體外診斷劑的制作方法

專利名稱：體外診斷劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于干化學測試法中的體外診斷劑以及診斷方法。更具體而言，本發明涉及體外診斷劑以及診斷方法，該診斷劑的精密度水平即使在長期儲存后仍保持不低于預定的水平。
典型的干化學測試法例如是免疫層析法。免疫層析法是使用抗原—抗體反應以及毛細管現象的測試法。在該方法所使用的體外診斷劑中，固定化的抗體(或者抗原)以及對檢測試劑敏化的抗體(或者抗原)分別以干燥狀態保留在支持體如濾膜等上。在測試中，將包含抗原(或者抗體)的待測試樣品添加至體外診斷劑上，通過毛細管現象進行展開，使得在反應部位處產生夾心式抗原—抗體反應。之后，在反應部位顯示出顏色，以鑒別待測試樣品中的抗原(或者抗體)，或者測定是否存在抗原(或者抗體)或者抗原(或者抗體)的量。除夾心式反應外，抗原—抗體反應的形式還包括競爭型反應。免疫層析法有可能使用競爭型反應。在此情況下，測試裝置的結構和測試方法類似于夾心型免疫層析法中的裝置及方法。使用此等免疫層析原理的免疫層析裝置主要用于定性的測量，以根據在反應部位處是否存在顏色來測定陽性或者陰性結果，例如妊娠測試裝置。
除干化學法的上述優點外，使用免疫層析法的測試方法的優點還包括易于操作、測量快速、成本低。因此，使用免疫層析法的測試方法不僅限于臨床測試，而且還適用于近來廣受注目的護理點(point of care)(以下簡稱為POC)。具體而言，在基于POC概念的醫療診斷時，試劑的處理是一個重要的問題。對于該問題，可在室溫下儲存的定性測量用免疫層析裝置易于使用者處理，而且處理該裝置不需要對于該裝置上保留的試劑(如抗原、經固定的抗體、經標記的抗體等)的專業知識或者技術。
另外，通過測定反應部位處的發色密度，最近已將免疫層析法用于半定量或者定量測定中。用于半定量或者定量測定的方法包括典型地使用反射—吸光法測量反應部位處的吸光度的方法。定量測定可澄清用定性測量法不能揭示的各種醫學問題。因此，人們已經將焦點集中在定量測定上。
然而，與基于是否存在發色的定性測量不同，半定量或者定量測定不僅基于是否存在發色，而且還基于發色的密度。因此，半定量或者定量測定需要更高水平的儲存穩定性。常規的定量免疫層析裝置可在其制造后立即提供高精密度的定量測定，但其缺陷是高精密度的定量能力在長期儲存后不能維持。保持高精密度定量能力需要樣品在支持體中隨時間均勻地展開，而且經標記的抗體隨時間均勻地溶出。
作為保持免疫層析裝置的穩定性的特殊策略，如第1849714號日本專利所公開的，為防止作為裝置的重要因素的固定化抗體的親和性下降，已有人添加牛血清白蛋白(以下簡稱為BSA)和糊精作為穩定劑。但是，該方法不能提供定量測定所需要的足夠水平的儲存穩定性。
另外，在除免疫層析裝置以外的基于干化學的體外診斷劑中，有高精密度的定量裝置，但是該裝置具有差的儲存穩定性，而且難以應用于POC中。
鑒于以上問題，本發明的目的是提供在定量測定中具有優異的儲存穩定性的體外診斷劑。
本發明提供以下診斷劑和方法(1)用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑，其包括1)特異性地結合待測試物質的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
(2)根據(1)的體外診斷劑，其中所述試劑是抗體或者抗原或者它們的衍生物。
(3)根據(1)的體外診斷劑，其中所述化合物是糖或者糖衍生物。
(4)根據(1)的體外診斷劑，其進一步包括牛血清白蛋白、酪蛋白、表面活性劑、或者脫脂乳。
(5)根據(1)的體外診斷劑，其中所述化合物包括糖醇或其衍生物。
(6)根據(1)的體外診斷劑，其中所述化合物包括蔗糖或者山梨糖醇。
(7)根據(1)的體外診斷劑，其中所述化合物包括蔗糖和山梨糖醇。
(8)根據(1)的體外診斷劑，其中所述化合物的濃度不低于約3w/v％。
(9)根據(1)的體外診斷劑，其中所述化合物的濃度為約3-10w/v％。
