專利名稱：一種基于抗原抗體反應的新型試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于抗原抗體反應的試劑盒，特別是一種在一個反應器中既固定有抗原探針又有抗體探針，用以對同一樣品中的目標抗體和目標抗原進行定性和/或定量檢測的試劑盒。
本發明還涉及本發明試劑盒的生產方法及其應用。
現有ELISA試劑盒的基本特征是，其探針板是在孔內表面上以隨機分布的方式固定有抗原或抗體的塑料或玻璃微孔板，其標記系統含有酶標記的抗原或抗體或抗抗體和底物，其應用在于檢測樣品中與固定化探針相應的抗體或抗原。根椐探針板上和標記系統中不同的抗原-抗體組合，ELISA方法可細分為間接法，雙抗體夾心法和雙抗原夾心法等。例如，對抗原包被板(探針板上固定的是特異抗原)，檢測時樣品中的目標抗體和探針抗原發生特異性結合，如果標記系統中的酶標物為酶標特異抗原則是雙抗原夾心法，如果標記系統中的酶標物為酶標抗抗體則是間接法；如果探針板上固定的是特異抗體，檢測時樣品中的目標抗原和探針板上的抗體探針發生特異性反應，標記系統中的標記物為酶標特異抗體則是雙抗體夾心法。不管那種方法，洗去未結合的酶標物后，加入標記系統中的底物溶液，顯色檢測0D值，即可對結合的目標抗體或者目標抗原進行定性或定量檢測。
本發明中所謂的多肽芯片，相當于英語術語中的＂peptide arrays＂，＂peptide microarrays＂，＂peptide chips＂，＂protein arrays＂或＂proteinchips＂。現有的以抗原-抗體反應為基礎的多肽芯片，即抗原芯片試劑盒和抗體芯片試劑盒，其基本特征是1)，試劑盒探針板上的選擇性反應器，是一種以非隨機的方式，例如可尋址的方式，固定有m種抗原(m等于和大于1)或n種抗原(n等于和大于1)的固相載體，例如固定有m種抗原的抗原芯片，或固定有n種抗體的抗體芯片；2)，試劑盒標記系統為熒光物質或其它染色物質標記的抗原或抗體或抗抗體；3)，其應用在于檢測樣品中與固定化探針群相應的m種抗體或n種抗原。抗原-抗體芯片試劑盒具有廣泛的應用前景，特別是在臨床免疫學診斷上。然而，盡管研究開發工作已進行了十多年，此一產品還有若干關鍵問題尚待解決，故還未進入大規模應用階段。目前，其基本方法可視為ELISA的發展，即將在固相載體上以隨機分布的方式固定一種抗原或一種抗體，發展為在固相載體上以可尋址方式固定多種抗原或多種抗體。其選擇性反應器中與標記系統中的抗原-抗體反應模式亦與ELISA方法中的反應模式相同，也只能是間接法、雙抗體夾心法、雙抗體夾心法等方法中之一種方法。
總而言之，目前上述試劑盒，其探針板上一個反應器中都只是或者固定抗原、或者固定抗體，其標記系統中包含的已標記物或是抗抗體、或是特異抗體、或是特異抗原，所以上述試劑盒中的一套反應物(一個反應器加標記系統和輔助部分中用于一個反應器的全部物質)不能用于對一個樣品中的抗原和抗體同時進行測定。
本發明的目的是這樣實現的一種基于抗原抗體反應的新型試劑盒，其基本特征在于1)，其探針板上同一個反應器中既固定有抗原又固定有抗體；2)，其標記系統既能對探針捕捉的目標抗原又能對探針捕捉的目標抗體進行標記；3)，其應用為從同一樣品中既對目標抗體又對目標抗原進行定性和/或定量測定。當待測樣品被加到本發明試劑盒的探針板上的反應器內，探針抗原和探針抗體與樣品中可能存在的相應的目標抗體和目標抗原發生特異反應。加入標記系統后，標記系統中已標記的特異性抗體和已標記的特異性抗原(或/和已標記的特異性抗抗體)將分別同目標抗原和目標抗體發生特異反應。洗去未結合的已標記抗體和抗原(和/或抗抗體)后，可對所有這些特異反應的結果進行測定。
