣品池儲存于低溫下，在執行檢測工作之前，隨時在檢測流路中接入底物樣品池(見圖12)。在檢測過程中由程序控制自動配制底物液。這種作用是通過泵2所在的循環體系來實現的。泵2在循環體系內工作時，將樣品池中的底物沖洗到底物緩沖溶液中，達到自動配制溶液的目的。在堿磷酶催化體系中，底物為α-萘酚磷酸鹽，其緩沖液為DB(二乙醇胺)溶液，pH為9.8。在混合前，20處只為底物緩沖液，在經過圖1中20-Y13-2-Y14-4-20的循環后，20處的底物緩沖液變成了底物溶液，即可達到混合底物液的目的。
另外，底物樣品準備系統也有預標定檢測本底的作用。即由泵2系統在檢測開始之前按泵1進行檢測工作時相同的流速標定一個底物溶液的本底電流值，標定時間為檢測前的一分鐘，標定流路為20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)。泵1停，泵2檢測馬上開始。在這個本底值之上的底物催化電流變化作為判定檢測結果的可靠依據。
本發明設備的全部流路管道內徑為0.8-1mm，這樣可以節約樣品的試劑量。采用高效微型泵替代蠕動泵，減小儀器的體積并提高自動化。各二、三通閥均為微型結構。
為了實現對多種微生物的同時檢測要求，可以設計多重組分的檢測方法，該方法可以通過將多種抗體固定于單一載體(如膜、玻璃珠)上來實現，也可以通過檢測設備的設計而實現，多重組分檢測的設計主要涉及以下幾種方案1、多種抗體固定于單一載體的方案如果檢測系統當中的載體是免疫膜元件，在其免疫膜上同時固定多種抗體(共價結合)，這樣當樣品中有一種或幾種抗原與膜上的抗體相對應，就會產生檢測信號。可選擇的制備方法有將多種抗體等量均勻混合，在同一條件下同時以共價形式結合到膜上去。(采用美國Pall Cooperation生產的ImmunodyneABC Membrane可方便地實現這一目的，因為這種膜可直接在其表面共價結合抗體而不需任何雙功能基團如戊二醛)。
如果檢測系統當中的載體是玻璃珠元件，制備方法有其特殊性。可將同一批玻璃珠分成若干份，每一份固定化一種抗體，然后每一種抗體的玻璃珠取相同數量進行均勻混合，裝入元件內即可。
在抗體的固定化過程中，固定化一種抗體和固定化幾種抗體的反應條件是完全一樣的。下述的實施例1描述了單一抗體的固定化過程，用與實施例1完全相同的方法，可以在其它玻璃珠表面固定化對應于其它待檢測抗原的抗體。制備好各種固定化抗體的玻璃珠后，均勻混合，即可制備含有多種抗體的玻璃珠元件。
關于尼龍膜的表面抗體固定化方法，參見文獻報道(Ihab Abdel-Hamid，Dmitri Ivnitski，Plamen Atanasov，Ebtisam wilkins，Flow-throughimmunofiltration assay system for detection of E.Coli 0157H7，Biosensors & Bioelectronics 14(1999)309-316.)。關于玻璃珠的抗體固化方法，參見本發明的實施例1。
2、單通道多探頭方案為了實現對多種微生物的同時檢測和適應抗體活性滿足多次檢測的要求，本發明還涉及了可以設計多重組分的檢測方法，其方案之一是單通道多探頭方案。
如圖6所示，21、22、23、24為四個免疫檢測元件(以膜元件為例)，每一個三通閥有一個公共端。圖中，各三通閥的端口方向如下Y16與25相連的左端為公共端；Y18與Y16相連的一端為公共端；Y19與Y18相連的一端為公共端；Y21與Y19相連的一端為公共端；Y23與26相連的左端為公共端；Y17與29相連的一端為公共端；Y20與30相連的一端為公共端；Y22與31相連的一端為公共端；25、26為替換圖1中生物敏感元件3的兩個流路接口。29、30、31、32為四個小三通，內徑為0.8mm。
通過控制各三通閥的開關和走向，可以控制和選擇檢測時流路的走向，因此能夠對其中任一或全部元件進行操作而不互相影響。流路控制舉例如下溶液通過全部元件時的流路順序是-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-；檢測21時的流路順序是-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；檢測22時的流路順序是-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-；檢測23時的流路順序是-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-；檢測24時的流路順序是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-Y22-31-24-Y23-26-；溶液不通過任何元件時的流路順序是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；
雖然圖6中所示為四個探頭，根據需要可相應增加為四個以上，如八個或更多。每個檢測探頭是可更換的。下面的說明也以四探頭膜元件為例。這種設計在檢測中的應用說明如下(1)用于檢測一種明確的目標分析物(如炭疽芽孢)在這種使用情況下，21、22、23、24四個元件上都固定有同一種芽孢抗體，則四個元件至少可完成四次相同的檢測工作，同時這種設計解決了多次使用中單一元件的抗體活性容易降低的問題。各元件上的抗體是以干態形式存在于固相表面上的，所以它在常溫下保持活性的時間要長得多(非工作狀態下存放于冰箱內)。
(2)用于檢測一種或一種以上可疑的分析物(如某一種生物恐怖試劑，可能為炭疽、鼠疫、天花和土拉中的一種或幾種)這種用途可有兩種實現方式，一種是在多探頭設計中的每個元件上固定化一種抗體，如四探頭上固定四種抗體(如分別對應于炭疽、鼠疫、天花和土拉)，在檢測時依次進行分別的檢測。
另一種方式是，在第一個元件上固定化多種抗體，比如21上面同時有三種微生物的相應抗體，而22、23、24上分別有對應于炭疽、鼠疫、天花的一種抗體。在進行檢測時，如果元件21給出陽性結果，則說明存在可疑微生物，則繼續檢測22、23、24三個元件，進一步確認是哪一種。同樣，這種檢測功能可以擴展，比如檢測八種分析物。