(10)根據(1)的體外診斷劑，其中該體外診斷劑包括多個特異性地結合蛋白質的試劑，該多個試劑包括第一抗體或者抗原或者它們的衍生物、以及第二抗體或者抗原或者它們的衍生物。
(11)根據(1)的體外診斷劑，其中所述試劑用膠體顆粒、膠乳顆粒、色素、膠束、酶、熒光物質、或者磷光物質標記。
(12)根據(1)的體外診斷劑，其中所述試劑和化合物保留在支持體上。
(13)根據(12)的體外診斷劑，其中所述試劑和化合物保留在支持體的不同區域上。
(14)根據(12)的體外診斷劑，其中所述支持體是固相基質。
(15)根據(12)的體外診斷劑，其中所述支持體包括多孔性材料。
(16)根據(12)的體外診斷劑，其中所述支持體包括標記區域、測定區域、以及樣品導入區域，1)所述標記區域包括結合待測試物質的第一抗體或者抗原，2)所述測定區域包括結合待測試物質的第二抗體或者抗原，而且其配置成與所述標記區域流體相通，3)所述樣品導入區域配置成與所述標記區域流體相通。
(17)根據(16)的體外診斷劑，其中所述化合物被包含在標記區域和測定區域中的至少一個區域中。
(18)根據(16)的體外診斷劑，其中所述化合物被包含在所述標記區域中。
(19)制備用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑的方法，其包括以下步驟1)提供與待測試物質特異性結合的試劑，以及2)提供包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
(20)檢測樣品中待測試物質的方法，其包括以下步驟A)提供體外診斷劑，該體外診斷劑包括1)特異性地結合待測試物質的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物，B)向所述體外診斷劑上提供樣品，C)將所述體外診斷劑處于所述試劑特異性地與所述樣品反應的條件之下，D)檢測由所述試劑與所述樣品的特異性反應產生的信號。
(21)體外診斷劑在測量樣品中待測試物質中的應用，該體外診斷劑包括1)特異性地結合待測試物質的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
圖2是顯示根據本發明之實施方案的免疫層析裝置在4℃時的儲存穩定性的曲線圖。
圖3是顯示對比實施例的免疫層析裝置在4℃時的儲存穩定性的曲線圖。
圖4是顯示根據本發明之實施方案的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的曲線圖。
圖5是顯示對比實施例的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的曲線圖。
圖6是顯示根據本發明之實施方案的免疫層析裝置在40℃時的儲存穩定性的曲線圖。
圖7是顯示對比實施例的免疫層析裝置在40℃時的儲存穩定性的曲線圖。
圖8是顯示在40℃下儲存1個月后各種蔗糖濃度下顯色強度降低的曲線圖。
圖9是顯示根據實施例3的免疫層析裝置的靈敏度在25℃時的儲存穩定性的方塊圖。


圖10是顯示實施例3的免疫層析裝置的精密度(CV值)在25℃時的儲存穩定性的方塊圖。
圖11是顯示對比例的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的方塊圖。
圖12是顯示對比例的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的精密度(CV值)的方塊圖。
圖13是顯示代表本發明實施例之下降比例的穩定性指數的方塊圖(圖9)，其中使用第14天的測量值作為基準。
圖14是顯示代表對比例之下降比例的穩定性指數的方塊圖(圖11)，其中使用第14天的測量值作為基準。標號的說明10樣品導入區域11標記區域12測定區域13基板
具體實施例方式
在本發明的說明書中，應理解的是，除非另有說明，在此使用的術語具有本領域中通常使用的定義。