本發明的試劑盒可以分為兩類抗原抗體包被ELISA試劑盒和抗原抗體芯片試劑盒。抗原抗體包被ELISA試劑盒的特征為，其探針板是在孔內表面以隨機分布的方式固定有特異抗原和特異抗體探針的微孔板，其標記系統含有可分別同目標抗原和目標抗體進行特異反應的酶標物質以及底物，其應用為檢測樣品中有無目標抗原或目標抗體發生陽性反應和/或樣品中全部目標抗原和目標抗體的陽性反應程度。抗原抗體芯片試劑盒的特征為，探針板上的一個反應器內以非隨機的方式固定有探針抗原和探針抗體，標記系統中含有可分別同目標抗原和目標抗體進行特異反應的以熒光物質或其它染色物質標記的物質，其應用為同一檢測中對同一樣品中不同的目標抗原和目標抗體進行定性和/或定量的分析。
本發明試劑盒中述及的探針板，是將抗原和抗體固定在固相載體上制成的。本發明中的固相載體，是各種可用于制備ELISA試劑盒和多肽芯片試劑盒中選擇性反應器的固相載體(例如微孔板，芯片基片等)。本發明中的探針板的材料，包括各種有機、無機，透明或不透明、吸水或不吸水、質硬或質軟的材料，如玻璃、塑料、橡膠、金屬、纖維材質的膜、片、板等其中的一種或幾種的復合物。本發明中的探針板的形狀，可以是各形平板、各形孔板，各形條狀物等各種幾何體。本發明中的探針板上，可以有一個或多個選擇性反應器。每一個反應器內固定有檢測特異反應所要求的抗原探針和抗體探針，它們可以以隨機分布的的形式或非隨機分布的方式固定在反應器內。本發明中的探針板上固定的特異抗體和抗原，既可以是天然物又可以是合成物，包括多肽和蛋白質等所有具備抗原或抗體特性的物質。在本發明試劑盒的生產中，特異抗原和特異抗體在探針板上的固定，既可以同時進行，也可以分前后進行。其點樣方式可以手工進行，也可利用各種點樣、印章和噴墨等印刷設備。
本發明試劑盒中的標記系統，含有分別能同特異抗原和特異抗體進行選擇反應的標記物。這些標記物是已標記的、具有選擇反應性的抗體、抗原和抗抗體。選擇反應是指特異抗原和特異抗體之間的反應性，以及抗體與不同來源或制備的抗體發生反應或不發生反應的選擇性。其標記原理可以利用所有能夠用于E LISA試劑盒和多肽芯片試劑盒的標記原理，例如酶標、金標、金加銀標、熒標等等。為了既能標記抗體又能標記抗原，本發明試劑盒中的標記系統包含有下列四種標記物配對中的一種1)，已標記的針對目標抗原的特異抗體和針對目標抗體的特異抗原；2)，已標記的針對目標抗原的特異抗體和針對目標抗體的特異抗抗體；3)，已標記的針對目標抗原的特異抗體及針對目標抗體的特異抗原和特異抗抗體；4)，在上述三種基本配對基礎上的各種衍生配對，例如，針對目標抗原的特異抗體、已標記的針對目標抗原特異抗體的抗抗體及已標記的針對目標抗體的特異抗抗體等。在生產中，本發明試劑盒中的標記系統中的各種配對標記物，如上述的標記特異抗體/標記特異抗原、標記特異抗體/標記特異抗抗體、標記特異抗體/標記特異抗原+標記特異抗抗體等，可以以混合物的形式也可以不以混合物的形式來進行生產。標記系統中用以制備標記物的，具有選擇反應性的抗體、抗原和抗抗體，包括所有可以與各種抗原和抗體發生選擇性反應的各種制備的抗體、抗原和抗抗體。例如人源或動物源的單克隆或多克隆的、單鏈或多鏈的及合成多肽的制備。標記系統中的示蹤劑為能用于標記抗體、抗原和抗抗體而不影響其生物活性的物質，這些物質有各種熒光物質、放射性物質、金屬化合物類著色劑、有機化合物著色劑、如熒光素、膠體金、硝酸銀、卡馬斯亮蘭等。
本發明的試劑盒的優點是，可以利用同一反應器對樣品中不同的抗體和抗原進行定性和/或定量的檢測，從而使上述撿測所需的反應器數目下降，檢測時間下降和檢測可比性提高，本發明提供了一種經濟、快速、高效的試劑盒。
