專利名稱：測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法
技術領域：
本發明涉及一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法。
背景技術：
幽門螺桿菌屬螺桿菌屬。它是一種在人胃腸道發現的細菌，已經發現它與人胃十二指腸疾病如胃炎、消化性潰瘍、胃癌和其它疾病有密切關系。
已經有許多不同的技術用于幽門螺桿菌的測定。依據取材有無創傷性，目前幽門螺桿菌感染的臨床診斷方法可分為兩大類①無創檢查包括血清學方法、同位素標記尿素的呼氣試驗和胃液聚合酶鏈反應等。②創傷性檢查均為胃鏡依賴方法，包括多種形態學、微生物學和分子生物學技術等。
上述這些方法均有缺陷，很難滿足臨床診斷需要。
血清學方法采用酶聯免疫、免疫酶試驗、膠乳凝集試驗、Western blot等方法檢測外周血清幽門螺桿菌全菌及其組分如細胞毒素的抗體等。由于幽門螺桿菌感染數周后血中才出現特異抗體，陰性者血中也可存在交叉反應性抗體(如空腸彎曲菌感染)，且幽門螺桿菌根除后血中抗體可長時間(＞6個月)維持在陽性水平，故血清學陽性不能完全肯定病人有活動性感染；陰性不能排除初期的感染。因此，血清學抗體的檢測只能用于流行病學篩查而不能用于臨床診斷，也不能用于療效觀察。
同位素標記尿素的呼氣試驗(C-13和C-14呼氣試驗)其原理是根據幽門螺桿菌可產生強活性的尿素酶，其分解胃液中的尿素，產生二氧化碳和氨。用C-13或C-14位素標記尿素，讓病人口服后被幽門螺桿菌的尿素酶分解，產生C-13或C-14的CO，陽性患者可在呼出氣體中檢測出C-13(C-13/C-12比例)豐度和C-14(放射性)活性，從而確診幽門螺桿菌感染，目前被認為是除細菌培養外的診斷“金標準”。但前者需要氣體質譜儀，后者有一定的放射性，也需要液體閃爍儀等昂貴儀器，且檢查收費標準較高，極大地限制了該方法的應用。胃腸道中的其它細菌也可分泌尿素酶，當這些細菌污染時，可產生假陽性結果。幽門螺桿菌的根除治療后，尿素酶受到抑制，該方法易導致假陰性結果。
基因診斷方法，如插胃管吸取胃液或胃鏡抽取胃液或活檢組織，提取DNA做聚合酶鏈反應和探針雜交診斷幽門螺桿菌感染，具有準確性好、檢測靈敏度高的優點。還可特異地檢測細菌的致病基因如空泡毒素基因等，但操作復雜、易污染，且大大增加了病人的經濟開支，對已擁有多種檢查手段以診斷幽門螺桿菌感染的今天，不宜提倡作為常規方法。
微生物學方法主要為細菌分離培養技術，是診斷幽門螺桿菌感染的“金標準”，同時可以獲得諸如抗原制備、藥敏試驗、分型和致病性研究等所需的細菌。但要求具有一定的厭氧培養條件和技術，作為常規診斷手段不易推廣。
快速尿素酶試驗 是胃鏡檢查時最常用的Hp感染診斷方法，包括PH指示劑法及分析化學法。多用活檢標本，也可用胃液標本檢測。另外還有活撿組織病理染色、涂片染色等直接看到細菌等方法，這幾種方法均是創傷性檢查，需要胃鏡取材和判斷經驗。因此，限制了這些方法的應用。
綜上所述，幽門螺桿菌的感染最好能直接檢查細菌抗原，尤其是糞便樣品中的幽門螺桿菌抗原。為此，美國默里迪恩診斷公司提出一種“糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫測定法”(中國專利申請號97103112.6)。該方法采用酶聯免疫檢測技術檢測糞便樣品中幽門螺桿菌抗原，具有靈敏度高、特異性好等優點，但是該方法所采用的試劑成本高，操作費時，需要昂貴的酶標儀等，限制了該方法的使用。
發明內容
本發明的目的在于解決現有技術中所采用的試劑和儀器成本高、操作費時的問題。