本發明提供一種用于測量樣品中的待測試物質的體外診斷劑。該體外診斷劑包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑，以及2)親水性材料。
在此所用術語“體外診斷劑”是指可以由受試者的身體之外以至少一個特異性生理參數檢測的產品。根據其組成，體外診斷劑可以是任何形式的，例如為組合物或者裝置的形式。
在此所用術語“親水性材料”是指包括對水分子具有強親和性的原子團的材料。該親水性材料在此必須不能損壞蛋白質的立體結構。此等親水性材料的例子包括氨基酸如賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等的側鏈；核酸的磷酸酯基；氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸等的側鏈；糖或者糖衍生物的羥基；等等。
在一個實施方案中，上述親水性材料包括含有至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。因此，在優選的實施方案中，本發明提供用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑。該體外診斷劑包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
在一個優選的實施方案中，上述親水性材料可以是糖或者糖衍生物。
在此所用術語“糖”是指包含至少一個羥基和至少一個醛基或者酮基的多羥基醛或者多羥基酮。糖還指碳水化合物，兩者可相互交換使用。
用于本發明之體外診斷劑中的糖可以是能夠溶解在液體中的任意糖。此等糖的例子包括單糖，如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；以及寡糖，如麥芽糖、異麥芽糖、纖維素二糖、乳糖、蔗糖等。另外，糖還可包括其中單糖或者寡糖化學性地連接在一起的多糖。所述糖具有立體異構體。所有的立體異構體都可用于本發明的體外診斷劑中。在這些糖中，優選蔗糖。
在此所用術語“糖衍生物”是指其取代基被其他取代基取代的糖，以及通過糖的氧化—還原反應得到的糖變體。在此，所述取代基包括但不限于烷基、取代烷基、環烷基、取代環烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、環烯基、取代環烯基、鏈炔基、取代鏈炔基、烷氧基、取代烷氧基、碳環基、取代碳環基、雜環基、取代雜環基、鹵素、羥基、取代羥基、巰基、取代巰基、氰基、硝基、氨基、取代氨基、羧基、取代羧基、酰基、取代酰基、硫代羧基、取代硫代羧基、酰胺、取代酰胺、取代羰基、取代硫羰基、取代磺酰基和取代亞硫酰基。
用于本發明之體外診斷劑的糖衍生物可以是能夠溶解在液體中的任意糖衍生物。糖衍生物的例子包括用單糖、寡糖或者多糖改性的有機體的組分，如蛋白質、脂質、核酸等；糖醇；肌醇；糖醛酸；抗壞血酸；氨基糖；糖磷酸酯；天然糖蛋白；等等。在這些糖衍生物中，糖醇是優選的。
糖或者糖衍生物具有吸濕性、低水平的干燥性、以及相對于溫度變化優異的水分保留性質。在此情況下，體外診斷劑可適度地保持濕度。因此，可得到相對于高精密度定量測定具有儲存穩定性的體外診斷劑。
可用于本發明之體外診斷劑中的糖醇包括通過還原醛糖或酮糖或者它們的立體異構體的羰基而得到的多元鏈醇，例如包括甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇(arabinitol)、木糖醇、蒜糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、艾杜糖醇、衛茅醇和塔羅糖醇，或者甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、蒜糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、艾杜糖醇、衛茅醇和塔羅糖醇的立體異構體。