單通道多探頭設計比較適用于檢測情況下的應用，而對于有監測需要的場合，則需進一步設計雙通道多探頭的設備。
3、雙通道多探頭設計本發明多重組分檢測方法的另一種方案是雙通道多探頭方案。如圖7所示，在圖6的基礎上進行擴展設計，其左右兩側與圖6的結構完全相同。圖中53、54為溶液的出入口，Y40和Y41為兩個三通，它們與53和54相連的一端為公共端，在檢測時，可隨時改變流路內溶液的走向，即可在左右兩套檢測體系間進行轉換。其中33、34、35、36、43、44、45、46為八個檢測元件，Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30、31、Y32、Y33、Y34、Y35、Y36、Y37、Y38、Y39為三通閥。37、38、39、40、41、42、47、48、49、50、51、52為小硬三通。各三通閥的端口方向是右側四個與圖6中完全相同，左側各閥的端口方向與右側成鏡像對應關系。
用于監測時，右側的33、34、35、36四個元件都為多種抗體膜(或玻璃珠)，比如，它們上面都有四種對應于不同抗原的抗體，且四個元件相同。左側的四個元件43、44、45、46為單一種類抗體膜，每一種元件對應一種抗原。
這套系統用于監測的工作原理是右側的四個元件依次連續工作，對外部采集送來的樣品進行連續檢測，當檢測到陽性信號后，馬上啟動左側檢測系統，進一步分析確認是哪一種或幾種抗原。因此，從功能上看，這套系統的右側起到報警的作用，左側為檢測的作用。
用于監測時，檢測器連續自動工作的持續時間很重要，這種設計正滿足了這種要求。檢測順序為由33至36，如果以每個元件上的抗體活性只能滿足一次檢測為準，則無需更換元件就能完成四次檢測，監測時間大大延長。
本發明上述多探頭設計的實際應用過程，類似于下述實施例5的多探頭循環底物增強信號檢測模式操作過程，每一步都涉及各泵、閥的開關轉換，由程序自動控制進行。例如，如圖7所示，在執行監測任務時，一種含有未知細菌的樣品被采集送到此檢測器樣品池，此時34號元件執行檢測任務，于是可進行以下檢測步驟泵1工作，將樣品泵入并通過34號元件，樣品中的未知細菌與元件上的對應抗體結合，再與酶結合物作用后，形成Ab-Ag-Ab-AP夾心結構，與底物作用后，產生的催化水解產物在電化學檢測器上氧化，產生電流信號，儀器報警，并啟動左側的檢測體系。左側的四個元件依次檢測樣品，結果發現只有元件45(假設為炭疽抗體元件)有響應信號，則可斷定樣品中有炭疽芽孢。其實，這種設計在應用上是很靈活的，比如用于七種分析物的檢測在元件33上固定化有七種抗原的抗體，34、35、36、43、44、45、46上分別有對應七種不同抗原的抗體，則這種設計可檢測七種不同的抗原。
當圖7中兩側通道上的元件個數分別增加到八個時，完成一次連續監測的時間又增加一倍。以一個小時提供一個監測結果為準，則此檢測器可完成八個小時的連續自動監測任務。
本發明還對監測器的檢測信號放大進行了設計，目的在于從流路設計和操作方式上提高檢測靈敏度。主要有三種途徑一是延長底物溶液與酶作用的時間，增加催化水解產物的濃度，從而提高電化學電極上氧化電流的強度。這種作用的實現是通過泵1所在的左側循環體系來實現的(見圖1泵1-Y5-3-0-Y7-Y6-Y1-泵1)。反應池3敏感元件上的堿性磷酸酶AP(即Ab-Ag-Ab-AP結合物上的AP)不斷地催化底物分解，時間越長，循環次數越多，流路中固定體積溶液內產生的催化水解產物濃度越高，從而起到放大檢測信號的作用。
第二種途徑是延長樣品溶液與抗體膜作用的時間。這種方式比較適用于樣品量少的情況，在這種情況下，提高樣品中待檢測抗原與固定化抗體的結合率是提高檢測靈敏度的關鍵。于是對固定體積的樣品溶液反復循環通過抗體元件，盡可能多地將有限體積溶液內的抗原結合到抗體膜上。這個過程對應于Ab-Ag-Ab-AP夾心結構中Ag的量增加后，AP的量也相應增加。由于酶量增加會提高底物水解速度和水解產物的量，其結果是水解產物的濃度增大，因此起到放大信號的作用。此過程對應的循環是通過泵1所在的右側流路體系來實現的(見圖1)，為泵1-Y1-Y4-12(菌樣)-Y11-Y10-O-3-Y5-泵1。
第三種途徑是針對待檢測抗原濃度低而溶液量又較大的樣品(比如100ml，100cell/ml)，采用濾膜在流路內過濾富集檢測物的方法。具體操作是在與樣品12和Y4之間加一個大孔徑(8μm)濾膜過濾器(圖1中沒有標出)，同時在Y11與12之間加一個小孔徑(如0.22μm)濾膜過濾器(圖1中沒有標出)，檢測樣品溶液從Y4進入流路，流經路線(逆時針方向，見圖1)樣品12-大孔徑過濾器-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-10-Y11-小孔徑濾器-waste。在這個過濾操作中，樣品溶液沒有經過反應池3。這樣設計的出發點是在泵1高速運轉(7ml/min)下，流路內溶液的快速流動不利于固定化抗體與抗原的結合，同時，如此大量的樣品溶液也容易在抗體膜上積累雜質吸附物，從而影響抗體的活性。因此，采取過濾的方法將樣品溶液中的待檢測物首先快速富集在小孔徑濾膜過濾器上，然后再用少量PBS(如5ml)溶脫下來并緩速(如0.5ml/min)通過反應池3，使樣品中的抗原與固定化抗體高效地結合。
這種操作方式的好處是，即使樣品溶液量很大，分析物濃度很低，也會得到快速而靈敏的檢測。
上述三種信號放大途徑可根據需要結合并用。
本發明檢測設備樣機能自動進樣、自動檢測及自動清洗流路。為了實現便攜0，進行了直流(電池)和交流兩種電源設計。
設計檢測樣機的尺寸為43cm×40cm×35cm。該檢測器完成一次檢測任務的設計時間為30分鐘。
如圖13所示，其主要結構和功能如下1)試劑、樣品區此部分有7個試劑瓶，體積各為250ml，分別為樣品、PBS、洗液、酶結合物、去離子水、底物緩沖液(DB)以及用于配制底物液的底物緩沖液(DB)。它們通過流路管道與檢測系統相連。
2)流路檢測系統見圖1的設計結構，所有的泵、閥以及檢測器等都布置在一個面板上面。對于多探頭的應用，圖6和圖7的結構分別設計在另兩個獨立面板上，在需要時替換圖1中的檢測器3。替換時，這二塊面板的支腳插于圖1面板上，并位于它上層。如圖14所示。