概述本發明提供一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法；它包括(a)把抗幽門螺桿菌的抗體/或幽門螺桿菌抗原標記微球，形成免疫微球；(b)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便懸浮于樣品緩沖液中；(c)將已標記抗幽門螺桿菌抗體的免疫微球與含糞便的樣品緩沖液混合；或將一定抗幽門螺桿菌抗體與含糞便的樣品緩沖液混合，然后加入幽門螺桿菌抗原標記微球；(d)檢測糞便中可能存在的幽門螺桿菌。
在本發明的實施方案中，可用來標記的微球(或微粒)的顆粒種類很多，常用的有動物或人紅細胞、細菌、多種高分子材料聚合成的微顆粒(如聚苯乙烯膠乳等)、樹脂、皂土、明膠顆粒、活性炭、火棉膠、玻璃微球等。優選方案中將采用膠乳和紅細胞。
在本發明的實施方案中，用來標記微球的抗體可以是多克隆抗體，也可以是各種單克隆抗體或其混合。優選方案將采用多克隆抗體。
抗體或抗原標記微球的方法有數種物理吸附、化學交聯和間接法等。在實施時應根據微球的具體特點和抗體的特性進行選擇。
糞便樣品制備將一定量糞便按適當比例稀釋于樣品緩沖液中，充分攪拌混勻，低速離心數分鐘，取上清液，待測。其中的樣品稀釋液應含有蛋白質及洗滌劑，可減少非特異性反應。為提高檢測敏感度可含糞便的樣品緩沖液針對幽門螺桿菌進行濃集處理。
檢測糞便中可能存在的幽門螺桿菌的方法有直接法和間接法。直接法是指，將抗幽門螺桿菌抗體標記微球，形成免疫微球；直接將免疫微球與含糞便的樣品緩沖液混合，檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌，如凝集反應、免疫花環、檢測免疫微球與緩沖液混合前后緩沖液物理或化學特性的改變(如顏色、濁度、通透性等)、檢測免疫微球與緩沖液混合前后微球數量以及物理特性的改變(游離的微球的濃度)等。間接方法通常有凝集抑制反應，其原理是幽門螺桿菌抗原標記的微球與一定量抗該細菌的抗體結合而出現凝集反應，當存在該細菌感染時，糞便中的幽門螺桿菌抗原競爭與抗體結合，從而抑制幽門螺桿菌抗原標記微球的凝集。
本發明采用免疫微球技術，檢測糞便樣品中的幽門螺桿菌。它具有成本低廉、操作方便快捷、結果可靠等優點。詳細描述本發明的測定方法使用了微球，它有許多種類，如動物或人紅細胞、細菌、多種高分子材料聚合成膠乳的微粒(如聚苯乙烯膠乳等)、樹脂、皂土、明膠顆粒、活性炭、火棉膠、玻璃微球等。優選方案中將采用膠乳和紅細胞，以膠乳為最優。
膠乳的種類很多，目前常用的是聚苯乙烯膠乳，現有市場上已有各種規格的商品化的膠乳。本發明采用的膠乳直徑以0.2～1.5微米為優。
本發明使用了抗幽門螺桿菌的抗體，有單克隆抗體和多克隆抗體兩種，常用的為多克隆抗體。這些抗體能夠從致敏的動物的血清中獲得。目前國內外已有多家公司可提供商品化的抗幽門螺桿菌的抗體，可以較經濟的價格獲得。中國專利(申請號97103112.6)已詳細描述幽門螺桿菌抗體的制備方法。在此僅簡述如下把幽門螺桿菌抗原注射到哺乳動物如兔、羊等體內，多次注射適當劑量的抗原，驗證試驗動物已產生抗幽門螺桿菌抗體，取試驗動物血清，經純化即可得到所需抗體。
抗體或抗原標記微球的方法有物理吸附和化學交聯等。物理吸附是利用膠乳顆粒表面的帶電性，物理吸附方法操作簡單方便，但這種結合的牢固度往往較差。隨著致敏試劑保存期的延長，脫落比較明顯。化學交聯指采用含有化學活性基團的膠乳作為載體，抗體或抗原以化學鍵共價交聯在膠乳表面。這種化學交聯的性能穩定，保存期長，使用效果有明顯提高。膠乳的表面活性基團可以是羧基、氨基或一些其它具有化學活性的基團，它與蛋白質抗原或抗體的結合可以通過縮合劑來完成。將抗體或抗原結合在微球上的技術是本領域普通技術人員所熟知的。
