專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及能迅速、高精度并且簡便地定量試液中特定成分的生物傳感器，尤其是膽固醇傳感器。
背景技術：
作為現有的生物傳感器的一例，說明葡萄糖傳感器。
一般，廣為人知的葡萄糖定量法是將葡萄糖氧化酶和氧電極或者過氧化氫電極相組合的方法。葡萄糖氧化酶以氧作為電子介質選擇地氧化基質β-D-葡萄糖而生成D-葡糖酸-5-內酯，同時，氧被還原為過氧化氫。對葡萄糖的定量可以通過氧電極來測定這時的氧消耗量，或是通過由鉑電極等構成的過氧化氫電極來測定過氧化氫的生成量。
但是，用上述方法，根據測定對象，會受溶氧濃度的很大影響且在無氧的條件下不可能進行測定。因此，開發了不用氧作為電子介質，而用鐵氰化鉀、二茂鐵衍生物、醌衍生物等的金屬絡合物和有機化合物來作為電子介質的類型的葡萄糖傳感器(日本公開特許公報1990年第062952號)。
此生物傳感器具有用絲網印刷等方法在絕緣性基板上形成的由測定極、對電極和參照極構成的電極系和在此電極系上形成的含有親水性高分子、氧化還原酶和電子介質的酶反應層。必要時可以添加緩沖劑在此酶反應層中。
如將含有基質的試液滴在此生物傳感器酶反應層上，酶反應層即溶解，酶和基質反應，同時電子介質被還原。酶反應結束后，可以從電化學氧化此被還原了的電子介質而生成的氧化電流值求出試液里的基質濃度。
用此類型傳感器可以以氧化電流值求得葡萄糖的濃度。此電流是在電極上氧化由酶反應結果生成的電子介質的還原體而生成的。
這樣的生物傳感器因為用了以測定對象作為基質的酶，所以，對于各種物質，在原理上都可能進行測定。例如，如用膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶及膽固醇酯酶作為氧化還原酶，就可以測定用作各種醫療機構診斷指標的血清中膽固醇值。
因為膽固醇酯酶的酶反應進行得非常慢，所以通過添加適當的表面活性劑，來提高膽固醇酯酶的活性，可以縮短整個反應所需要的時間。
但是，由于在反應系內含有表面活性劑，此活性劑就會對血球產生不良影響，就不可能用全血測定。
如上面所述，在測定血液中的膽固醇值的情況下，因為在反應系中含有表面活性劑，所以此活性劑就對血液中的紅血球產生不良影響。因為此原因，就不能像葡萄糖傳感器一樣測定全血。因此，就提出為了迅速地僅提供濾除了紅血球的血漿給傳感器，在試液供給通路的開口部附近配置過濾部件。但是，因為過濾后的血漿流入傳感器的速度慢，不能保證恒定，所以應答值有波動，且血漿進入傳感器時，常常有氣泡生成，使測定變得不可能。
本發明目的為提供一種避免上述弊端，使過濾了血球的血漿迅速地到達電極系的經改良的生物傳感器。
本發明還有提供一種高精度和應答性優異的以全血作為測定對象的膽固醇傳感器的目的。
發明內容
本發明生物傳感器具有絕緣性基板、在此基板上配置的含有測定極和對電極的電極系、至少含有氧化還原酶和電子介質的反應層、含有前述電極系和反應層的試液供給通路、試樣供給部分和在此試樣供給部分和試液供給通路之間設置的過濾血球的過濾器，并可以將經上述過濾器過濾了血球的血漿利用毛細現象吸引到上述的試液供給通路內。上述過濾器，其特征在于此過濾器進口側的截面積比上述的試液供給通路的開口部截面積大。
這里用的過濾器由三維連接的具有空隙部的多孔體構成，此多孔體具有利用毛細作用將血液從上述試樣供給部分向試液供給通路一側移動、利用血漿和血球之間的流通阻力差來過濾血球的作用。用由玻璃纖維、纖維素、紙漿等最好是的親水性的纖維構成的無紡布、濾紙和其它的多孔質體制作此過濾器。
上述過濾器，其進口側截面積最好等于或大于位于試液供給通路的開口部的輸出側截面積。
圖1是本發明一實施方式的生物傳感器縱向剖面圖。
圖2是同一傳感器除去反應層、隔離物和蓋板的平面圖。
