一種利用膜分子gp130激活細胞生理調節機制篩選的激素的拮抗劑和超拮抗劑的制作方法

專利名稱：一種利用膜分子gp130激活細胞生理調節機制篩選的激素的拮抗劑和超拮抗劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用膜分子gp130激活細胞生理調節機制篩選的激素的拮抗劑和超拮抗劑。
正如人們所知，授予Genentec Inc.公司的專利WO 92/21029公開了一種測定生長激素和具有類似結構構象的配位體的激動劑或拮抗劑的方法。將可能的激動劑和拮抗劑與該激素的受體接觸，這將引起三元復合物的形成，該三元復合物包括一分子可能的激動劑或拮抗劑和兩分子所要被激動或拮抗的激素的受體。由配位體分子誘導的受體的二聚化說明該配位體具有兩個不同的反應位點(位點1和位點2)，在這些位點上進行誘變處理即有可能產生激動劑或拮抗劑。
現已驚奇地發現，類似于白細胞介素6(IL-6)的一組細胞激動素，即制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫親神經因子(CNTF)及白細胞介素11((IL-11)的配位體，誘導了受體復合物的形成，而膜分子gp130是其一部分。在該受體復合物中，這些細胞激動素的專一受體和膜分子gp130始終是作為共同成分存在。因此，有可能得出如下假定在這類激素中位點1和位點2與兩種不同的分子結合位點1與專一受體結合，位點2與gp130結合。
從下面的敘述中可以更清楚地看出，通過根據人生長激素受體(hGH)序列與所要研究的激素的受體序列之間的功能相似性構建受體復合物的三維模型，有可能對兩種位點進行鑒定。通過構建攜帶了既包括野生型也包括突變型激素的絲狀噬菌體庫(如M13)，可對相對于野生型激素對專一受體具有更大親和性的突變體(超激動劑或超拮抗劑)進行分離。
這里的IL-6及WO 92/21029中所舉例子的三維模型之間的差別導致以下假設螺旋A和C中的不同殘基組成了位點2。
按如下方式對人白細胞介素6分子進行模擬。從科學文獻中所能獲得的數據中知道，人白細胞介素6屬于這樣一類細胞激動素它具有四個螺旋，這些螺旋形成了其三維結構的核心。對人白細胞介素6的氨基酸序列進行分析以鑒定出最有可能形成螺旋的四個區。在下一階段，在計算機化的相互作用的圖解單元中對白細胞介素6分子的這四個螺旋進行模擬。開始，假定四個螺旋的定向與在生長激素或巨噬粒細胞集落刺激因子等激素中所看到的類似。為了將疏水氨基酸以最佳方式包褒在四個螺旋之間的空間中，對螺旋的相對位置進行調整。然后，模擬連接四個螺旋的環。
該白細胞介素6的三維模型保證了人白細胞介素6和其兩個受體低親和性受體gp80(位點1)和gp130信號轉導的高親和性受體(位點2)之間相互反應的兩個位點的鑒定。利用下述方法鑒定這兩個位點。通過比較序列發現，一族造血受體的所有成員均具有一共同區域，稱為細胞激動素識別區。這種序列上的相似性也說明包括兩種白細胞介素6受體gp80和gp130在內的各種受體的相應部分很可能具有結構上的相似性。與這些受體結合的細胞激動素均具有(或可預測有)一種為四螺旋基質的相似結構這一觀察結果強有力地支持這一假定通過細胞激動素識別區進行的這些細胞激動素及其受體之間的反應，在生物活性的復合物中一定非常類似。
鑒于已通過X-射線結晶法測定了這類化合物之一(由生長激素和生長激素的二聚受體的胞外區構成的復合物)的三維結構，我們的人白細胞介素6模型使我們能夠鑒定出白細胞介素6與其兩個受體gp80(位點1)和gp130(位點2)反應的可能位點。它是通過與涉及生長激素的復合物相比較并假定功能上重要的氨基酸位于兩種激素表面上相似的位置而實現的。
下面以白細胞介素6為例，解釋提供一種生產其受體復合物包括gp130的免疫系統激素的激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的方法的必要性。
已知白細胞介素6是一種184個氨基酸的多肽，它屬于螺旋細胞激動素類。白細胞介素6是一種由各種類型的細胞產生的多功能的細胞激動素。在例如免疫系統中的細胞、肝細胞、腎細胞、造血細胞、角質化細胞及神經元等各種類型的細胞上，白細胞介素6的功能是作為分化和生長因子。
白細胞介素6的超激動劑的產生將使及在各種嚴重疾病的治療中可使用比野生型白細胞介素6更低的治療劑量。事實上，白細胞介素6在治療乳腺癌、白血病、傳染病或與產生骨髓的細胞紊亂有關的疾病方面具有重要和有希望的應用價值。
另一方面，在其特征是白細胞介素6過量產生的各種疾病，如慢性自體免疫疾病、骨髓瘤/漿細胞瘤、經絕后骨質疏松癥和癌血癥中，人白細胞介素6的拮抗劑或超拮抗劑的產生將抑制白細胞介素6。
本發明篩選利用膜分子gp130激活細胞生理調節機制的激素的超激動劑、拮抗劑或超拮抗劑的方法包括下列步驟—比較生長激素的氨基酸序列與該激素的序列；—比較生長激素受體的氨基酸序列與所研究激素的兩種受體即激素專一性受體和gp130的序列；—在上述比較的基礎上，根據生長激素受體和所研究的兩種激素受體序列之間的功能相似性，構建受體復合物的三維模型；及—鑒定出分別為與專一受體反應的位點的一部分和與gp130反應的位點的一部分的野生型所研究激素的殘基。