A、物理吸附法先用蒸餾水將膠乳懸液稀釋至適當濃度，繼將抗體或抗原溶于緩沖液后，逐滴加入稀釋的膠乳懸液中，搖動使之充分混和。混合后可放置室溫或37℃，保溫一定時間。吸附完成后，離心沉淀，除去游離在上清液中的末吸附物，傾去上清液后，沉淀仍用緩沖液恢復懸浮狀態。加入牛血清白蛋白或水解明膠等，使膠乳表面的吸附能力充分飽和，減少非特異性反應；并應嚴格避免在吸附過程中發生膠乳自凝。
B、化學交聯法帶活性基團的微球可采用化學交聯法與抗體或抗原結合。不同活性基團其交聯方法有所不同。如羧化聚苯乙烯膠乳采用化學交聯法與抗體或抗原結合。為了提高交聯效果，通常先給膠乳引入“手臂”。如將抗體直接緊貼地交聯在羧化聚苯乙烯膠乳上，由于空間位阻，妨礙它與相應的抗原起反應。因此先接上“手臂”ε-氨基己酸，以增大配基與載體表面的距離，這樣制成的免疫微球敏感度和特異性均高于物理吸附的，試劑的穩定性也顯著提高。膠乳上的氨基和被交聯物上的氨基是通過縮合劑碳化二亞胺來完成的。
糞便樣品制備將一定量糞便按適當比例稀釋于樣品緩沖液中，充分攪拌混勻，進行常規離心，如采用200-500轉/分，3-5分鐘，取上清液，待測。為提高檢測敏感度可含糞便的樣品緩沖液針對幽門螺桿菌進行離心或過濾等濃集處理。將該上清液以大于4000轉/分的速度，離心10分鐘以上，去上清液，將沉淀再打散、混勻，待測。其中的樣品稀釋液應含有蛋白質及洗滌劑，可減少非特異性反應。蛋白質成分可選自胎牛血清、羊血清、豚鼠血清、馬血清、酪蛋白、白蛋白、明膠、牛血清白蛋白、人血清白蛋白等。洗滌劑可含有Tween-20、TritonX-100等。
檢測糞便樣品中可能存在的幽門螺桿菌，其方法有直接法和間接法。直接法是指，將抗幽門螺桿菌抗體標記微球，形成免疫微球；將免疫微球與含糞便的樣品緩沖液混合，檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌，如凝集反應、免疫花環、檢測免疫微球與緩沖液混合前后緩沖液物理或化學特性的改變(如顏色、濁度、通透性等)、檢測免疫微球與緩沖液混合前后微球數量以及物理特性的改變(游離的微球的濃度)等等。間接方法通常有凝集抑制反應，其原理是幽門螺桿菌抗原標記的微球與一定量抗該細菌的抗體結合而出現凝集反應，當存在該細菌感染時，糞便中的幽門螺桿菌抗原競爭與抗體結合，從而抑制幽門螺桿菌抗原標記微球的凝集。凝集抑制反應包括(a)把幽門螺桿菌的抗原標記微球，形成免疫微球；(b)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便懸浮于樣品緩沖液中；(c)將一定量的抗幽門螺桿菌抗體與含糞便的樣品緩沖液混合，2-10分鐘后加入幽門螺桿菌抗原標記的微球；(d)將上述液體充分混合、連續搖動2-10分鐘即可觀察結果出現凝集顆粒的為陰性反應，說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少；保持均勻乳液狀為陽性反應，說明糞便樣品中存在幽門螺桿菌。
凝集試驗分試管法與玻片法。玻片法操作簡便，一定體積上述方法制備糞便樣品(為提高靈敏度通常要將樣品濃集處理)和等體積抗幽門螺桿菌抗體致敏的膠乳試劑在玻片(一般為黑色背景)上混勻后，連續搖動數分鐘即可觀察結果。出現凝集顆粒的為陽性反應，說明糞便樣品中存在幽門螺桿菌；保持均勻乳液狀為陰性反應，說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少。