另外，糖醇可包括上述多元鏈醇或其立體異構體中的至少兩種化學地連接在一起的化合物，其例如包括其中甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、蒜糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、艾杜糖醇、衛茅醇或塔羅糖醇，或者甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、蒜糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、艾杜糖醇、衛茅醇或塔羅糖醇的D-和L-立體異構體中的至少二個化學地連接在一起的化合物。糖醇還包括其中上述多元鏈醇或其立體異構體部分或者完整地與天然糖或者非天然及人工合成糖或者天然糖的立體異構體或者非天然及人工合成糖的立體異構體通過醇基連接在一起的化合物，所述多元鏈醇或其立體異構體例如包括甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、蒜糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、艾杜糖醇、衛茅醇和塔羅糖醇，或者甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、蒜糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、艾杜糖醇、衛茅醇和塔羅糖醇的立體異構體。其中，糖醇優選是山梨糖醇。
因此，上述材料優選包括糖醇或其衍生物。更優選的是，上述材料可包括蔗糖或者山梨糖醇。還優選的是，上述材料包括蔗糖和山梨糖醇。
在一個實施方案中，上述材料的濃度可為約1w/v％以上。更優選的是，上述材料的濃度約為至少3w/v％。甚至更優選的是，上述材料的濃度為約3-10w/v％。上述材料含量的濃度不局限于這些范圍，而且例如包括下限約為1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％、8w/v％、9w/v％、10w/v％、15w/v％等。上述材料含量的濃度的上限包括但不限于是約1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％、8w/v％、9w/v％、10w/v％、12.5w/v％、15w/v％、17.5w/v％、20w/v％、30w/v％、40w/v％、50w/v％等。上述范圍可以是這些下限和上限的任意組合。
可用于本發明中的試劑是能夠特異性地與待測試物質反應的任意試劑，例如包括抗體、抗原、抗生物素蛋白、生物素、核酸等。在它們之中，優選是抗原或抗體。因此，在另一個方面中，用于本發明中的試劑可以是抗體或者抗原或者它們的衍生物。“特異性地反應”是指與目的物的相互作用強于與其他物體的相互作用。
在此所用術語“抗原”是指可產生抗體的任意物質。此等抗原包括半抗原、蛋白質、細菌、病毒、抗病毒抗體等。在此，半抗原的例子包括低分子量化合物，如二氧芑、苯異丙胺、脫氧麻黃堿、雌二醇等。蛋白質包括血紅蛋白、白蛋白、血紅蛋白Alc(糖血紅蛋白)、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、HCV抗體(丙型肝炎病毒抗體)、HIV抗體(人免疫缺陷病毒抗體)、CEA(癌胚抗原)、AFP(α-胎兒球蛋白)、CRP(C反應性蛋白)、SAA(血清淀粉狀蛋白A)、hCG(人絨毛膜促性腺激素)等。細菌包括以下屬的細菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、或者弧菌。病毒包括HIV、HBs等。
在此所用術語“抗體”是指由上述抗原產生的抗體。抗體在此還包括整個抗體、其免疫原性衍生物和片段。抗體的免疫原性片段是指抗體中具有免疫原性的任意片段。抗體的免疫原性片段包括但不限于各種區域，如Fab、F(ab)2′等。因此，抗體的免疫原性片段可以是任意的片段，只要能夠產生免疫反應即可。