所研究的激素可選自白細胞介素6(IL-6)、制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫親神經因子(CNTF)和白細胞介素11(IL-11)。
為了篩選白細胞介素6的超激動劑，本發明的方法進一步包括下列附加步驟一產生一系列噬菌體庫，它們含有以與絲狀噬菌體蛋白融合的形式存在的白細胞介素6的下列野生型殘基的突變Glu 42，Glu 51，Ser 52，Ser 53，Lys 54，Glu 55，Asn 63，Lys 66，Met 67，Ala 68，Glu 69，Lys 70，Asp 71，Phe170，Gln 175，Ser 176，Ser 177，Leu 181，Gln 183；—產生其每一噬菌體均具有突變的白細胞介素6序列的噬菌體庫；—從表達白細胞介素6突變體的噬菌體混合群體中篩選出其對專一受體的親和性大于野生型白細胞介素的噬菌體；—通過對從篩選的噬菌體顆粒提取的DNA進行測序而鑒定出結合受體的最佳氨基酸序列；在這種情況下，可產生一系列噬菌體庫，它們含有以與M13的蛋白質pIII融合的產物形式存在的白細胞介素6的所述野生型殘基的突變。
本發明篩選白細胞介素6的拮抗劑的方法除包括上面所述的操作外還包括如下操作步驟—利用常規分子生物學技術對所研究激素的野生型殘基進行突變，形成與gp130反應的部分位點(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；—對上面產生的突變體的生物活性及其與專一白細胞介素6受體的親和性進行評估，以鑒定出其與專一受體的親和性完整而其生物活性降低或喪失的白細胞介素6的變異體；—對作為拮抗劑的上述白細胞介素6的變異體的野生型白細胞介素6生物活性進行評估。
在篩選白細胞介素6的超拮抗劑時，是將上面所述的負責拮抗劑活性的氨基酸序列的改變與負責提高白細胞介素6的專一受體的親和性的氨基酸的改變相結合。
在篩選白細胞介素6的拮抗劑或超拮抗劑的方法中，可選擇下列分子生物學技術對上面所鑒定的殘基進行誘變聚合酶鏈反應、引物延長、寡核苷酸定點誘變及其組合。
本發明并不限于篩選白細胞介素6的激動劑、拮抗劑或超拮抗劑。相反，它擴展到利用膜分子gp130激活細胞生理調節機制的激素的激動劑、拮抗劑和超拮抗劑，這一目的是通過利用上面所述的篩選方法達到的。
至此，已給出了對本發明主題的一般描述。下面將借助實施例更詳細地描述本發明的具體實施方案，其目的在于更好地理解本發明的目的、特征、優點及其應用方法。


圖1顯示了pHenΔhIL-6的構建及用于篩選hIL-6的激動劑的噬菌質顆粒的產生(見實施例1“載體構建”)。
圖2顯示了隨著其濃度提高的突變體IL-6 Tyr31/Asp/Gly35Phe/Ser118 Arg/Val 121 Asp的拮抗活性的變化。
保藏大腸桿菌K12-被質核pHenΔhIL-6轉化，從識別限制酶Sal I的位點至識別限制酸NotI的位點插入的該質粒含有編碼野生型人白細胞介素6的氨基酸序列的核苷酸序列—已于10/6/1993保藏于The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB，Aberdeen，Scotland，Uk)，其保藏編號為NCIMB 40563。
實施例1本發明的方法用于篩選白細胞介素6的激動劑1)載體構建所使用的策略包括構建一種雜交基因，它含有所有hIL-6編碼區，在其后面的則是噬菌體M13的蛋白質pIII的最后157個氨基酸，而在其前面的則是序列Pel B，它將所合成的蛋白質運載至漿膜外周間隙。
雜交基因的表達由啟動于lacz啟動。構建是在載體PHenΔe的基礎上進行，且取名為pHenΔhIL-6(見唯一的附圖)。該質粒也含有噬菌體復制起點。如果被稱為“助手”的噬菌體(如M13K07)感染了含有該質粒的細菌細胞，則該質粒將產生單絲拷貝，且該單絲拷貝將會象真正的噬菌體基因組那樣被噬菌體蛋白所包裹。這些含有質粒的噬菌體顆粒被稱為噬菌質(phasmids)。除了正常的PIII分子外，它們也含有hIL6-pIII融合分子，因此，hIL-6分子及編碼其氨基酸序列的基因包含在同一單位中。在突變分子的情況下，將有可能簡單地通過質粒DNA測序測定出暴露在由上述篩選方法獲得的噬菌體表面上的分子的氨基酸序列。
構建pHen hIL-6的另一個特征是在IL-6基因和pIII基因之間存在轉譯終止密碼。該雜交蛋白質的產生是在能夠抑制該終止密碼的細菌菌株中進行。相反，使用非抑制菌株將直接在漿膜外周間隙中單獨產生hIL-6。
下面的實驗說明，利用ShrIL-6R，通過擴增篩選循環從暴露在利用pHenhI1-6的噬菌體上的大量突變白細胞介素-6中純化與所說受體具有更大親和性的突變體的能力。