免疫微球花環形成試驗取一定體積上述方法制備糞便樣品和等量的抗幽門螺桿菌抗體致敏的免疫微球試劑在小試管中，混合后置室溫或37℃溫度10-40分鐘。以磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次。取末次沉淀細胞一滴置載玻片上，然后染色，在顯微鏡下檢測免疫花環。顯微鏡下，幽門螺桿菌的典型形態為s狀、海鷗狀彎曲。如果有免疫花環形成，則在細菌的四周有免疫微球粘附，似花環一樣，故稱免疫微球花環試驗。如果發現S狀或海鷗狀彎曲的被染色細菌，同時在其四周有2～3個以上的微球粘附，則表示花環試驗陽性，據此可推測該糞便樣品中存在幽門螺桿菌；如未發現免疫花環形成，則說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少。
檢測緩沖液的物理或化學特性改變的方法常用的有濁度法。濁度法是根據抗幽門螺桿菌抗體致敏的免疫微粒與其相應的抗原結合后形成凝集顆粒，使反應混合物系統的濁度變小，透射光增強，濁度的改變與幽門螺桿菌的濃度呈函數關系，由此可測出樣品中幽門螺桿菌的量。可利用實驗室常用分光光度計以340-500nm波長的入射光進行測定。亦可用光散射法測定凝集顆粒在某一角度的散射光強度的改變，檢測靈敏度高于透射光濁度法。濁度法的靈敏度比粒子計數法約低1-2倍，但已能滿足定量測定要求。
檢測免疫微球與緩沖液混合前后微球數量以及物理特性的改變。常用的方法有粒子計數法。粒子計數法的原理是根據包被了抗幽門螺桿菌抗體的免疫微球，與其相應的抗原結合發生凝集反應，使原來處于分散狀態的免疫微球數量減少。被測物濃度越高，凝集反應愈強，游離免疫微球數量愈少，通過計數反應前后游離狀態免疫微球數量的變化，就能對樣品中被測物-幽門螺桿菌作出定量分析。該方法操作簡便，檢測靈敏度高，一般為0.1-1ng/ml范圍；所用儀器設備可以和臨床實驗室常用的血細胞計數儀及生化自動分析儀DIAS系統通用。
表1為現有的酶聯免疫檢測方法和本發明所述乳膠凝集進行檢測的結果對比。
表2為酶聯免疫檢測方法和本發明所述乳膠凝集同時檢測4份糞便樣品的結果。
以下通過一些非限定性實施例對本發明作進一步說明。
(五)具體實施方案實施例一物理方法致敏微球材料準備直徑0.6～1.2微米的聚苯乙烯微球(可向美國SIGMA公司購買)，羊抗幽門螺桿菌的多克隆抗體、幽門螺桿菌抗原(抗原標準品或可溶性抗原)(可向美國KPL公司、中國深圳晶美生物工程有限公司購買)。
緩沖液配制0.27mol/L甘氨酸緩沖液7.51克甘氨酸、9.95克氯化鈉溶于蒸餾水，用1mol/L氫氧化鈉調至pH8.2，蒸餾水補足至1升。
0.27mol/L甘氨酸緩沖液+1％人血清白蛋白1克人血清白蛋白溶于100毫升0.27mol/L甘氨酸緩沖液。
0.054mol/L甘氨酸緩沖液用蒸餾水將0.27mol/L甘氨酸緩沖液作1∶5稀釋即可。
先用蒸餾水將1毫升10％的膠乳懸液稀釋至1-2％，用0.054mol/L甘氨酸緩沖液將乳膠洗壓積3次(10000g離心20分鐘)。然后重新懸浮于10毫升0.054mol/L甘氨酸緩沖液，逐漸將1毫克抗體或抗原加入稀釋的膠乳懸液中，搖動使之充分混和。(1％膠乳懸液1ml一般能吸附0.1～1mg物質)。混合后可放置室溫或37℃保溫，時間一般為30～60分鐘。吸附完成后，10,000g離心沉淀30分鐘，除去游離在上清液中的末吸附物，傾去上清液后，沉淀用0.27mol/L甘氨酸緩沖液+1％人血清白蛋白緩沖液恢復懸浮狀態。加0.04％疊氮鈉，于4℃保存，備用。
