專利名稱：低密度脂蛋白膽固醇測定方法及試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種低密度脂蛋白膽固醇的測定方法及試劑。
眾多流行病學、遺傳學與臨床研究證明，血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與動脈粥樣硬化、冠心病(CHD)的發生率成正相關，通常以高含量低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)作為冠心病(CHD)的首要致病因素，所以，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定方法的準確性至關重要，現今臨床上常用的方法有Friedewaly公式化、化學沉淀法、電泳法、免疫分離法等，前兩中最常用，但測定中易受高甘油三酯和血清預處理產生的誤差影響。所以，研究一種標本用量少、測定簡便快捷、干擾少、高精確度和高準確度的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定方法和測定試劑適應自動化分析是十分必要的。
近年來，國內外也開發了一些在自動生化分析儀上使用的LDL-C直接測定試劑，其中，一些采用聚陰離子和二價金屬鹽復合物、糖化合物和二價金屬鹽復合物，如中國專利CN-1281981A公開了一種低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，它包括由α-磺化環狀糊精、硫酸葡聚糖、MgCl2、二氯苯酚、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N＇-琥珀酰乙烯二胺、3-(N-嗎啡啉)-2-羥丙基磺酸緩沖液組成的試劑I和由膽固醇脂酶(CEH)、膽固醇氧化酶(COD)和過氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚、3-(N-嗎啡啉)-2-羥丙基磺酸緩沖液組成的試劑II，這種低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，需要高濃度的二價金屬鹽(如鎂離子)，而這些二價金屬鹽和上述聚陰離子、糖化合物、非HDL脂蛋白形成的書絮狀復合物，而這些二價金屬鹽復合物，檢測完畢后被排泄，在排液管道中易與其他堿性廢液反應形成鹽而發生沉淀，造成管道堵塞，容易對自動分析儀造成不良影響及故障。
本發明的目的是為了解決上述技術的不足而提供一種使試劑能夠直接測定、無須標本前處理、不須沉淀和離心、不堵塞管道、穩定性強，測定結果受外界干擾小、測定精度高的低密度脂蛋白膽固醇測定方法及試劑。
為了達到上述目的，本發明所設計的低密度脂蛋白膽固醇測定方法，其特征是首先第一步利用多聚物和表面活性劑對低密度脂蛋白(LDL)的特異作用形成穩定復合物掩蔽，其它脂蛋白在缺乏偶聯劑條件下，在表面活性劑、膽固醇酶聯試劑作用下被反應清除；然后第二步通過加入表面活性劑釋放出低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，再在表面活性劑、膽固醇酶聯試劑作用下參于完整的Trinder反應，根據不同敏感的顯色劑，在波長546nm至700nm內選擇確定的波長處測得吸光度與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量成正比，而求得低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。為了在第一步反應中對低密度脂蛋白(LDL)的特異作用形成穩定復合物掩蔽，所述的多聚物是聚乙烯硫酸鹽或中性多聚物PEGME或硫酸葡聚糖或α-磺化環糊精及其相互組合。
根據本發明所提供的低密度脂蛋白膽固醇測定方法而提供的一種低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，它分為兩個組份A、B，由膽固醇脂酶(CEH)、膽固醇氧化酶(COD)和過氧化物酶(POD)組成的膽固醇酶聯試劑和4-氨基安替比林可以全部設在A組份中，也可以全部設在B組份中或A、B組份中分別設置；A、B組份的其它成份組成可以是A組份緩沖液 5-500mmol/L多聚物 0.1mg-5000mg/L防腐劑 0.005-10g/L穩定劑 0.05-500g/L表面活性劑 0.05g-10g/L去干擾劑 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/LB組份緩沖液 5-500mmol/L表面活性劑 0.05-10g/L顯色劑 0.1-10mmol/L穩定劑 0.03-300g/L防腐劑 0.005-10g/L根據多聚物的不同選擇，所述的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的A、B兩個組份可以是A組份緩沖液 5-500mmol/L聚乙烯硫酸鹽 100mg-5000mg/L中性多聚物PEGME 0.1-200mg/L4-氨基安替比林 0.05-1g/L防腐劑 0.005-10g/L穩定劑 0.05-500g/L穩定劑EDTA.2Na 0.1-20mmol/L表面活性劑 0.05-10g/L去干擾劑 0.005-5mmol/L 0.1-5KU/L膽固醇脂酶(CEH) 0.2-10KU/L膽固醇氧化酶(COD)0.2-10KU/L過氧化物酶(POD) 0.1-80KU/L