圖3是同一傳感器的分解立體圖。
圖4是同一傳感器的重要部分的放大剖面圖。
圖5是顯示傳感器的試樣供給部分結構實例的縱向剖面圖。
圖6顯示傳感器的過濾器的變形例的平面簡圖。
圖7顯示傳感器的過濾器的變形例的縱向剖面簡圖。
圖8是本發明的其它實施方式的傳感器的縱向剖面圖。
圖9是同一傳感器的分解立體圖。
圖10是顯示傳感器的過濾器的變形例的縱向剖面簡圖。
圖11是比較例的傳感器的縱向剖面圖。
圖12是同一傳感器的平面圖。
圖13是顯示本發明的實施例和比較例的膽固醇傳感器應答特性的圖。
具體實施例方式
如上面所述，本發明是利用過濾器除去干擾物質血球，快速地使血漿流入傳感器電極系的生物傳感器。即，本發明是在含有電極系和反應層的試液供給通路和試樣供給部分之間，配置具有過濾血球作用且進口側截面積比試液供給通路的開口部截面積大的過濾器，利用此過濾器通過毛細現象將過濾了血球的血漿吸引到試液供給通路內的生物傳感器。
本發明較好的實施方式是試液供給通路形成在上述基板和與此基板相組合的蓋板部件之間。
本發明其他的較好實施方式是至少覆蓋于上述過濾器和試液供給通路上的上述蓋板部件為透明。
為了向電極系快速導入分離過血球的血漿，最好還要滿足以下任一條件1)試液供給通路截面積等于或小于試液供給通路的開口部截面積。
2)過濾器，其電極一側的端部的截面積等于或小于導入試液一側，即進口側截面積。
3)在不妨礙過濾器膨脹的情況下，將其用支持體支持。
即，更好的構造是從面對試樣供給部分的過濾器進口側到在試液供給通路終端開口的空氣孔一側之間的傳感器內的試液流動的中空部分和過濾器截面積慢慢變小。
在過濾器電極一側的前端部截面積小的情況下，過濾器整體形狀為凸型、圓錐型、梯型等。
過濾器的前端部截面積小指的是支持過濾器電極一側的前端的部在試液供給通路中變窄。
為了完全地除去干擾物質的血球，試液必須通過過濾器，為此過濾器配置于試樣供給部分和試液供給通路之間的空間范圍里，且最好有一個以上與過濾器支持部不接觸的部位，即，環繞過濾器表面一周的空隙部位。如果沒有此空隙部位，未通過過濾器的血球則有可能沿著過濾器支持部位流入電極系。
另外，把過濾器輸出側的截面積比進口側截面積小的情況和從過濾器進口側到輸出側的截面積都相同的情況相比較，前者的血球分離位置更靠近進口側；然而，后者的情況下，因為血球分離位置更靠近輸出側，因此，會出現試液供給通路內有血球混入的情況。
由于有上述的結構和形狀，就能除去試液中的干擾物且快速使血漿流入傳感器內。
就過濾器電極側的前端部和電極的位置關系來說，過濾器最好不和電極接觸。
過濾部和電極式生物傳感器的連接位置，通常可以在試液供給通路的開口部一側的位置，但是，為了節省空間，也可以在空氣孔一側的位置。這時，試液供給通路開口部發揮了空氣孔的作用。
蓋板部件和隔離物等過濾器的支持部件最好為透明的。為什么呢？因為可以通過目視以過濾器過濾試液的工序和將經過濾的試液通過毛細現象吸引到試液供給通路內的工序以確認過濾是否成功。
作為電子介質，除了鐵氰化鉀以外，還可以選用膽固醇氧化酶等的氧化還原酶具有電子傳遞功能的氧化還原化合物。
所用的氧化還原酶是以測定對象作基質的酶。在以葡萄糖為測定對象的傳感器中，用葡萄糖氧化酶。在測定用來作為診斷指標的血清中的膽固醇值時，用催化膽固醇氧化反應的膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶和催化使膽固醇酯變化為膽固醇的反應過程的膽固醇酯酶。因為膽固醇酯酶的酶反應進行很慢，所以通過添加適當的表面活性劑來提高膽固醇酯酶的活性，可以縮短整個反應所需的時間。以上所述的酶配置在傳感器內電極系上或此電極系近旁的位置。跟配置電極系的基板組合而在與基板之間具有形成向電極系提供試液的試液供給通路的蓋板部件的傳感器中，可以將上述的酶配置在試液供給通路的露出部分和試液供給通路的開口部等位置上。不管是在哪一個位置，能通過導入試液而使反應試劑層容易溶解并能達到電極系的位置為最好。為了保護電極和抑制所形成的反應層的脫落，最好靠近電極系形成親水性高分子層。另外，也可以在電極系以外，以形成親水性高分子層來作為在形成反應層時的基礎，或在最下層的反應層里最好含有親水性高分子。