實施例二化學交聯法致敏微球帶醛基的聚醛基聚苯乙烯微球 1％乳膠1毫升加0.1毫克抗體或抗原，加10毫升0.1mol/LpH5.3醋酸鹽緩沖液。室溫下，使容器攪拌10小時，然后10000g離心20分鐘，去上清液。沉淀加10毫升pH9.5 1mol/L乙醇胺/0.1％Tween-20。攪拌3小時，然后10000g離心20分鐘，去上清液。沉淀加10毫升Tris緩沖液，攪拌24小時，離心10000g 20分鐘，去上清液。加含1％人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液10毫升，重新懸浮；加0.04％疊氮鈉，于4℃保存，備用。
0.1mol/LpH5.3醋酸鹽緩沖液0.1mol/L醋酸10毫升，0.1mol/L醋酸鈉40毫升。
Tris緩沖液0.05mol/LTris 0.1mol/氯化鈉。
實施例三糞便樣品準備將糞便樣品按1∶4或1∶6稀釋，將適當糞便樣品加入樣品稀釋液中，充分混合。200轉/分，離心3分鐘。取上清液，待測。在采用凝集反應以及凝集抑制反應檢測幽門螺桿菌時，為提高檢測靈敏度，可將樣品濃集處理，將該上清液12000g離心15分鐘，去上清液，將沉淀再打散、混勻，待測。
樣品稀釋液100毫升0.27mol/L甘氨酸緩沖液，加入人血清白蛋白1克，加Tween-20 3毫升。同時加0.04％疊氮鈉。
實施例四乳膠凝集反應凝集試驗(采用玻片法)12cm×16cm玻璃凝集反應板(板上分1cm×1.5cm的30個小方格，一般為黑色背景)。一滴(約30-50微升)上述方法制備糞便樣品和一滴(約30-50微升)抗幽門螺桿菌抗體致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后，連續搖動數分鐘(順時針或反時針方向)即可觀察結果。出現凝集大顆粒的為陽性反應，說明糞便樣品中存在幽門螺桿菌；保持均勻乳液狀為陰性反應，說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少。
對照設置以生理鹽水為空白對照，以酶聯免疫檢測為陰性的糞便標本做為陰性對照。
判斷結果“++++”乳膠顆粒全部凝集出現粗顆粒，并且四周成一白色框邊，一般1～2分鐘出現凝集顆粒。液體清亮為特強陽性“++++”。
“+++”乳膠顆粒全部凝集出現粗顆粒。4周白色框邊不太明顯。一般3-4分鐘出現凝集顆粒，液體較清亮為強陽性“+++”。
“++”乳膠出現凝集顆粒。液體微混濁。一般5-6分鐘出現凝集顆粒為較強陽性“++”。
“+”乳膠出現凝集顆粒，液體混濁，一般8-10分鐘出現凝集顆粒為弱陽性“+”。
“-”不凝集，呈白色均勻混濁為陰性“-”。
陽性判斷標準凡出現凝集就判為陽性。
必要時可將糞便標本作一系列等倍稀釋，進行半定量測定。
將糞便樣品濃集處理后(兩次離心，200轉/分，離心3分鐘，取上清液，再將該上清液12000g離心15分鐘，去上清液，將沉淀再打散、混勻，待測)，乳膠凝集反應靈敏度與酶聯免疫方法類似。
通過把已知數量的幽門螺桿菌抗原，配制成校準品，同時采用中國專利(申請號97103112.6)所述酶聯免疫檢測方法和本發明所述乳膠凝集進行檢測，結果見表1。
兩種方法同時檢測4份糞便樣品，結果見表2。
從表1、2可以看出將糞便樣品經濃集處理后所作乳膠凝集反應的靈敏度與酶聯免疫方法相當。
實施例五、凝集抑制反應把適當稀釋度的50微升抗幽門螺桿菌抗體與實施例三制備的含糞便的樣品緩沖液充分混合，然后加入等體積幽門螺桿菌抗原標記的免疫微球；將上述液體充分混合、連續搖動數分鐘(順時針或反時針方向)即可觀察結果。
結果判定出現凝集顆粒的為陰性反應，說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少；保持均勻乳液狀為陽性反應，說明糞便樣品中存在幽門螺桿菌。