2)系統鑒定實驗a)ELISA試驗在ELISA平板的孔中涂上hIL-6質粒或M13K07質粒，并使其與shrIL-6R(可溶性人重組IL-6R)反應。反復洗滌后，利用與堿性磷酸酶連接的專一單克隆抗體證實受體的存在。所獲得的信號大于hIL-6質粒，且隨所用受體量的增加而增加。
b)利用shrhIL-6R從與質粒K07的混合物中富集hIL-6質粒按1∶100的比例混合hIL-6質粒顆粒和M13K07顆粒。將該混合物與涂有shrIL-6R的聚苯乙烯珠一起保溫。于中性pH下反復洗滌后，將珠于pH4.2下充分洗滌，然后于pH3.6洗脫。測定所得洗洗脫液中hIL-6質粒M13K07的比例，發現它為1∶10，結果是與M13K07相比hIL-6質粒富集了10倍。
c)從突變白細胞介質素6的混合物中篩選對受體gP80具有最高親和性的突變體產生在其表面具有hIL-6突變分子的質粒顆粒，該突變體與天然情況相比具有較高(176Arg)或較低(179Ala)受體親和性。將這些顆粒按1∶1的比例混合。將該混合物與受體一起在一固相中保溫(見b)所述)。在pH3.6的洗脫液中，兩類顆粒的比例為15∶1，176Arg占多數。
d)測定M13K07、hIL-6質粒、176Arg質粒和179Ala質粒顆粒對受體gp80的相對親和性將等量的上面所列舉的各種類型的顆粒單獨與涂有受體的珠一起保溫。經常規洗滌程序后，測定從每類噬菌體的pH3.6洗脫液中回收的顆粒數。以從質粒hIL-6質粒中回收的顆粒值作為1，則所獲得的176Arg值為3，179Ala值為0.2，M13K07值為0.8。這些值反映了未暴露在噬菌體上的IL-6分子的相對親和性。事實上，由此可知，176Arg給合受體的親和性要比天然分子大三倍，而179Ala對受體的親和性幾乎降至零(事實上具有這種突變的質粒在與受體結合方面類似于M13K07)。這組實驗已說明，有可能利用本發明的方法從暴露于噬菌體上的突變體混合物中篩選出對受體具有最大親和性的突變性。
實施例2利用本發明的方法產生和篩選白細胞介素6的拮抗劑以質粒PhenΔhIL-6作為所有誘變反應的模板。該質粒為pHEN1質粒的衍生物，且含有人IL-6編碼區(SEQ ID NO1)及其下游的噬菌體M13的PIII蛋白羧基末端部分(從密碼250至COOH末端)編碼區；這兩個編碼區位于閱讀框架中并由Amber UAG終止密碼子隔開，該密碼子可被其基因組中整合了壓制基因SupE的細菌菌株壓制。人IL-6編碼區也位于閱讀框架中，在肽PelB(一種分泌信號序列)之下，且整個該基因由啟動子lacZ控制。最后，在編碼hIL-6的氨基酸20-21-22的核苷酸序列處引入限制酶SacI的單一位點而不改變其同一性，同樣，在hIL-6的氨基酸38-39-40編碼區引入限制酶BfrI的單一位點而不改變它們。
利用PCR方法(聚合酶鏈反應)在人白細胞介6編碼區內選擇的密碼子處產生突變。引物下游為H9，它為一種32核苷酸引物，對應于hIL-6 cDNA的位置426-457(反義細絲)(取成熟多肽的第一個密碼子的第一個核苷酸為1)。引物雜交位點位于天然存在于cD-NA中的酶xbaI識別位點下游。誘變引物上游為IL-6 31D/35PCR，它是一種70核苷酸引物，其序列為SEQ ID No2。
引物IL-6 31D/35 PCR從hIL-6 cDNA的位置55延伸至124(有意義絲)并引起編碼氨基酸31(野生型Tyr)和35(野生型Gly)的密碼子變性。按照標準PCR擴增方法擴增403對堿基的DNA片段。擴增通過35次循環完成。每一循環包括于94℃保溫2分鐘使模板變性，于50℃保溫2分鐘使寡核苷酸雜交，及于72℃保溫3分鐘使鏈延長。用SacI和xbaI消化擴增片段，并用2％瓊脂糖凝膠純化。將通過PCR產生并被上述兩種酶消化的片段與同樣被這兩種酶消化并在0.8％瓊脂糖凝膠上純化的載體pHen hIL-6連接，以取代野生型序列。
下面的表1顯示了野生型白細胞介素6及其突變體在人肝細胞瘤細胞中的生物活性及與受體gp80的結合，突變處用星號標出。
表1野生型白細胞介素6及其螺旋A突變體的受體結合性和生物活性
從上可以看出，與野生型白細胞介素6相比突變體(Tyr 31 Asp，Glg 35 Tyr)、(Tyr 31 Asp，Gly 35 Phe)和(Tyr 31 Asp，Gly 35 Leu，Glu 42 Ala)顯示出較低的生物活性。在所有這些情況下，殘余活性為野生型白細胞介素6的2-5％。這三個突變體維持了與白細胞介素6受體gp80結合的全部能力。總之，這三種突變體在肝細胞瘤細胞中的信號轉導活性降低，換之言，它們是野生型白細胞介素6的拮抗劑。具體地，突變體(Tyr 31 Asp，Gly 35 Phe)是尤其有效的拮抗劑，因為當以50倍摩爾過量使用于肝細胞瘤細胞試驗時它能夠降低野生型白細胞介素-6的活性。