含有電子介質的層最好和表面活性劑分離以提高其溶解性。另外，為了保證其貯存穩定性，最好將其和對膽固醇氧化反應有催化作用的膽固醇酯酶分離。
在測定血糖值的生物傳感器中，有為了使試液容易導入反應層中，而形成含有脂質的層來覆蓋電極系上形成了的層等的例子(例如，日本公開特許公報1990年第062952號)。本發明的測定膽固醇的生物傳感器中，因為含有和脂質起同樣作用的表面活性劑，所以，即使沒有脂質層也可以。
可以用以下物質來作為親水性高分子水溶性纖維素衍生物，尤其是除了乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素以外，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明膠、聚丙烯酸和其鹽、淀粉和其衍生物、馬來酸酐聚合物及它的鹽、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯樹脂，聚甲基丙烯酸2-羥乙基酯等。
作為表面活性劑，可選用以下物質n-辛基-β-D-硫代葡糖苷、聚乙二醇單十二烷基醚、膽酸鈉、十二烷基-β-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酸酯、脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、N，N-二(3-D-葡糖酰胺基丙基)脫氧膽酸酰胺和聚氧乙烯(10)辛基苯基醚。
作為脂質，可以適當使用卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等的磷脂的兩親溶性脂質。
作為氧化電流的測定方法，和只有測定極和對電極的二電極方式相比，加上參比極的三電極方式更有可能進行正確的測定。
以下，通過具體的實施方式對本發明進行詳細地說明。
圖1是一實施方法的生物傳感器的縱向剖面圖，圖2是除去其反應層、隔離物和蓋板的平面圖、圖3是除去反應層和過濾器的生物傳感器的分解立體圖。
1顯示聚乙烯對苯二甲酸酯的絕緣性基板。此基板1的左半部分1a的厚度薄，右半部分1b具有左半部分約2倍的厚度。在厚度薄的部分1a上，通過絲網印刷法印刷銀膏以形成導線2、3和電極系的基礎；然后把含有樹脂粘合劑的導電性碳糊印刷在基板1上，形成包含有測定極4和對電極5的電極系。另外，將絕緣性糊印刷在特定范圍里，形成絕緣層6。絕緣層6使測定極4和對電極5的露出部分面積保持恒定并部分覆蓋導線2和3。在基板1厚度較厚的部分1b上，配置有上面有開口的凹陷部分7和8。
和上述基板1裝配的隔離物11，為幾乎覆蓋基板1的絕緣層6的大小的平板部分11a，和覆蓋基板部分1b的周圍，并在基板1上形成收容后述過濾器的空間部分，由高度較高的略作U字形部分的11b構成。U字形部分11b在左端部16加上依次由高到低的錐度，使和平板部分11a相連接的部分變得和平板部分一樣高度。另外，在基板1的凹陷部7和8之間對應于間隔部9這部分的上方，U字形部分11b上具有固定過濾器的固定部19，在平板部分11a上有連通上下在U字形部分一側開口的切口12。
蓋板21有分別覆蓋隔離物11的平板部分11a和11b的部分21a和21b，在部分21b上，有對應于隔離物錐度16的傾斜部分26。蓋板21還有和基板1切口12終端相連通的空氣孔22和與凹陷部分8以及與隔離物11的固定部19的右方的開口部18相連通的透孔28。