凝集抑制反應較乳膠凝集反應敏感度高實施例六、免疫微球花環形成試驗取一滴(50微升)實施例三制備糞便樣品和一滴(50微升)抗幽門螺桿菌抗體致敏的免疫微球試劑在小試管中，混合后置37℃間斷振搖30～60分鐘。然后用磷酸鹽緩沖液以4000轉/分離心20分鐘洗滌2次。取末次沉淀細胞一滴置載玻片上，同時加一滴美藍溶液，染色3～15分鐘加上蓋玻片；在高倍鏡或油鏡下檢測免疫花環。顯微鏡下，幽門螺桿菌被美藍染成藍色，其典型的形態為s狀、海鷗狀彎曲。如果有免疫花環形成，則在該細菌的四周有微球粘附，似花環一樣，故稱免疫微球花環試驗。在顯微鏡下，如果發現S狀或海鷗狀彎曲的被染成藍色細菌，同時在其四周有2～3個以上的微球粘附，則表示花環試驗陽性，該糞便樣品中存在幽門螺桿菌；如未發現免疫花環形成，則說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少。
本方法較乳膠凝集試驗及酶聯免疫均敏感。
用于幽門螺桿菌染色的方法有很多種，這是本研究領域技術人員所熟知的，如革蘭氏染色、銀染色、美藍染色。在此僅選擇一種較方便的染色方法。
美藍染液美藍(亞甲基藍)1.0g，硼酸0.5g，加蒸餾水至100ml。
實施例七、透射比濁法應用RA-50半自動生化分析儀上采用透射比濁法檢測糞便樣品幽門螺桿菌。
采用前述物理吸附方法將抗幽門螺桿菌的抗體標記到較細的微球上(直徑0.2微米左右)。
幽門螺桿菌抗原標準品(可向深圳晶美生物工程公司購買)，標準曲線制備用0.1mol/L甘氨酸緩沖液(pH7.4)將幽門螺桿菌標準品稀釋成1.1×106、3×106、9×107、1.9×107/毫升，按下列步驟操作，作標準曲線。
操作方法將實施例三所制備的糞便樣品(只一次離心后取上清液)200微升加免疫微球100微升，充分混勻，30℃水浴1分鐘，RA-50半自動生化分析儀，340NM彼長終點法測定，儀器根據內存的標準曲線計算打印測定結果。標準曲線測定時加標準品與免疫微球，同上水浴后，讀數。為避免糞便樣品本身濁度干擾，應設樣品對照。
濁度法的靈敏度比酶聯免疫方法低，但已能滿足定量測定要求。
權利要求
1.一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法，它包括(a)把抗幽門螺桿菌的抗體/或幽門螺桿菌抗原標記微球，形成免疫微球；(b)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便懸浮于樣品緩沖液中；(c)將已標記抗幽門螺桿菌抗體的免疫微球與含糞便的樣品緩沖液混合；或將抗幽門螺桿菌抗體與含糞便的樣品緩沖液混合，然后加入幽門螺桿菌抗原標記的微球；(d)檢測糞便中可能存在的幽門螺桿菌
2.根據權利要求1的方法，用來標記的微球的顆粒有動物或人紅細胞、細菌、多種高分子聚合顆粒、樹脂、皂土、明膠顆粒、活性炭、火棉膠、玻璃微粒總的一種或幾種，優選方案中將采用膠乳或紅細胞。
3.根據權利要求1的方法，將含糞便的樣品緩沖液針對幽門螺桿菌進行濃集處理。
4根據權利要求3所述的方法，其特征在于該濃集處理的方法是將含有糞便樣品的緩沖液進行離心濃集處理。
5.根據權利要求1的方法，其中的樣品稀釋液應含有蛋白質及洗滌劑。蛋白質成分選自胎牛血清、羊血清、豚鼠血清、馬血清、酪蛋白、白蛋白、明膠、牛血清白蛋白、人血清白蛋白的一種或幾種，洗滌劑含有Tween-20或Triton X-100。