3)恒電位儀可以從市場上購買，如江蘇江分電分析儀器有限公司生產的小型CH-1型恒電位儀(2mA-1PA)。其作用是在檢測中設定工作電位，并用于測量電流-時間曲線。
4)可編程控制器可以從市場上購買，如采用松下電工生產的可編程控制器，型號為FPO，經擴展后，可進行32路控制。在檢測中，可以對所有泵、閥等的開關、轉換進行自動控制。
5)電源可以從市場上購買，如朝陽電源廠生產的型號為4NIC-K48的產品。可提供12、24伏直流電，用于驅動所有的部件。
6)數據采集器主要完成數據的采集工作。同時外加通迅功能。
7)控制面板和顯示器可進行參數和指令的輸入操作。可進行聲光報警。
8)計算機接口可與電腦相連，用于測試中控制程序有關參數的修改和設定。
9)直流電源為滿足便攜和無交流電源的場合。
10)廢液瓶回收由8，10，11，15，18排出的廢液。體積為500ml。
本檢測器在使用上便于操作，操作者無需具備較深的專業知識，檢測過程中只需準備樣品和選擇檢測模式即可使用。
利用本發明監測器進行檢測，設計了四種檢測模式，根據檢測目的的不同，可以選擇以下不同的檢測模式1、直接檢測模式這種檢測方式無信號放大過程，直接將底物通過敏感元件進行檢測。主要適用于含有較高濃度分析物的樣品。其實施過程見實施例3。
2、循環底物增強信號檢測模式這種檢測方式只是在直接檢測的基礎上增加了一個信號的放大操作，在圖1右側的“1-Y5-3-0-Y7-Y6-Y1-泵1”循環體系內，延長底物液與敏感元件上AP作用的時間，提高催化水解產物的濃度，主要適用于含有待檢測物濃度低或量少的樣品。詳見實施例5。
3、樣本富集直接檢測模式這種檢測方式與直接檢測方式基本一樣，只是多了一個樣品的富集過程。這種方式適用于樣品量較大而待檢測物濃度又較低的樣品，將大量的樣品溶液通過敏感元件，其中的待檢測物就會較多地結合在敏感元件上。再一個是適用于樣品量較少的情況，通過反復循環，提高有限量樣品內待檢測物的結合率。這兩種方式都可以實現放大檢測信號的作用。
4、樣本富集與循環底物增強信號檢測模式這種檢測方式是對前兩種放大檢測方式的結合運用，是一種雙重放大響應信號的檢測過程。也就是在對樣品進行富集之后，再加上一個底物的循環過程。這種檢測方式適用于樣品內待檢物的量極少的情況。
這四種檢測模式在使用時，可根據實際情況進行靈活選擇和綜合運用。
另外，每個檢測模式中應有一個流路的檢測后清洗程序，每一個檢測循環進行一次。可分為兩種情況，一為連續檢測之間的流路清洗，避免上一次檢測中在流路管道內的殘留物影響下一次的檢測。二為檢測任務結束后的徹底清洗，這些過程都由程序自動控制來實現。
本檢測系統的設計在應用上具有靈活性，除了可以通過改變相關的操作來完成各種生物靶分子的檢測之外，還可以通過改變酶催化體系而用于其它分析物如含磷化學毒劑、含磷農藥等的檢測，兼用作生物、化學分析物檢測的平臺。方法原理舉例將膽堿酯酶(acetylcholine esterase(AChE))固定于載體膜或玻璃珠上，用氯乙酰硫膽堿(acetylthiocholine chloride(ATCh))作為催化底物，在前者的催化下，后者水解生成硫膽堿(thiocholine)。待檢測的含磷化合物為膽堿酯酶的抑制劑，它濃度的大小和量的多少與膽堿酯酶催化活性的降低程度成正比，而膽堿酯酶活性的降低將導致水解產物硫膽堿的相應減少，因此，含磷化合物與硫膽堿的生成量有直接的對應關系。硫膽堿是一種電活性物質，可直接用電化學方法檢測它在工作電極上的氧化電流變化[參考文獻見Sensors andActuators，79(2001)48-57]，也可用間接的方法，即，電化學活性催化水解產物硫膽堿也可先經K3[Fe(CN)6]氧化生成K4[Fe(CN)6]，然后再在電位+0.3V下檢測[Fe(CN)6]-4在工作電極上氧化生成[Fe(CN)6]-3的電流信號，，從而檢測含磷化合物的有無及多少[參考文獻Biosensors & Bioelectronics15(2000)323-329]。檢測步驟與下述硫膽堿檢測方法基本相同，只是在其中的(1)和(3)中分別增加一個這樣的電化學活性底物的轉換過程。
用我們所設計的檢測系統進行有機磷毒劑和農藥的檢測時，在操作上較微生物檢測更為簡便，所利用的檢測設備資源也可根據需要相應地減少，或者說可以在檢測系統圖1的基礎上進行重新更為簡單的設計。由于是直接對底物進行催化，所以檢測步驟也大為減少，從而降低了成本，也加快了檢測的速度。
以直接電化學信號檢測過程為例，其檢測過程大致可分為三步1)標定一個本底催化檢測信號值，即在pH為7.5(此pH下膽堿酯酶活性最高)的pB(0.1M)液中加入一定濃度的底物，在經過元件時，水解生成硫膽堿，后者在經過電化學電極時在電位0.7V下被氧化，產生可以檢測的電流信號。2)用一定體積的含磷化合物樣品溶液通過此元件，此步將降低固定化酶的活性。3)重復步驟1)的過程，得到一個酶活性降低后的催化電流值，然后與步驟1)的電流值比較，根據電流變化的大小計算出磷化合物的濃度。
另外，通過液路和多探頭的合理分配，此檢測設備可同時具備用于微生物和化學毒劑檢測的功能。比如多探頭中的一部分接入固定化抗體元件，另一部分接入膽堿酯酶元件，液路中配齊兩檢測體系所需的各種溶液，就可完成雙重檢測任務。
另外，還可將DNA探針、PNA探針以及適配子(aptamer)共價結合在本發明的兩種固相載體其表面上，以用于相關目標微生物和靶分子的檢測。
本發明與現有技術相比具有以下幾個方面的優點1、本發明的檢測方法已經實現儀器化和自動化。而現有技術只是搭建了一個簡單的半自動化的檢測裝置。
2、本發明在設計免疫電化學傳感器結構時，將生物敏感元件與電化學檢測器分離設計，如圖1所示，反應池3(中間深色為生物敏感元件)與檢測器5(電化學電極)是彼此分離的。而現有技術中，二者是緊密結合在一起的。
分離式設計的好處是(1)可以對生物敏感元件單獨進行反應、漂洗等操作，從而避免這些操作過程影響電極本身的穩定性。反應液中的某些成分有可能影響電極的性質(如鈍化)，所以分離式設計可以避免這一點。