在基板1上和/或蓋板11的一側形成反應試劑層，另外，在基板1上配置過濾器20，將隔離物11和蓋板21組裝在基板1上以形成圖1所示的生物傳感器。在圖1上，10顯示電極系。過濾器20，其后面部分的上下被基板1的間隔部9和蓋板21的緊固部19夾住固定，而它的前端部被與基板1的試液供給通路的開口部相連接的部分和蓋板的21的傾斜部分26夾住固定。而且，過濾器20其前端面對著在隔離物11的切口12部分形成的試液供給通路。
這樣被固定了的過濾器20的位于基板1的凹陷部7上的部分，其周圍一周不和基板及蓋板部件連接。這樣，由于存在過濾器20的一部分和過濾器支持部分不接觸的地方，即，環繞過濾器一周的空隙部分，可以阻止沒有通過過濾器而沿過濾器支持部分而來的血球流入向電極系。
在圖1和圖2里，F1表示過濾器20的進口側的截面積，F2表示過濾器20的位于試液供給通路開口部的輸出側的截面積。再者，S1是表示試液供給通路開口部的截面積，S2是表示試液供給通路的截面積。
在本發明中，使S1＜F1，這樣，濾除血球的血漿迅速地達到電極系。較好是S2＜F1，最佳的是F2＜F1。
在用此傳感器來測定血液中的膽固醇值時，使試樣的血液通過蓋板21的透孔28部分供給到基板1的凹陷部8上。在這里，被供給的血液從過濾器20的端部向過濾器的內部滲透。在過濾器20的內部，因為血球的滲透速度比液體成分的血漿慢，所以，血漿從過濾器電極系一側滲透出來，此滲透出來的血漿將溶解由酶等構成的加載在覆蓋電極系的位置或此位置的垂直上方的蓋板的里面的反應試劑，同時充滿從電極系附近到空氣孔22部分的整段試液供給通路。如充滿整段試液供給通路的話，過濾器20內的液體流動也就停止，這時，血球就不會到達過濾器20的電極系一側的端部，而在此位置滯留下來。因此，過濾器20的配置是為了造成血漿和血球的流通阻力差，而僅讓充滿整段試液供給通路的血漿量通過，并且使血球不能達到過濾器輸出側。本發明適合用平均孔徑約為1-7μm的深過濾器(depth filter)。
這樣，經過血球過濾，被血漿溶解了的反應試劑層和血漿中的測定成分(如果是膽固醇傳感器的話，此成分為膽固醇)發生化學反應，經過一段時間，就可以測定電極反應的電流值而定量血漿中的成分。圖4顯示試液供給通路的電極系附近的反應試劑層的配置的實例。基板1的電極系上，形成有親水性高分子的羧甲基纖維素鈉鹽(以下僅表示為CMC)層30和含有反應試劑(例如電子介質)的層31a。另外，在隔離物11組合在蓋板21上的蓋板部件的里面，試液供給通路露出的面上，形成有表面活性劑層32和含有氧化還原酶的反應試劑層31b。
圖5、圖6和圖7顯示傳感器的變形例的簡圖。
圖5顯示試樣供給部分不同的例子。圖5(a)，如圖1一樣，由能接受試液的凹陷部構成試樣供給部分8。圖5(b)是具有利用過濾器20的端部上面露出處添加試液的試樣供給部分8的例子。圖5(c)，過濾器20進口側端面和端部上面露出。因此，不僅可以添加試樣至基板1上的試樣供給部分8，還可以向過濾器20端部的上面添加試料。
圖6是顯示各種形狀過濾器的平面圖。圖6(a)是從進口側到輸出側寬相同的過濾器的例子。圖6(b)表示加上錐度使從進口側到輸出側的寬度依次變窄的而大致形成梯形。圖6(c)是顯示使進口側寬度變得比輸出側寬度大而在中途改變寬度的例子。
圖7顯示過濾器的不同剖面形狀。圖7(a)至(c)是加上錐度而使進口側剖面比輸出側剖面大。圖7(d)和(e)是使進口側剖面相同于輸出側剖面的圖。
如上述圖1和圖5-7所示，構成試液供給通路的切口12與液體流通方向垂直的截面積都比過濾器20的截面積小。而且，過濾器20具有在其整體上大致一樣的密度。這樣本發明是通過使試液供給通路的截面積S2小于過濾器20進口側的截面積F1，利用毛細現象，將通過過濾器濾除血球的血漿快速地吸引到試液供給通路內的傳感器。將過濾器先端部的截面積變小，就能迅速地使血漿流入到傳感器內。