實施例3利用本發明的方法產生和篩選白細胞介素6的其它拮抗劑以前一實施例中所述的質粒pHenΔhIL-6作為所有誘變反應的模板。利用PCR法(聚合酶鏈反應)在人白細胞介素6編碼區內選定的密碼子上產生突變。引物為HP/1，它是一個具有29個核苷酸、對應于hIL-6 cDNA的位置1-19(有意義絲)(取成熟多肽的第一密碼子的第一個核苷酸為1)的引物。引物雜交位點位于酶SacI識別位點上游，該識別位點如實施例2中所述被人工引入cDNA，而不改變由后者編碼的序列。位于誘變引物之下的是IL-6 118 RCLF/121 VD，它是一個72核苷酸引物，其序列為SEQ ID No.3。
引物IL-6 118 RCLF/121 VD從hIL-6 cDNA的位置334延伸至位置405(反義絲)并引起編碼氨基酸118(野生型Ser)和121(野生型Val)的密碼子的變性。利用標準的PCR擴增法擴增有415對堿基的DNA片段，擴增通過35次循環完成。每一循環包括于94℃保溫2分鐘以使模板變性、于50℃保溫2分鐘以使寡核苷酸雜交和于72℃保溫3分鐘以延長鏈。用SacI和xbaI消化擴增后的片段，并用2％瓊脂糖凝膠純化。將通過PCR產生并用兩種酶消化的片段連接至被同樣兩種酶消化并在0.8％瓊脂糖膠上純化的載體pHenΔhIL-6中，以取代野生型序列。
下面的表2顯示了野生型白細胞介素6和在所示殘基處發生突變的突變體在人肝細胞瘤細胞中的生物活性及與受體的結合性。
表2野生型白細胞介素6及其螺旋C突變體的受體結合性和生物活性
可以看出，突變體IL-6 Ser 118 Arg/val 121 Asp具有非常類似于表1所述突變體IL-6 Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe的特征，即它能與白細胞介素6的I型受體正常結合，但其細胞激動素活性約降低了30倍。
實施例4利用本發明方法產生和篩選白細胞介素6的更強拮抗劑在這一實施例中，是以實施例2中所獲得的質粒pHenΔhIL-6Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe作為所有突變反應的模板。
利用PCR法(聚合酶鏈反應)在人白細胞介素6編碼區中選定的密碼子上產生突變。上面的引物為前一實施例中所述的HP/1。誘變引物下面是也在前一實施例中所述的IL-6 118 RCLF/121 VD。按照標準PCR擴增法擴增有415對堿基的DNA片段。擴增通過35個循環完成。每一循環包括于94℃保溫2分鐘以使模板變性、于50℃保溫2分鐘以使寡核苷酸雜交及于72℃保溫3分鐘以使鏈延長。用SacI和xbaI消化擴增的片段并用2％瓊脂糖凝膠純化。將通過PCR產生并被兩種酶消化的片段與被同樣兩種酶消化并在0.8％瓊脂糖凝膠上純化的載體pHenΔhIL-6連接，以取代野生型序列。
下面的表3顯示了野生型白細胞介素-6及其在所示殘基上發生突變的各種突變體在肝細胞瘤細胞中的生物活性及受體結合性。
表3
野生型白細胞介素6及其螺旋A和C突變體的受體結合性和生物活性
N.D.＝未測定在螺旋A和C上均發生突變的三個變異體均未在人肝細胞瘤細胞中顯示出生物活性的跡象，而維持了它們與受體gp80結合的能力。在這三種蛋白質中，選擇突變體IL-6 Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe/Ser 118 Arg/Val 121 Asp與野生型白細胞介素6在人肝細胞瘤細胞中的生物活性進行競爭實驗。在不斷提高突變物濃度的情況下，以4毫微克白細胞介素6/毫升培養基(ng/ml)刺激細胞。如圖2所示(其中野生型白細胞介素6的生物活性以任意單位表示)，隨著突變物濃度的不斷提高，最終完全拮抗了野生型白細胞介素6對人肝細胞瘤細胞的作用。
表4顯示了依據拮抗劑的濃度(分別以ng/ml，相對于野生型白細胞介素6的摩爾過量和nmole/l表示)的抑制野生型白細胞介素6的生物活性的水平(％)。
表4根據拮抗劑濃度產生的野生型白細胞介素6生物活性的抑制
實施例5利用本發明方法產生和篩選的白細胞介素6拮抗劑抑制白細胞介素6依賴性人骨髓瘤細胞的生長在前一實施例中，已證實突變體之一，即IL-6 Tyr 31Asp/Gly35 Phe/Ser 118 Arg/Val 121 Asp能夠抑制白細胞介素6對人肝細胞瘤細胞的生物活性(通過白細胞介素6誘導的啟動子刺激轉錄)。在本申請的前序部分已指出，開發白細胞介素6拮抗劑或超拮抗劑具有實際應用，因為在其特征是白細胞介素6過量產生的疾病如各種形式的多發性骨髓瘤/漿細胞瘤中可用它們抑制白細胞介素6活性。我們在這里再提供一實例以證實下列三個突變體能夠完全抑制白細胞介素6依賴性的人骨髓瘤細胞系xG-1的生長IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp(DFRD)，IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Phe/Val121Asp(DFFD)，IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Leu/Val121Asp(DFLD)xG-1得自從晚期患者的骨髓瘤細胞中剛剛分離的細胞。