在另一個實施方案中，本發明的體外診斷劑可進一步包括牛血清白蛋白、酪蛋白、表面活性劑、或者脫脂乳。
根據一個方面，在本發明的體外診斷劑中，該體外診斷劑包含多種上述試劑。至少兩種試劑可包括第一抗體或抗原或者它們的衍生物，以及第二抗體或抗原或者它們的衍生物。
在優選的實施方案中，上述試劑可用膠體顆粒、膠乳顆粒、色素、膠束、酶、熒光物質、或者磷光物質標記。
在一個實施方案中，上述試劑和上述材料可保留在支持體上。優選地，上述試劑和上述化合物可保留在上述支持體的不同區域上。
在優選的實施方案中，上述支持體可以是固相基質。該基質可為層狀(固相基質)。優選地，上述支持體可包括多孔性材料。在此優選的是，試劑和糖或者糖衍生物保留在固相基質上。
通常情況下，固相基質是能夠吸收、保留并展開樣品溶液，而且能夠物理或者化學性地吸附生物材料的任意固相基質，例如包括玻璃纖維濾紙、過濾膜等。
本發明的體外診斷劑作為固相基質包括樣品導入區域、標記區域和測定區域，所述標記區域包含與作為待測試物質的抗原或者抗體相結合的第一抗體或者抗原，而所述測定區域包含與作為待測試物質的抗原或者抗體相結合的第二抗體或者抗原。該體外診斷劑的特征在于樣品導入區域、標記區域和測定區域如下設置，樣品溶液被導入樣品導入區域中，然后經由所述標記區域轉移至測定區域中；樣品導入區域、標記區域或者測定區域包含糖或者糖衍生物；以及基于抗原與抗體之間的特異性結合反應來測定樣品溶液中作為待測試物質的抗原或者抗體。
由此，至少樣品導入區域、標記區域或者測定區域中的濕度被適當地保留，使得樣品溶液在支持體上隨時間均勻地展開。因此，可得到相對于高精密度定量測定具有儲存穩定性的體外診斷劑。
在優選的實施方案中，在本發明的體外診斷劑中，上述支持體包括標記區域、測定區域、以及樣品導入區域，1)所述標記區域包括結合待測試物質的第一抗體或者抗原，2)所述測定區域包括結合待測試物質的第二抗體或者抗原，而且其配置成與所述標記區域流體相通，3)所述樣品導入區域配置成與所述標記區域流體相通。
在優選的實施方案中，本發明的體外診斷劑為體外診斷劑裝置的形式。因此，該體外診斷劑也可以是組合物的形式。
在此，標記區域優選包含糖或者糖衍生物。在此情況下，第一抗體(或者抗原)在固相基質上的吸附被松動，使得第一抗體(或者抗原)隨時間均勻地溶出，并可得到具有高水平的儲存穩定性的體外診斷劑。
在一個實施方案中，第一抗體(或者抗原)用膠體顆粒、膠乳顆粒、色素、或者膠束進行標記，而且至少標記區域優選包含糖或者糖衍生物。
樣品導入區域用的材料可以是以適當的速度展開樣品溶液的任意物質，例如包括硝基纖維素和玻璃濾紙。
另外，標記區域和測定區域用的材料可以是能夠保留第一和第二抗體(或者抗原)并以適當的速度展開樣品溶液的任意材料，例如包括硝基纖維素和玻璃濾紙。
在本發明的一個實施方案中，例如，提供在使用自動分析儀測量待測試物質時所需要的體外診斷劑，而且其可如下制備向包含于比色杯、Eppendorf管等中的液體試劑內添加糖或者糖衍生物，然后干燥。如果在測量時使用此等體外診斷劑，可預期有各種應用。例如，將緩沖溶液等傾倒在上述包含凍干產品的容器內，以溶解所述凍干產品，然后將所得的溶液轉移至分析儀用的比色杯中，以便能夠測量溶液。或者，包含溶液的容器可直接放置在分析儀中，而分析儀可自動地將緩沖溶液等傾倒在該容器內，使得可以立即開始測量。在使用包含經干燥的試劑的容器時，使用者不必準備試劑。另外，因為試劑是固態的，與液體的試劑不同，更容易處理。如果容器是一次性的，則不需要洗滌容器，由此預期容器的處理也更容易。另外，容器可在室溫下保存，由此預期容器的處理甚至更容易。
在本發明的另一個實施方案中，其提供在免疫血清測試法中使用的體外診斷劑，所述免疫血清測試法例如是免疫濁度測定法、濁度測定法、膠乳凝集測定法、放射免疫吸著測定法、酶免疫吸著測定法、熒光免疫測定法、化學發光免疫測定法、顆粒系數免疫測定法等，而且其可如下制備向包含于比色杯、Eppendorf管等中的液體試劑內添加糖或者糖衍生物，然后凍干。當處理和測量試劑時，該體外診斷劑的處理與上述使用自動分析儀時的類似。