即使把圖5所示的試樣供給部分、圖6顯示的過濾器的平面形狀和/或如圖7所示的過濾器剖面形狀組合起來也能迅速地使血漿流入到試液供給通路內。
在如圖所示構造的生物傳感器中，過濾器進口側的寬度最好為5mm以下，厚度為2mm以下；而試液供給通路開口部寬度最好為2mm以下，厚度為200μm以下。
圖8是本發明的其他實施方式的生物傳感器的縱向剖面圖，圖9為其傳感器除去試劑層的分解立體圖。
在絕緣性基板31上，如圖1的情況形成導線32和33、分別和此導線連接的作用極34和對電極35以及絕緣層36。在此基板31上，組合有多個隔離物41、43、45、47和49以及蓋板53，在隔離物43和蓋板53之間，有過濾器51配置在透孔46、48和50的部分上。蓋板52的透孔53構成試樣供給部分，在隔離物41和43上配置的透孔42和44構成試液供給通路。因為使隔離物45和49的透孔46和50的直徑大于過濾器51的直徑，所以，在過濾器51的周圍，形成用55和56來表示的包圍過濾器51的空隙部分。隔離物47和過濾器51的外周有部分連接，起到確定過濾器位置的作用。隔離物41具有將上述試液供給通路的終端部與大氣連通的一對空氣孔54。這樣如利用毛細現象將試液從構成試樣供給部分的透孔53導入到配置在電極系上的過濾器51和試液供給通路，再使經過濾器過濾的血漿達到電極系，試液的移動即會停止。
這里，決定包圍過濾器51的空隙部分55和56的高度的隔離物49和45的厚度最好在100μm以上。隔離物41，其透孔42的部分是提供試液和試劑反應場所的，其厚度最好為200μm以下。
此例中，于電極系上，形成CMC層61和電子介質層62，在隔離物43的里面形成含有酶和表面活性劑的層63。
如前所示，圖10顯示了沿著重力方向將試液從設置在蓋板一側的試樣供給部分向電極系提供的傳感器過濾器中的形狀。圖10(a)和圖8一樣是采用有相同剖面進口側和輸出側的過濾器51的實例圖。圖10(b)是使輸出側截面積小于進口側截面積的實例圖。
以下，說明本發明的實施例。
實施例1
在具有圖1-4的構造的膽固醇傳感器中，反應層31a含有電子介質，反應層31b含有膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶和表面活性劑，層32由表面活性劑構成。按照以下所示順序制作此傳感器。
首先，將5μl羧甲基纖維素鈉鹽的0.5wt％的水溶液滴在基板1的電極系上，在50℃的暖風干燥器中干燥10分鐘，制成CMC層30。然后，滴4μl鐵氰化鉀水溶液(相當于鐵氰化鉀70mM)于CMC層30上，在50℃的暖風干燥器中干燥10分鐘，形成含有鐵氰化鉀的反應層31a。
將2μl表面活性劑的聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(TritonX-100)的2wt％乙醇溶液滴在由組合了蓋板和隔離物的蓋板部件的切口形成的凹陷部位，在室溫下將其干燥3分鐘，形成表面活性劑層32。上述的切口的寬度為2mm，長為4.5mm，隔離物的厚度為100μ。
將表面活性劑聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(TritonX-100)添加在溶解了來自諾卡氏菌的膽固醇氧化酶(EC1.1.3.6，以下省略為ChOD)和來源于假單胞菌的膽固醇酯酶(EC.3.1.1.13，以下簡略為ChE)的水溶液中。滴下1.5μl此混合水溶液在表面活性劑層32上，在-196℃的液氮中冷凍后，放于梨形燒瓶中，在冷凍干燥器中干燥一晚，就形成了含有480U/ml的膽固醇氧化酶、1200U/ml的膽固醇酯酶和2wt％的表面活性劑的反應層31b。