6.根據權利要求1所述的測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法；它包括(a)把抗幽門螺桿菌的抗體標記微球，形成免疫微球；(b)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便懸浮于樣品緩沖液中；(c)將已標記抗幽門螺桿菌抗體的免疫微球與含糞便的樣品緩沖液混合；(d)檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌；
7.根據權利要求6方法，其特征在于檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌的方法為將上述混合液體連續搖動1分鐘以上即可觀察結果出現凝集顆粒的為陽性反應，說明糞便樣品中存在幽門螺桿菌；保持均勻乳液狀為陰性反應，說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少。
8.根據權利要求6方法，其特征在于檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌的方法為將上述混合液體置室溫或37℃保溫5分鐘以上，取一部分液體染色；在顯微鏡下檢測免疫花環，免疫微球吸附在幽門螺桿菌的周圍形成花環，如此花環存在則可間接推測樣品中存在幽門螺桿菌；反之則無幽門螺桿菌或者量很少。
9.根據權利要求6方法，其特征在于檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌的方法為檢測免疫微球與緩沖液混合前后緩沖液物理或化學特性的改變，從而推測糞便樣品中可能存在幽門螺桿菌。
10.根據權利要求6方法，其特征在于檢測與免疫微球結合的幽門螺桿菌的方法為檢測免疫微球與緩沖液混合前后微球數量以及物理特性的改變，從而推測糞便樣品中可能存在幽門螺桿菌。
11.根據權利要求1所述的測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法，它包括(a)把幽門螺桿菌的抗原標記微球，形成免疫微球；(b)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便懸浮于樣品緩沖液中；(c)將含有抗幽門螺桿菌抗體的液體30-60μl與等體積的含糞便的樣品緩沖液混合，2-10分鐘后加入幽門螺桿菌抗原標記的微球；(d)將上述液體充分混合、連續搖動1分鐘以上即可觀察結果出現凝集顆粒的為陰性反應，說明糞樣品中無幽門螺桿菌或者量很少；保持均勻乳液狀為陰性反應，說明糞便樣品中存在幽門螺桿菌。
全文摘要
本發明涉及一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫微球方法,它解決了現有技術中所采用的試劑和儀器成本高、操作費工費時的問題。本發明的方法是:(a)把抗幽門螺桿菌的抗體/或幽門螺桿菌抗原標記微球,形成免疫微球;(b)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便懸浮于樣品緩沖液中;(c)將已標記抗幽門螺桿菌抗體的免疫微球與含糞便的樣品緩沖液混合;或將一定抗幽門螺桿菌抗體與含糞便的樣品緩沖液混合,然后加入幽門螺桿菌抗原標記微球;(d)檢測糞便中可能存在的幽門螺桿菌。本發明采用免疫微球技術,檢測糞便樣品中的幽門螺桿菌。它具有成本低廉、操作方便快捷、結果可靠等優點。本發明的方法主要用于對糞便樣品中幽門螺桿菌中的免疫微球的測定。
文檔編號G01N33/574GK1378084SQ0211574
公開日2002年11月6日 申請日期2002年4月19日 優先權日2002年4月19日
發明者王滔 申請人:王滔