(2)要實現多探頭、多通道設計，如果繼續采用傳統生物傳感器中生物敏感元件與換能器(電極)緊密結合的設計方式，就必須有相同多的免疫電化學生物傳感器，比如八通道，就要有八個免疫電化學生物傳感器，八個檢測器上的八套電極引線(每套三根)也需要相應匹配的恒電位儀，流路設計上也變得復雜，結果是成本升高，技術上難以實現。同時，生物敏感元件的更換變得困難。
而采用分離式設計，只需一個電化學檢測器，一個恒電位儀，就可滿足多通道檢測的要求。
本發明的這種設計帶來的好處是大大擴展和提高了檢測器的功能和性能，這種設計方法是對傳統生物傳感器概念的一個突破。
3、本發明優化了用于檢測的酶催化體系。現有技術采用的是辣根過氧化物酶(HRP)催化過氧化氫氧化碘化鈉生成碘分子的催化體系。由于在沒有HRP催化的情況下，過氧化氫也很快氧化碘化鈉生成碘分子，這套催化體系不穩定。而本發明采用的AP催化體系中的α-萘酚磷酸鹽則相當穩定。
4、本發明采用了放大信號的流路設計和操作方式，提高了檢測靈敏度，所以在檢測原始樣品方面更具優勢。
5、本發明實現了底物樣品混合的自動化。
6、本發明實現了同時檢測多種分析物的設計。
7、本發明解決了檢測器中抗體活性問題(可更換的多探頭設計)。
8、本發明解決了現有技術中膜易于堵塞的問題。
9、本發明解決了流路中固相載體上非特異吸附的問題。
10、本發明檢測系統的設計在應用上具有靈活性，除了可以通過改變相關的操作來完成各種生物靶分子的檢測之外，還可以通過改變酶催化體系而用于其它分析物如含磷化學毒劑、含磷農藥等的檢測，兼用作生物、化學分析物檢測的平臺。
上述各種技術和方法的應用，為微生物和其它目標分子檢測器的實用化奠定了基礎。
圖面說明圖1是本發明檢測設備的檢測流路系統設計圖；圖2是本發明檢測設備所采用的泵的剖面圖；圖3是本發明檢測設備所采用的泵的實物圖；圖4是本發明檢測設備所采用的二通閥和三通閥的實物圖；
圖5是各三通閥的安裝方位圖；圖6是本發明多探頭檢測設備的單通道四探頭設計圖；圖7是本發明多探頭檢測設備的雙通道多探頭設計圖；圖8是本發明檢測設備所用膜元件及其結構分解圖；圖9是本發明檢測設備所用玻璃珠元件及其結構分解圖；圖10是本發明檢測設備所用電化學電極檢測器的結構示意圖；圖11是本發明檢測設備所用電化學電極檢測器的結構分解圖；圖12是本發明檢測設備所用底物樣品池及其結構分解圖；圖13是本發明檢測設備樣機效果簡圖；圖14是本發明檢測設備當中多探頭與單探頭的結構位置關系圖。
具體實施例方式
實施例1 玻璃珠的炭疽芽孢抗體的固定化選取直徑為1mm的玻璃珠(中性)5g，裝入20mm的試管內，加入分析純硝酸(68％)至正好沒過玻璃珠，在恒溫水浴中100℃下加熱1h，然后洗凈。此步的目的是為了洗凈玻璃珠的表面，同時也為了在玻璃珠表面生成大量的-OH基團。
將上述玻璃珠和10％的APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)溶液(pH調至4)加在一起，在70℃的水浴條件下，反應3個小時。然后棄去溶液，將玻璃珠在110℃下干燥過夜。用去離子水洗凈后，再在80℃烘箱內干燥過夜。此步在玻璃珠表面生成-O-Si-(CH2)3-NH2基團。
在玻璃珠表面生成-NH2后，采用戊二醛共價偶聯法偶聯抗體。戊二醛的濃度為2.5％(0.03MPBS溶液，pH7.0)，室溫下與玻璃珠反應1h，在溶液中加入NaCNBH3(10mg/ml)還原西佛堿(Schiff base)-NH1＝CH1-(CH2)3-CHO，生成飽和的-NH2-CH2-(CH2)3-CHO，而醛基不被還原。
配PEG-ab(兩端帶有3-氨基丙基的聚乙二醇，平均分子量3350)PBS溶液為30mg/10ml，加入漂洗后的上述玻璃珠，室溫下反應1h，再用NaCNBH3還原。漂洗后，再與戊二醛反應，條件同前。然后再用NaCNBH3還原。此步引入連接臂(Linker，即PEG-ab)，提高固定化抗體與樣品中待檢測抗原結合的靈活性和有效性。
上述玻璃珠漂洗后，加入到含有兔抗炭疽芽孢IgG的溶液中(0.5ml的PBS中加入15μl濃度為23mg/ml的兔抗炭疽芽孢IgG溶液而得)，室溫下反應1h，同樣用NaCNBH3還原，漂洗后，放于4℃下保存。
上述所用的linker可以有很多種，如采用半氧化狀態的葡聚糖(分子量約為4000)，在這個分子上有豐富的醛基，可直接與抗體和玻璃珠的胺基結合，然后再用還原劑(NaBH4)還原，從而使抗體和玻璃珠共價偶聯。
在抗體的固定化過程中，IgG的純度和效價應足夠高，這樣才能保證固定化抗體的活性。
實施例2 漂洗液去除非特異吸附的驗證實驗首先，取一張空白尼龍膜(孔徑5微米)，放入圖5的膜元件中，然后將此元件接在蠕動泵流路管的一端。用新買來的山羊抗兔IGg的堿性磷酸酶結合物配制樣品，取5微升加入2ml的PBS(0.1M，pH＝7.4，NaCl0.15M)中，然后在泵的作用下，將此溶液以流速為1ml/min的速度全部流過膜片，進完此樣品后，再用PB液(pH7.2，0.03M)以流速5ml/min的速度進行漂洗5分鐘，結果表明，溶液中的山羊抗兔IGg的堿性磷酸酶結合物幾乎全部吸附在膜的表面。證明方法是在蠕動泵流路的出液口端以每30秒一次的頻率進行采集樣品，然后與取出的膜片一起分別加入底物PNPP，進行顯色反應，結果只有膜片很快顯示黃色，而其它幾個液體樣品均不顯色。說明存在嚴重的非特異吸附，同時用PB液無法漂洗掉非特異吸附的酶結合物。
然后，證明三氯乙酸漂洗液的有效性。重復上面的實驗過程，各條件都不變，只改變PB液為三氯乙酸漂洗液(0.6M，pH3.5)，用它洗3分鐘后，再用PB(pH7.2)液洗3分鐘(此步的目的是使膜片所處的環境回到中性的緩沖溶液狀態，以利于酶活性的恢復。在pH＝3.5下，酶活性受到擬制)。對取出的膜片進行顯色，結果表明非特異吸附去除得很徹底，在2個小時沒有觀察到的黃色出現。
進一步進行如下實驗，以說明三氯乙酸漂洗液沒有使酶活性喪失以及沒有使檢測中形成的固定化抗體-抗原-抗體夾心結構破壞。先在膜的表面將抗體以共價方式結合上去，然后與含有芽孢的樣品在流路中反應，再與酶結合物反應，用三氯乙酸漂洗液漂洗后，經PNPP顯色，在十分鐘時可觀察到明顯的黃色。