與新鮮骨髓瘤細胞所示情況類似，xG-1骨髓瘤細胞系的生長嚴格地依賴于外源加入的白細胞介素6，因此該細胞系可被認為是多發性骨髓瘤疾病的良好體外模型(Jourden，M.，Zhang，x-G，Portier，M.Boiron，J.-M.，Bataille，R.and Klein，B(1991)J.lmmunol.147，4402-4407)。為了試驗突變物對野生型白細胞介素6的拮抗作用，將xG-1骨髓瘤細胞按6000細胞/微孔的濃度培養于96孔微滴定板上，且其中野生型白細胞介素6的濃度為0.1ng/ml，而三種突變體的濃度則不斷提高。培養7天后，通過比色測定氨基己糖苷酶水平(Lan-degren，u，(1984)J.Innunol Methods 67，379-388)評價細胞數。下面的表5顯示了對野生型白細胞介素6活性的抑制作用與三種拮抗劑濃度(以每毫升培養基中突變物的毫微克表示)的函數關系。
表5
野生型白細胞介素6活性(刺激XG-1人骨髓瘤細胞生長)抑制與三種拮抗劑濃度的關系
從上表可以看出，所有突變物均是白細胞介素6對人骨髓瘤細胞生物活性的非常有效的拮抗劑。
實施例6應用本發明的方法篩選新的白細胞介素6超激動劑利用引物延長分子生物學技術構建噬菌體庫(含有野生型白細胞介素6的殘基Gln 175、Ser177、Leu 181和Leu 183突變，以與絲狀噬菌體蛋白融合的產物形式存在)。突變寡核苷酸為IL-6 QSLQ(AS)，它為一種62核苷酸寡聚物，其序列為SEQ ID No4。引物IL-6 QSLQ(AS)從白細胞介素6 cDNA(反義鏈)的位置507延長至終止密碼子，它引起編碼氨基酸175(野生型Gln)、177(野生型Ser)、181(野生型Leu)和183(野生型Gln)的密碼子的變性，并在白細胞介素6終止密碼子的下游引入了Not I限制位點。利用其序列為SEQ ID No5的寡核苷酸IL-6 QSLQ pr.Bam作為引物延長反應的引物。寡核苷酸IL-6 QSLQ pr.Bam從白細胞介素6 cDNA的位置503延長至522(有意義鏈)，且在其5’端九核苷酸中含有Bam HI限制位點。這兩個寡核苷酸在對應于白細胞介素6 cDNA的位置507-522的區域上相互互補。將這兩種寡核苷酸體外退火，并用退火后的寡核苷酸作為引物延長反應(利用Klenow酶進行)的底物，然后將由此獲得的雙鏈DNA片段用Bam HI(與BgIII相容)和Not I消化，并連接至用BglII(與BamHI相容)和NotI消化的質粒phenΔhIL-6上，以用突變序列取代野生型序列。將連接產物插入細菌，產生約一百萬個獨立的轉化體(“轉化體”是對加進了重組質粒的細菌的定義)。用M13K07助手噬菌體感染轉化的細菌，如實施例1所述產生噬菌體庫(質粒庫)。
如實施例1所述，通過與包裹shrIL-6R的聚苯乙烯珠一起保溫篩選該庫。于pH3.6洗脫噬菌體群體，然后在細菌中擴增。經五次篩選-擴增循環后，對任選噬菌體的突變區進行測序。在合適的細菌菌株的漿膜外周間隙中產生相應的突變白細胞介素6蛋白(如實例1所述)，并測試其受體結合性及在人肝細胞瘤細胞上的生物活性。下表6說明，通過利用本發明的方法就有可能篩選出白細胞介素6的超激動劑，它們是一些在人肝細胞瘤細胞上的受體結合性和生物活性均得到提高的突變分子。
表6野生型白細胞介素6和其螺旋D突變體的受體結合性和生物活性
利用本發明的方法篩選的突變體可作為開發更有效的白細胞介素6超激動劑的起點。這一點可從本實施例中看出，其中將在噬菌體5-2中鑒定出的突變與突變體Ser 176 Arg相結合，現有技術中已知后一突變體既提高了受體結合性也提高了生物活性(見由本申請人于93.11.2提交的PCT申請的國際公開WO 94/11402，其優先權日為92.11.6)。通過針對寡核苷酸的誘變使三種突變分組在同一cDNA上。寡核苷酸175 I/176R/183A(S)(其序列為SEQ ID No6)有73個核苷酸長，它從存于phen hIL-6中的白細胞介素6 cDNA的位置499延伸至終止密碼子(有意義鏈)且在其終止密碼子下游有-Not I酶識別位點。其序列為SEQ ID No7的寡核苷酸175I/176R/183A(AS)為73個核苷酸長的核苷酸，它從存在于phenΔhIL-6中的白細胞介素6cDNA的位置499延伸至終止密碼子(反義鏈)且在終止密碼子的上游有-NotI酶識別位點。這兩個寡核苷酸彼此互補，且它們均在位置175處編碼異亮氨酸(ILe)、在176處編碼絲氨酸(Ser)及在183處編碼丙氨酸(Ala)，將這兩種寡核苷酸體外退火，由此獲得的雙鏈DNA片段用限制酶BglII和NotI消化，并連接至被同樣的兩種酶消化的載體phenΔhIL-6中，以用突變序列取代野生型序列。在合適的細菌菌株的漿膜外周間隙中產生攜帶了三種所需突變的相應白細胞介素6變異物(如實施例1所述)，并測試其在人肝細胞瘤細胞上的受體結合性和生物活性。下面的表7顯示了新的三突變體和原來的雙突變體在人肝細胞瘤細胞上的受體結合性和生物活性。