B組份緩沖液 5-500mmol/L表面活性劑 0.01-30g/L顯色劑 0.1-10mmol/L穩定劑 0.03-300g/L防腐劑 0.005-10g/L根據多聚物的不同選擇，所述的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的A、B兩個組份還可以是A組份緩沖液 5-500mmol/L硫酸葡聚糖 0.05-5g/Lα-磺化環糊精0.1-5mmol/L4-氨基安替比林 0.05-1g/L防腐劑 0.005-10g/L穩定劑 0.05-500g/L去干擾劑 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/LB組份緩沖液 5-500mmol/L表面活性劑 0.1-20g/L顯色劑 0.1-10mmol/L防腐劑 0.005-10g/L膽固醇脂酶(CEH) 0.2-15KU/L膽固醇氧化酶(COD)0.2-20KU/L過氧化物酶(POD) 0.1-50KU/L為了在第一步反應中在對低密度脂蛋白(LDL)的特異作用形成穩定復合物掩蔽的同時，防止極低密度脂蛋白也被形成復合物掩蔽，所述的穩定劑包括EDTA-2Na，其含量可以在0.1-50mmol/L。
為了提高其穩定性，消除測定結果在測定過程中受外界的多種干擾，所述的表面活性劑可以是非離子表面活性劑聚氧乙烯類表面活性劑Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、Tween失水山梨醇聚氧乙烯系列、Triton X-100、乳化劑OP、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚等，也可以是兩性離子表面活性劑EMPIGEN BB、月桂基甜菜堿、椰油酰胺基乙基-N-羥乙基氨基丙酸鈉，椰油酰胺基丙基-2-羥基-3磺基丙基甜菜堿，椰油酰胺基丙基甜菜堿，月桂酰胺基丙基甜菜堿，椰油基甜菜堿等。另外，也可以用膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、SDS、聚乙二醇，表面活性劑的用量因具體不同成份而定，不須特別限制。去干擾劑可以是EDTA.Fe3+、抗壞血酸氧化酶、亞鐵氰化鉀、亞鐵氰化鈉、鐵氰化鈉；穩定劑可以是BSA、聚乙二醇、多元醇、EDTA-2Na、二價金屬離子、抗生素；防腐劑可以是NaN3、PC-300；顯色劑可以是酚或酚的衍生物TOOS、TOPS、TODB、MADB緩沖液可以是GOOd‘S系列緩沖液、Tris、磷酸鹽；pH范圍4.0-9.0本發明所得到的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，使試劑能夠直接測定、無須標本前處理、不須沉淀和離心、不堵塞管道、穩定性強，在2至8度溫度下貯存，能穩定一年以上，并且，特別適合進行批量自動分析，由于在測定時，首先采取對低密度脂蛋白的復合掩蔽，然后除去其它脂蛋白，再釋放低密度脂蛋白膽固醇進行反應測定，使之減少了測定過程中中間產物的干擾，提高了測定結果的精確度，它對滿足醫院快捷、準確的要求具有十分積極的現實意義。
下面通過實施例對本發明作進一步的描述，但本發明絕不限于以下的實施例或被這些實施例所限。
A組份PH6.5緩沖液MES 50mM聚乙烯硫酸鉀鹽 5ml/L中性多聚物PEGME 1.2mg/l4-氨基安替比林 0.3g/L防腐劑NaN3 0.6g/L穩定劑EDTA-2Na 1mmol/LBSA 2g/LMgCl20.5Mm聚氧乙烯表面活性劑 1.5g/L去干擾劑亞鐵氰化鉀 0.05mmol/LCEH 1000U/LCOD 2000U/LPOD 10KU/LB組份PH7.0緩沖液Tris 100mM表面活性劑膽酸鈉 3mmol/LTriton X-100 0.3ml/L防腐劑NaN3 0.9g/L顯色劑TOOS 4.5mmol/L
穩定劑EDTA.2Na0.5mmol/L本實施例描述的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，在使用時，其測定方法是采用具有雙試劑功能的自動生化分析儀，如日立7060自動分析儀，操作如下
計算HDL-C(mmol/L)＝C標準*(ΔA測定/ΔA標準)
A組份PH7.0緩沖液Pipes50mM硫酸葡聚糖 0,5g/Lα-磺化環糊精 0.5mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L防腐劑NaN3 0.6g/L穩定劑EDTA.2Na 1mmol/LBSA 10g/LMgCl2 20mM去干擾劑亞鐵氰化鉀 0.05mmol/L抗壞血酸氧化酶 1KU/LB組份PH7.0緩沖液Pipes100mM聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚 4g/L防腐劑NaN3 0.9g/L顯色劑TOOS 4.5mmol/L膽固醇脂酶(CEH) 1kU/L
膽固醇氧化酶(COD) 3kU/L過氧化物酶(POD) 20KU/L穩定劑EDTA.2Na0.5mmol/L