由于三氯乙酸漂洗液是在pH為3-3.5較低的情況下達到較好的漂洗效果的(pH值高于4時，漂洗效果不好)，本發明進一步進行了如下對比實驗，以說明pH值不是去除非特異吸附的主要原因，先用鹽酸直接將上述的PB液(pH7.2，0.03M)調至pH值為3.5，再用檸檬酸和檸檬酸鈉(濃度為0.6M)調配成一個pH值為3-3.5的緩沖液，然后用這兩個溶液分別替代上述第一步中的PB并重復漂洗實驗，結果顯示二者皆無法有效去除非特異吸附，取出的膜片在底物PNPP中都很快顯色。
因此，三氯乙酸漂洗液的良好漂洗效果應該是在此pH值下三氯乙酸分子與非特異吸附酶結合物(為一種蛋白)發生了特定的作用所致，可能主要是改變了非特異吸附蛋白的帶電性質所致。
實施例3 炭疽芽孢的單探頭直接檢測如圖1所示，反應池(敏感元件)3中有一針對炭疽芽孢的抗體膜(或玻璃珠元件)，在檢測開始之前，先由泵2系統在檢測開始之前按泵1進行檢測工作時相同的流速標定底物溶液的本底電流值，標定時間為檢測前的一分鐘，標定流路為20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)，泵1停，泵2檢測馬上開始。將待檢樣品12由泵1輸送通過反應池3，如果樣品中有炭疽芽孢存在，則與固定化抗體生成抗體-芽孢結合物，并就地結合在膜(或玻璃珠)的表面。經漂洗后，再由泵1將酶結合物14(含有堿性磷酸酶AP標記的芽孢抗體反應液)輸送通過反應池3，與膜上的抗體-芽孢結合物反應，生成抗體-芽孢-抗體-AP結合物。然后，用漂洗液6去除可能存在的非特異吸附。進一步由泵1將底物α-萘酚磷酸鹽溶液輸送通過反應池3，如果有芽孢存在，則形成的抗體-芽孢-抗體-AP結合物上的AP催化α-萘酚磷酸鹽水解，產生α-萘酚，進一步通過電化學檢測器5，電化學監測器的工作電位為+350mv，α-萘酚在此電位下被氧化，并產生相應的電流，生成檢測信號。記錄儀等開始記錄并處理數據。
實施例4 單探頭循環底物增強信號模式檢測本實施例中帶下劃線‘—’的部分為流路中導通的標志。以下所有步驟中，Waste表示廢液的出口方向，“底緩”代表底物緩沖液。泵正轉方向在圖1中對應向上。反之亦然。如圖1所示，按照下述步驟順序進行檢測1)開機預熱1分鐘。此時流路內有去離子水(上次使用后所注入)。
去離子水的作用是保持流路內無干擾性電解質，同時也是為了儀器在儲存過程中免于腐蝕。
2)泵1工作并反轉，PBS注入流路系統。
PBS流經路線PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-0-I5-Y9-Y10-Y11-wastePBS的作用是使流路內處于有利于抗原抗體反應的環境。
3)泵1工作并正轉，菌樣流經路線waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-菌樣樣品內待檢測物(如芽孢)與固定化抗體發生結合作用的過程。
4)PBS漂洗，泵1反轉。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste5)進抗體酶結合物(Conjugate)。泵1正轉，路線為waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-conjugate酶標記抗(Ab-AP)與固定化載體上Ab-Ag發生結合作用的過程。
6)用漂洗液漂洗，泵反轉泵1反轉，洗液流經路線洗液-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步去除可能的非待異吸附。
7)PBS漂洗，泵1反轉。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步恢復有利于標記酶催化活性的溶液環境，因為在前面的漂洗液中酶的活性受到擬制。
8)進底緩排氣泡泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-waste9)進底緩泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-Y12-18waste
10)進底緩泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-Y7-Y6-waste11)排可能存在的氣泡泵1正轉，底緩-Y9-I5-3-Y5-1-Y1-Y15-Y2-Y3-waste9)、10)11)、12)幾步的操作的安排是為了清除流路內前幾步反應時留下的干擾物，同時使其處于有利于酶催化底物水解的底物緩沖液(DB，pH9.8)環境。
12)泵反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-waste此步操作是進底物溶液。同時將由進底物時帶來的氣泡從Y5處排出，以避免進入反應池。
13)泵反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste目的是為了使Y7-o-3-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環內充滿底物溶液。
14)泵正轉，Y7-o-3-Y5-1-Y1-Y6-Y7內底物液循環。
15)檢測泵1反轉，泵2停止工作(泵2體系在泵1體系進行工作時，也在進行底物樣品的混合工作，并且在檢測開始之前進行了本底的標定)底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-3-Y12-5-18waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數據，如有陽性檢測結果，則進行報警。
在上述各步中，流速和時間是根據需要進行設定和變化的。