表7野生型白細胞介素6和螺旋D中的雙突變和三突變物的受體結合性和生物活性
從上表可以看出，與僅攜帶兩取代物Gln 175 Ile/Gln.183 Ala的親代突變體相比，攜帶了取代物Gln 175 Ile/Ser 176 Arg/Gln 183 Ala的突變體是更有效的白細胞介素6超激動劑。
實施例7應用本發明的方法篩選白細胞介素6的超拮抗劑通過PCR法，將實施例6中所鑒定的受體結合能力大大提高的三突變體Gln 175 Ile/Ser 176 Arg/Gln 183 Ala與實施例4和5所述的顯示出最強拮抗能力的四突變體Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe/Ser118Arg/Val 121 Asp結合。相應的突變蛋白稱為SAnt1，它含有所有七種突變，對其受體結合性及在人肝細胞瘤細胞和骨髓瘤細胞上的拮抗活性均進行了試驗。下面的表8顯示了SAnt1和DFRD(產生SAnt1的突變體)的受體結合性以及抑制白細胞介素6生物活性50％所需的突變體的量(每毫升培養基的突變物毫微克數)(用4ng野生型白細胞介素6/ml培養基刺激肝細胞瘤細胞，用0.1ng白細胞介素6/ml培養基刺激骨髓瘤細胞，因為后者對野生型白細胞介素6更敏感)。
表8對野生型白細胞介素6在人肝細胞瘤和骨髓瘤細胞上的活性的抑制作用與拮抗劑受體結合能力的關系
從上表可以看出，實施例6所述的三突變(Gln 175 Ile/Ser 176Arg/Gln 183 Ala)的引入立即增加了親代突變體DFRD的受體結合能力，并大大降低了50％抑制白細胞介素6在所有試驗細胞系上的生物活性所需的拮抗劑的量，從而產生非常有效的白細胞介素6超拮抗劑。
序列表總信息(i)申請人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECO-LARE P.ANGELETT1 S.P.A.
(ii)發明名稱以GP130作為其受體一部分的激素的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的篩選方法(iii)序列數7(iv)相關地址(A)收信人Societa Italiana Brevetli(B)銜道Piazza de Pietra，39(C)城市羅馬(D)國家意大利(E)郵政編碼I-00186(viii)代理人信息(A)姓名ID CERBO，Mario(Dr.)(C)卷號RM/090075/MDC(ix)通信信息(A)電話06/6785941(B)傳真06/6794692(C)電傳612287 RORAT
(1)SEQ ID No1的信息(i)序列特征(A)長度555對堿基(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲性線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(iv)反義無(v)片段類型內在的(vii)直接來源(A)合成在細菌中產生(ix)其它特征(A)名稱IL-6 cDNA(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO1
CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA 48Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg1 5 10 15CAG CCA CTC ACG AGC TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC 96Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile20 25 30CTC GAC GGC ATC TCA GCC TTA AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC 144Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn35 40 45ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT 192Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu50 55 60CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG 240Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu65 70 75 80GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA 288Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val85 90 95TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC 336Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala100 105 110AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA 384Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys115 120 125AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT 432Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn130 135 140GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC 480Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp145 150 155 160ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG AGA TCT TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC 528Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser165 170 175AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG 555Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met180
(2)SEQ ID No2的信息(i)序列特征(A)長度70對堿基(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲性線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定無(iv)反義無(v)片段類型內在的(vii)直接來源(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)其它特征(A)名稱IL-631 D 35 PCR(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO2CGCACGAGCT CAGAACGAAT TGACAAACAA ATTCGGKACA TCCTCGACYD TATCTCAGCC 60TTAAGAAAGG 70(3)SEQ ID No3的信息(i)序列特征(A)長度72個核苷酸
(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲性線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定無(iv)反義有(v)片段類型內在的(vii)直接來源(A)合成寡核苷合成儀(ix)其它特征(A)名稱IL-6 118 RCLF/121VD(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO3CGCATCTAGA TTCTTTGCCT TTTTCTGCAG GAACTGGATC AGGWCTTTTG TGMRCATCTG 60CACAGCTCTG GC 72(4)SEQ ID No4的信息(i)序列特征(A)長度62個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲性線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定無(iv)反義有(v)片段類型羧基末端(vii)直接來源(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)其它特征(A)名稱IL-6 QSLQ(AS)(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO4CCGGGCGGCC GCCCTACATM NNCCGMNNAG CCCTCAGMNN GGAMNNCAGG AACTCCTTAA60AG 62(5)SEQ ID No5的信息(i)序列特征(A)長度24個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲性線性(ii)分子類型合成DNA