將沖切成上邊2mm，下邊4mm，高3mm的梯形的厚度為600μm，平均孔徑為2.3μm的玻璃纖維濾紙如圖2所示，不和作用極接觸地配置在這樣制作的傳感器的基板1上。
此后，將上述蓋板部件連接在基板上就制成了圖1的膽固醇傳感器。
比較例1按照圖11和圖12所示，除了將過濾器20的尺寸定為寬2mm，長27mm和厚度100μm以外，其余都和實施例1一樣地組裝膽固醇傳感器。
在實施例1和比較例1中的膽固醇傳感器A和B里，通過作為試液導入口的蓋板21的透孔28將作為試液的全血20μl導入到基板1的凹陷部8上，3分鐘后，以對電極為基準，在以測定極為正極的方向上加上+0.5V脈沖電壓，5秒鐘后，測定作用極和對電極之間流過的電流值。此結果在圖13中顯示。實施例1和比較例1傳感器的過濾器的名義體積都約為5.4mm3。
圖上很明確，如果用本發明傳感器，膽固醇濃度和應答值之間可以得到良好的線性。
產業上利用的可能性通過本發明，能利用過濾器將干擾物質的血球除去，而且能迅速地將試樣提供給電極系，能提供具優異應答特性的電化學生物傳感器。
權利要求
1.生物傳感器，它具有絕緣性基板、在此基板上配置的含有測定極和對電極的電極系、至少含有氧化還原酶和電子介質的反應層、含有前述電極系和反應層的試液供給通路、試樣供給部分和在此試樣供給部分和試液供給通路之間設置的過濾血球的過濾器，使得經上述過濾器過濾了血球的血漿能夠通過毛細現象被吸引到上述的試液供給通路內，其特征在于，上述過濾器進口側的截面積比上述的試液供給通路的開口部截面積大。
2.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述試液供給通路截面積等于或小于試液供給通路的開口部截面積。
3.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述過濾器，其進口側截面積大于位于試液供給通路的開口部的輸出側截面積。
4.根據權利要求1-3中任一項記載的生物傳感器，其特征在于，所述過濾器由三維連接的具有空隙部的多孔體構成，此多孔體具有利用毛細作用將血液從上述試樣供給部分向試液供給通路一側移動、利用血漿與血球之間的流通阻力差來過濾血球的作用。
5.根據權利要求1-4中任一項記載的生物傳感器，其特征在于，在所述過濾器的試樣供給部分與試液供給通路之間的范圍里，有環繞過濾器表面一周的空隙部。
6.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述過濾器的輸出側前端部不和電極接觸。
7.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述試液供給通路形成在所述基板和與此基板相組合的蓋板部件之間。
8.根據權利要求7所述的生物傳感器，其特征在于，所述的蓋板部件的至少覆蓋于所述過濾器和試液供給通路上的部分為透明的。
9.根據權利要求7所述的生物傳感器，其特征在于，在所述的蓋板部件上加載或固定有表面活性劑。
全文摘要
本發明提供一種使濾除血球的血漿迅速達到電極系的經改良的以全血為測定對象的生物傳感器。本發明生物傳感器具有絕緣性基板、在此基板上配置的含有測定極和對電極的電極系、至少含有氧化還原酶和電子介質的反應層、含有前述電極系和反應層的試液供給通路、試樣供給部分和在此試樣供給部分和試液供給通路之間設置的過濾血球的過濾器，并可以將經上述過濾器過濾了血球的血漿利用毛細現象吸引到上述的試液供給通路內。上述過濾器，其特征在于此過濾器的截面積比上述的試液供給通路的開口部截面積大。
文檔編號G01N33/487GK1444730SQ01813616
公開日2003年9月24日 申請日期2001年7月26日 優先權日2000年7月31日
發明者長谷川美和, 山本智浩, 渡邊基一, 池田信, 南海史郎 申請人:松下電器產業株式會社