A組份PH7.0緩沖液Pipes50mM聚乙烯硫酸鉀鹽 5ml/L中性多聚物PEGME 1.2mg/l4-氨基安替比林 0.3g/L防腐劑NaN3 0.6g/L穩定劑EDTA-2Na 1mmol/LBSA 10g/LMgCl2 20mM硫酸葡聚糖 0,5mM聚氧乙烯表面活性劑 1g/L去干擾劑亞鐵氰化鉀 0.05mmol/LCEH 1000U/LCOD 2000U/LPOD 10KU/LB組份PH7.0緩沖液Tris 100mM防腐劑NaN3 0.9g/L顯色劑TOOS 4.5mmol/LThesit 3ml/L穩定劑EDTA.2Na 0.5mmol/L
權利要求
1.一種低密度脂蛋白膽固醇測定方法，其特征是首先第一步利用多聚物和表面活性劑對低密度脂蛋白(LDL)的特異作用形成穩定復合物掩蔽，其它脂蛋白在缺乏偶聯劑條件下，在表面活性劑、膽固醇酶聯試劑作用下被反應清除；然后第二步通過加入表面活性劑釋放出低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，再在表面活性劑、膽固醇酶聯試劑作用下參于完整的Trinder反應，根據不同敏感的顯色劑，在波長546nm至700nm內選擇確定的波長處測得吸光度與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量成正比，而求得低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。
2.根據權利要求1所述的低密度脂蛋白膽固醇測定方法，其特征是所述的多聚物是聚乙烯硫酸鹽或中性多聚物PEGME或硫酸葡聚糖或α-磺化環糊精及其相互組合。
3.一種低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，其特征是它分為兩個組份A、B，由膽固醇脂酶(CEH)、膽固醇氧化酶(COD)和過氧化物酶(POD)組成的膽固醇酶聯試劑和4-氨基安替比林可以全部設在A組份中，也可以全部設在B組份中或A、B組份中分別設置；A、B組份的其它成份組成是A組份緩沖液 5-500mmol/L多聚物 0.1mg-5000mg/L防腐劑 0.005-10g/L穩定劑 0.05-500g/L表面活性劑 0.05g-10g/L去干擾劑 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/LB組份緩沖液 5-500mmol/L表面活性劑 0.05-10g/L顯色劑 0.1-10mmol/L穩定劑 0.03-300g/L防腐劑 0.005-10g/L
4.根據權利要求3所述的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，其特征是它分為兩個組份A、BA組份緩沖液 5-500mmol/L聚乙烯硫酸鹽 100mg-5000mg/L中性多聚物PEGME0.1-200mg/L4-氨基安替比林 0.05-1g/L防腐劑 0.005-10g/L穩定劑 0.05-500g/L穩定劑EDTA.2Na 0.1-20mmol/L表面活性劑 0.05-10g/L去干擾劑0.005-5mmol/L或0.1-5KU/L膽固醇脂酶(CEH) 0.2-10KU/L膽固醇氧化酶(COD) 0.2-10KU/L過氧化物酶(POD) 0.1-80KU/LB組份緩沖液 5-500mmol/L表面活性劑 0.01-30g/L顯色劑 0.1-10mmol/L穩定劑 0.03-300g/L防腐劑 0.005-10g/L
5.根據權利要求3所述的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，其特征是它分為兩個組份A、BA組份緩沖液 5-500mmol/L硫酸葡聚糖 0.05-5g/Lα-磺化環糊精 0.1-5mmol/L4-氨基安替比林 0.05-1g/L防腐劑 0.005-10g/L穩定劑 0.05-500g/L去干擾劑 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/LB組份緩沖液 5-500mmol/L表面活性劑 0.1-20g/L顯色劑 0.1-10mmol/L防腐劑 0.005-10g/L膽固醇脂酶(CEH)0.2-15KU/L膽固醇氧化酶(COD) 0.2-20KU/L過氧化物酶(POD)0.1-50KU/L
6.根據權利要求3或4或5所述的低密度脂蛋白膽固醇測定試劑，其特征是所述的穩定劑包括EDTA-2Na，其含量是0.1-50mmol/L。
全文摘要
本發明公開了一種低密度脂蛋白膽固醇測定方法及試劑,它是首先第一步利用多聚物和表面活性劑對低密度脂蛋白(LDL)的特異作用形成穩定復合物掩蔽,其它脂蛋白在缺乏偶聯劑條件下,在表面活性劑、膽固醇酶聯試劑作用下被反應清除;然后第二步通過加入表面活性劑釋放出低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C),再在表面活性劑、膽固醇酶聯試劑作用下參于完整的Trinder反應,在一定的波長處測得吸光度與低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)含量成正比,而求得低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)含量。該方法的試劑能夠直接測定、無須標本前處理、不須沉淀和離心、不堵塞管道、穩定性強,特別適合進行批量自動分析,減少了測定過程中中間產物的干擾,提高了測定結果的精確度。
文檔編號G01N21/27GK1379234SQ02118800
公開日2002年11月13日 申請日期2002年5月10日 優先權日2002年5月10日
發明者肖洪武 申請人:肖洪武