實施例5 多探頭循環底物增強信號模式檢測如圖1和圖6所示，待檢樣品中可能有ABCD四種細菌中的一種或幾種，圖6中四個元件上分別固定化有相應的四種抗體。每一個元件的檢測之前有一個泵2系統標定本底的過程，即由泵2系統在檢測開始之前按泵1進行檢測工作時相同的流速標定一個底物溶液的本底電流值，標定時間為檢測前的一分鐘，標定流路為20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)。然后按照下述步驟進行檢測，其中帶下劃線‘—’的部分為流路中導通的標志，以下所有步驟中，Waste表示廢液的出口方向，“底緩”代表底物緩沖液，泵正轉方向在圖1中對應向上，反之亦然。在1)-11)步驟中，-(25-26)-代表溶液通過圖6中全部元件，即-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-。檢測步驟如下1)開機預熱1分鐘。此時流路內有去離子水(上次使用后所注入)。
2)泵1工作并反轉，PBS注入流路系統。
PBS流經路線PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste3)泵1工作并正轉，菌樣流經路線waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-菌樣4)PBS漂洗，泵1反轉。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste5)進Conjugate。泵1正轉，路線為waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-conjugate6)用漂洗液漂洗，泵1反轉，洗液流經路線洗液-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste7)PBS漂洗，泵1反轉。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste8)進底緩排氣泡泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-waste9)進底緩泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y12-waste10)進底緩泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste11)排氣泡泵1正轉，底緩-Y9-I5-(25-26)-Y5-1-Y1-Y15-Y2-Y3-waste上面的1)-11)步與實施例1所述的單探頭循環底物增強信號檢測模式檢測中的對應步驟完全一致。不同是用多探頭替代了單探頭，而且圖6中的元件21、22、23、24在以上的1)-11)步驟中彼此相通(圖6中流路導通的各部分為-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-)，并進行了完全相同的反應和處理。經過上面的1)-11)步的過程，如果樣品中有ABCD中的一種或幾種細菌，則應該在相對應的抗體元件表面形成了Ab-Ag-Ab-AP結合物，以下則是對不同元件的分別檢測元件21檢測有反應，則報警。下述12)-15)步驟當中的-(21)-代表21檢測時的流路，在圖6中，對應通路為-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-，元件21的檢測步驟如下12)泵反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-waste此步是在反應池之前排除可能存在的氣泡。
13)泵1反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步使流路管道內充滿均勻的底物溶液。
14)泵正轉，Y7-o-(21)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環，提高催化水解產物的濃度。
15)檢測泵1反轉，泵2停止工作底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-Y12-5-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數據。
元件22檢測下述16)-20)的檢測步驟當中，-(21)-代表對上一次檢測流路的清洗，其對應于圖6的流路是-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路順序在圖6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(22)-代表元件22的檢測通路，圖6中對應于-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-，元件22的檢測步驟如下16)清洗上一次檢測的流路泵1反轉，泵2停止工作。
底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-Y12-waste17)泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste此步是為了漂洗圖1中的0-Y7部分，以保證流路內無殘留的干擾物，如上一次水解產物等。
18)泵1反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(22)-I5-Y9-Y10-Y11-waste19)泵正轉，Y7-o-(22)-Y5-Y1-Y6-Y7循環，20)檢測泵1反轉，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(22)-Y12-5-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數據。