表二，病毒篩選結果樣品 ELISA方法 本試劑盒HBsAg HCV HIV 梅毒 HTLV HBsAg HCV HIV梅毒 HTLV1 + --- - 16249 15621 14736 17241 156492 - +-- - 17453 14589 15237 16984 168433 - -+- - 17681 15423 15647 17568 156794 - --+ - 19725 14976 15264 17235 161475 - --- + 16394 15421 15671 17852 159436 + +-- - 19965 18637 17357 19383 198757 - -++ - 21324 19473 19324 19214 196788 + --- + 22295 18639 18536 20452 20123陰性對照 65 76 43 67 61陽性對照 26334 22194 21867 24123 23176空白對照 54 34 45 57 5權利要求
1.基于抗原抗體反應的試劑盒，由探針板和標記系統為主要組成，其特征在于在其探針板上的同一個選擇性反應器中，既固定有抗原又固定有抗體；在其標記系統中含有能對探針捕捉的目標抗原和目標抗體進行標記的標記物。
2.按照權利要求1所述的新型試劑盒，其特征在于組成檢測試劑盒的探針板，是由各種有機、無機或復合材料的膜、片、板等其中一種或幾種復合制成的形狀為無凹凸結構的各種形狀的孔或池形板，板面上有一個或多個選擇性反應器，每個反應器內固定有檢測特異反應所要求的、可以隨機分布的形式或非隨機分布的形式分布的用以捕捉目標抗原和目標抗體發生選擇性特異反應的抗原探針和抗體探針。
3.按照權利要求1所述的新型試劑盒，其特征在于組成檢測試劑盒的標記系統，是含有分別能同特異抗原和特異抗體進行選擇反應的標記物。這些標記物是已標記的、具有選擇反應性的抗體、抗原和抗抗體。選擇反應性是指特異抗原和特異抗體之間的反應性，以及抗體與不同來源或制備的抗抗體發生反應或不發生反應的選擇性。本權利要求中的標記系統中包含有下列四種標記物配對中的一種A、已標記的針對目標抗原的特異抗體和針對目標抗體的特異抗原；B、已標記的針對目標抗原的特異抗體和針對目標抗體的特異抗抗體；C、已標記的針對目標抗原的特異抗體及針對目標抗體的特異抗原和特異抗抗體；D、在上述三種基本配對基礎上的各種衍生配對。
4.按照權利要求2所述的抗原抗體包被ELISA試劑盒，其特征在于其探針板是在孔內表面以隨機分布的方式固定有抗原和抗體探針的微孔板；其標記系統中含有能對探針捕捉的目標抗原和目標抗體進行標記的標記物。
5.按照權利要求2所述的抗原抗體芯片試劑盒，其特征在于其探針板上選擇性反應器中以非隨機方式固定有m種抗原探針(m等于和大于1)和n種抗體探針(n等于和大于1)；其標記系統中含有能對探針捕捉的目標抗原和目標抗體進行標記的標記物。
全文摘要
目前以抗－抗體反應為基礎的試劑盒，其探針板上一個反應器中都只是或者固定抗原，或者固定抗體，其標記系統中只包含或者對目標抗體或者對目標杭原進行標記的標記物，試劑盒中的一套反應物不能用于對一個樣品中的抗原和抗體同時進行測定。本發明的試劑盒其特征是在其探針板上的同一個選擇性反應器中，既固定有抗原又固定有抗體，其標記系統既能對探針捕捉的目標抗原又能對探針捕捉的目標抗體進行標記，只用一套反應物就可對同一樣品中不同的抗原和抗體進行定性和定量檢測，使檢測所需的反應器數目下降，檢測時間下降和檢測可比性提高，具有檢測經濟、快速、高效的優點。
文檔編號G01N37/00GK1402003SQ0211383
公開日2003年3月12日 申請日期2002年6月6日 優先權日2002年6月6日
發明者鄒方霖, 陳春生, 胡勁梅, 王建霞 申請人:成都夸常科技有限公司