(iii)假定無(iv)反義無(v)片段類型內在的(vii)直接來源(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)其它特征(A)名稱IL-6 QSLQ pr.Bam(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO5CGCGGATCCT TTAAGGAGTT CCTG 24(6)SEQ ID No6的信息(i)序列特征(A)長度73個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲性線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定無(iv)反義無
(v)片段類型羧基末端(vii)直接來源(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)其它特征(A)名稱175I/167R/183A(S)(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO6GCCTGAGATC TTTTAAGGAG TTCCTGATCC GTAGCCTGAG GGCTCTTCGG GCTATGTAGG60GCGGCCGCAT GGC 73(7)SEQ ID No7的信息(i)序列特征(A)長度73個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲性線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定無(iv)反義有(v)片段類型內在的(vii)直接來源
(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)其它特征(A)名稱175I/167R/183A(AS)(C)鑒定方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCATGCGGC CGCCCTACAT AGCCCGAAGA GCCCTCAGGC TACGGATCAG GAACTCCTTA 60AAAGATCTCA GGC7權利要求
1.一種利用膜分子gp130激活細胞生理調節機制的方法篩選的激素拮抗劑和超拮抗劑，所述方法包括以下操作步驟-將生長激素的氨基酸序列與所述激素的氨基酸序列進行比較；-將生長激素受體的氨基酸序列與所述激素的兩種受體，即激素專一性受體和gp130的氨基酸序列相比較；-在上述比較的基礎上，根據生長激素受體和所述的兩種激素受體序列之間的功能相似性，構建受體復合物的三維模型；-對分別構成與專一性受體反應的位點和與gp130反應的位點的一部分的野生型所述激素的殘基進行鑒定，從而獲得拮抗劑和超拮抗劑。
2.根據權利要求1的拮抗劑和超拮抗劑，其中所研究的激素選自白細胞介素6、制癌蛋白M、白血病抑制因子、睫親神經因子和白細胞介素11。
3.根據權利要求2所述的拮抗劑和超拮抗劑，其中所研究的激素為白細胞介素6，所述方法進一步包括下列附加步驟用于篩選白細胞介素6的拮抗劑-利用常規分子生物學技術對權利要求1中所鑒定的殘基進行誘變，形成與gp130反應的位點的一部分(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；-評估上面所產生的突變體的生物活性和與專一性白細胞介素6受體的親和性，以鑒定其與專一受體的親和性完整且生物活性降低或喪失的白細胞介素6的變異體；-對作為拮抗劑的上述白細胞介素6變異體的野生型白細胞介素6生物活性進行評估。
4.根據權利要求2或3所述的拮抗劑或超拮抗劑，它是通過將上面所述的負責拮抗活性的氨基酸序列的改變與負責提高白細胞介素6的專一受體親和性的氨基酸的改變相結合，篩選得到的白細胞介素6的拮抗劑或超拮抗劑。
5.根據權利要求4所述的拮抗劑或超拮抗劑，其中上面所鑒定的殘基的誘變是通過采用選自聚合酶鏈反應、引物延長、寡核酸針對性誘變及其組合的分子生物學技術完成。
全文摘要
已發現類似白細胞介素6(IL－6)的一組細胞激動素，即Onco－statin M(OSM)、白血病抑制因子(LIP)、睫親神經因子(CNTF)和白細胞介素11(IL－11)的配位體誘導膜分子gp130是其一部分的受體復合物的形成。因此有可能得出如下假定稱為位點1和位點2的兩個不同的蛋白質表面與兩種不同的分子結合位點1與專一性受體結合，而位點2與gp130結合。利用本發明，可鑒定這些位點并分離出野生激素的變異體，它們具有更大的專一受體親和性(激動劑和超激動劑)或對gp130的親和性降低或喪失(拮抗劑和超拮抗劑)。
文檔編號G01N33/74GK1538176SQ02107480
公開日2004年10月20日 申請日期1994年6月23日 優先權日1993年6月23日
發明者R·薩維諾, A·拉姆, G·西利布爾托, R 薩維諾, 級 申請人:布·安格萊荻公司分子生物學研究所, 布 安格萊荻公司分子生物學研究所