元件23檢測下述21)-26)的檢測步驟當中，-(22)-代表對上一次檢測流路的清洗，其對應于圖6的流路是-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路順序在圖6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(23)-代表元件23的檢測通路，圖6中對應的流路連通部分為-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-。元件23的檢測步驟如下21)清洗流路泵1反轉，泵2停止工作，底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(22)-Y12-5-waste23)泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste24)泵1反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(23)-I5-Y9-Y10-Y11-waste25)泵正轉，Y7-o-(23)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環。
26)檢測泵1反轉，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(23)-Y12-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數據。
元件24檢測下述27)-33)的檢測步驟當中，-(23)-代表對上一次檢測流路的清洗，其對應于圖6的流路是-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路順序在圖6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(24)-代表元件24的檢測通路，圖6中對應的流路連通部分為-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-Y22-31-24-Y23-26-。元件24的檢測步驟如下27)清洗流路泵1反轉，泵2停止工作，底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(23)-Y12-waste28)泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste29)泵1反轉，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(24)-I5-Y9-Y10-Y11-waste30)泵正轉，Y7-o-(24)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循環，31)檢測泵1反轉，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(24)-Y12-5-waste此時，記錄儀等開始記錄并處理數據。
32)清洗流路泵1反轉，泵2停止工作，
底緩-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(24)-Y12-5-waste33)泵1反轉，底緩-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(24)-Y7-Y6-waste檢測結束。
權利要求
1.一種檢測目標微生物或其他靶分子的方法，其特征在于該方法是利用抗原抗體特異性結合的特點，首先用目標微生物或靶分子免疫動物，獲得抗體，將該抗體共價結合在固相載體表面上，當含有該目標微生物或靶分子的樣品溶液流過此抗體載體表面時，便與抗體結合，漂洗后，再與流過的含有一種催化酶標記的該目標微生物抗體的反應液作用，形成抗體-目標微生物-酶標抗體復合物，然后使含有該催化酶催化底物的溶液流過該固相載體表面，底物被該催化酶催化水解，生成的產物在電化學電極上在一定的電位下被氧化，產生相應的電流信號，通過檢測該電信號及其大小確定被檢測對象的存在及含量。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于所述的催化酶是堿性磷酸酶，其催化底物是α-萘酚磷酸鹽，底物水解產物α-萘酚在電化學電極上在一定的電位下被氧化，產生相應的電流信號，通過檢測其電流及大小確定檢測目標的存在及含量。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于所述的固相載體是尼龍膜和玻璃珠，其表面帶有用來以共價結合的方式固定化抗體或酶的胺基或羧基等活性基團。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于當含有用來形成夾心結構的抗體酶結合物溶液流過抗體載體表面并與抗體結合后，需要進行漂洗去除非特異性吸附，漂洗液當中含有三氯乙酸，其pH值為3-3.5。
5.根據權利要求3的方法，其特征在于當所說的固相載體是膜載體時，在檢測過程中所涉及的每一步漂洗過程當中，漂洗液的流向與在前的反應液流過固相載體膜的方向相反。
6.根據權利要求1的方法，其特征在于該檢測系統還可用于含磷毒劑和含磷農藥等的檢測，具體方法是將乙酰膽堿酯酶固定化到固相載體上，檢測步驟如下(1)使含有底物氯乙酰硫膽堿的溶液流過該固相載體，該底物在乙酰膽堿酯酶催化下水解生成的硫膽堿，在經過電化學工作電極時在0.7V電位下被氧化，產生可以檢測的電流信號，將其標定為本底值；(2)使目標檢測物溶液通過上述固相載體；(3)重復步驟(1)，檢測到另一個電流信號值，然后與步驟(1)的電流值比較，根據電流變化的有無及大小確定含磷化合物的存在及其濃度。
7.根據權利要求6的方法，其特征在于電化學活性催化水解產物硫膽堿也可先經K3[Fe(CN)6]氧化生成K4[Fe(CN)6]，然后再在電位+0.3V下檢測[Fe(CN)6]-4在工作電極上氧化生成[Fe(CN)6]-3的電流信號。
8.根據權利要求1的方法，其特征在于該兩種固相載體還可將DNA探針、PNA探針以及適配子(aptamer)共價結合在其表面上。
9.一種檢測目標微生物或其他靶分子的設備，其特征在于該設備包括兩個微型泵(1、2)、一個生物敏感元件(3)、一個樣品池(4)、一個電化學檢測器(5)、多個三通閥(Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15)、一個二通閥(I5)和一個四通閥(O)，生物敏感元件(3)的一端通過一個三通閥(Y5)與泵(1)相連，泵(1)的另一端與三通閥(Y1)相連，此三通閥(Y1)的其中一端連續連接四個三通閥(Y15、Y2、Y3、Y4)，為不同液體提供出入口，生物敏感元件(3)的另一端與一個四通閥(O)相連，該四通閥(O)的一端通過兩個三通閥(Y6、Y7)與泵(1)另一端的三通閥(Y1)相連，形成一個回路，上述四通閥(O)的另外兩端分別連接一個二通閥(I5)和一個三通閥(Y12)，此三通閥(Y12)的一端與電化學檢測器(5)相連，另一端通過一個三通閥(Y14)與泵(2)相連，泵(2)的另一端與一個三通閥(Y13)相連，此三通閥(Y13)的另外兩個端各自與底物緩沖液(19、20)相連，上述泵(2)另一端的三通閥(Y14)與樣品池(4)相連，樣品池(4)的另一端與底物緩沖液(20)相連，形成一個循環流路，上述二通閥(I5)連續連接三個三通閥(Y9、Y10、Y11)，以提供多個液體出入口，其中出入口(10)與Y10和Y11之間的小三通相連，通過三通(Y11)與出入口(11)相通將廢液排出，同時通過與12相連形成一個不經過反應池的泵1所在的第二個回路，出，同時通過與12相連形成一個不經過反應池的泵1所在的第二個回路，三通閥(O)相連的四通閥(Y7)的一端再連接一個三通閥(Y8)，以提供兩個液體出入口。
10.根據權利要求9所述的設備，其特征在于所說的電化學檢測器(5)由工作電極(W)、參比電極(R)和輔助電極(C)組成，形成一個流動電解質的電解池。
11.根據權利要求9所述的設備，其特征在于生物敏感元件(3)被四探頭或八探頭或多探頭檢測器所代替，多探頭數量的增加通過在四探頭或八探頭檢測器中加入一個或幾個免疫元件單元而實現，其中四探頭檢測器檢測器的一端(25)與三通閥(Y5)相連接，另一端(26)與四通閥(O)相連接，以替換生物敏感元件(3)，該四探頭檢測器由四個免疫檢測元件(21、22、23、24)和多個三通閥(Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23)組成，其中三通閥(Y16)與接口(25)相連的左端為公共端，另外兩端分別與免疫檢測元件(21)和三通閥(Y18)相連接，四個免疫檢測元件(21、22、23、24)之間各以小三通(29、30、31)相連接，其中免疫檢測元件(24)通過三通閥(Y23)與檢測器接口(26)相連接，此三通閥(Y23)的另一端與一個小三通(32)連接，而小三通(32)分別與另外兩個三通閥(Y21、Y22)連接，其中一個三通閥(Y22)與兩個免疫檢測元件(24、23)之間的小三通31連接，另一個三通閥(Y21)與三通(28)連接，三通(28)的另外兩個端口各自連接一個三通閥(Y19、Y20)，這兩個三通閥(Y19、Y20)相互連接，其中一個三通閥(Y20)與兩個免疫檢測元件(22、23)之間的小三通(30)連接，另一個三通閥(Y19)與三通閥(27)連接，三通(27)的另外兩個端口各自連接一個三通閥(Y18、Y17)，這兩個三通閥(Y18、Y17)相互連接，其中一個三通閥(Y17)與兩個免疫檢測元件(21、22)之間的小三通(29)連接，另一個三通閥(Y18)與三通閥(Y16)連接；八探頭檢測器的兩個接口(53、54)分別與兩個三通閥(Y40、Y41)連接，而這兩個三通閥(Y40、Y41)的另外兩端各連接兩個前面所述的四探頭檢測器，上述的接口(53、54)分別與檢測設備的三通閥(Y5)和四通閥(O)相連接，以替換生物敏感元件(3)，上述四探頭檢測器的四個免疫檢測元件(21、22、23、24)或八探頭檢測器的各個免疫檢測元件是可更換的。
12.根據權利要求9所述的設備，其特征在于所說的生物敏感元件有兩種膜元件或玻璃珠元件，兩種元件的內腔都呈雙錐形，以保持中間的膜和玻璃珠在流路內與溶液有較大的接觸面積，膜元件由帶有螺紋的有機玻璃罩(55)、有錐形孔的有機玻璃柱(56)、抗體膜(57)和底座(58)組成，抗體膜(57)放在內壁有一圈平臺的底座(58)內，有機玻璃柱(56)壓在膜的周邊上，有機玻璃罩(55)擰在有螺紋的底座(58)上，使有機玻璃柱(56)壓緊中間的膜(57)；對于玻璃珠元件，其部件底座(62)和帶有螺紋的有機玻璃罩(59)內都有一個內壁平臺，當下面的圓形不銹鋼網(60)放在底座(62)的平臺上后，放入圓形孔柱(61)，其下沿壓在底下的鋼網周邊部分，然后在圓形孔柱(61)的空腔內裝入玻璃珠(63)，上面蓋上第二個鋼網(60)，接下來蓋上有機玻璃罩(59)，有機玻璃罩(59)的螺紋擰到底座(62)的螺紋上，機玻璃罩(59)的平臺可產生一個向下的壓力，使各部件間相互壓緊在一起，兩種元件的設計外形尺寸一致，可以在流路的多探頭設計中互換。
全文摘要
本發明公開了一種檢測目標微生物和靶分子的方法及其檢測設備，該方法是利用抗原抗體特異性結合的特點，用目標微生物或靶分子免疫動物，獲得抗體，將該抗體共價結合在固相載體表面上，使含有該目標微生物或靶分子的樣品溶液流過此抗體載體表面與抗體結合，再與流過的含有一種催化酶標記的該目標微生物抗體的反應液作用，形成抗體－目標微生物－酶標抗體復合物，然后使含有該催化酶催化底物的溶液流過該固相載體表面，底物被該催化酶催化水解，生成產生的電流信號的產物，對該電信號進行檢測。本發明的檢測設備部件包括兩個微型泵(1、2)、一個生物敏感元件(3)、一個樣品池(4)、一個電化學檢測器(5)、多個三通閥(Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15)、一個二通閥(I5)和一個四通閥(O)，通過一定的連接關系相連。
文檔編號G01N33/535GK1484028SQ02130730
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月18日 優先權日2002年9月18日
發明者紀軍, 楊瑞馥, 紀 軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物