在一個實施方案中，上述化合物可被包含在標記區域和測定區域中的至少一個區域中。優選的是，該化合物包含在至少標記區域中，而且也可被包含在所有三個區域中。
在一個方面中，本發明提供制備用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑的方法，其包括以下步驟1)提供與待測試物質特異性反應的試劑，以及2)提供包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
在一個實施方案中，本發明的體外診斷劑可如下制備使特異性地與待測試物質反應的試劑的溶液與糖或者糖衍生物混合，然后空氣干燥或者凍干溶液。
當試劑和糖或者糖衍生物保留在固相基質上時，使特異性地與待測試物質反應的試劑的溶液與糖或者糖衍生物混合，所得的溶液含浸或者固定在固相基質中，然后空氣干燥或者凍干。應注意的是，在此使用“含浸”是指試劑以溶解的方式被保留，而“固定”是指試劑以未被溶解的方式保留。
另外，本發明的體外診斷劑可如下制備使包含第一抗體(或者抗原)的溶液與糖或者糖衍生物混合，使所得溶液含浸在標記區域中，或者/以及使包含第二抗體(或者抗原)的溶液與糖或者糖衍生物混合，并使所得溶液固定在測定區域中，然后空氣干燥或者凍干。
在另一個方面中，本發明提供用于檢測樣品中待測試物質的方法，其包括以下步驟A)提供體外診斷劑，該體外診斷劑包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
B)向所述體外診斷劑上提供樣品，
C)使所述體外診斷劑處于所述試劑特異性地與所述樣品反應的條件之下，以及D)檢測由所述試劑與所述樣品的特異性反應產生的信號。
在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的體外診斷劑在測量樣品中待測試物質中的應用。
通過使用本發明的診斷方法或者檢測方法，可檢測例如血液中的組分(如HbAlc(糖血紅蛋白)、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、HCV抗體(丙型肝炎病毒抗體)、HIV抗體(人免疫缺陷病毒抗體)、CEA(癌胚抗原)、AFP(α-胎兒球蛋白)、CRP(C反應性蛋白)、SAA(血清淀粉狀蛋白A)，等等)。為此目的，例如將血液點在用于檢測或者固定抗上述蛋白質的抗體的免疫層析裝置上，然后通過測量反射吸光度測定一定時間后的顯色強度，由此可定量蛋白質的濃度。
本發明的效果包括在長期儲存(如1個月)后可實現高精密度的診斷和檢測。在此所用術語“穩定性指數”是用于評估一定時間后的精密度的指數。“穩定性指數”是指體外診斷劑相對于基準的靈敏度，其中體外診斷劑在生產14天后的靈敏度作為基準(0)。因此，當第14天的靈敏度為-10，而第30天的靈敏度為20，則相應的穩定性指數為+30。令人希望的是，穩定性指數接近于0。另外還優選的是，穩定性指數在每個測量時間點處的變化很小，即、穩定性指數不隨時間發生大的變化。在本發明中，穩定性指數的值可優選在±20之內。更優選的是，穩定性指數在±10之內。如果該變化在±20之內，則因為裝置的變化具有較大的影響，使得穩定性指數的變化不能簡單地說成是下降導致的。上述范圍是可允許的。在另一個方面中，本發明優選測量時間點處的穩定性指數之間的差異在20以內。該差異更優選在10以內。在評估儲存穩定性時，重要的是預測有關測量數據的的隨后測量結果。在儲存穩定性測試中，預測最終測量時間點之后的測量結果也是重要的。因此，非常希望的是，穩定性指數不隨時間發生較大的變化，而且特別是不會連續地發生大范圍的變化。相反地，在某個濃度的穩定性指數超過±20以內的范圍，而且穩定性指數的絕對值會隨著時間而增加時，則可認為隨后的測量產生不可靠數據的可能性非常大。再者，還希望的是，穩定性指數的絕對值相對于其他濃度超過20。實際上，在本說明書的對比例中觀察到類似的趨勢。
因此，本發明可在長期儲存后提供高精密度的診斷和檢測，所述儲存時間包括但不限于例如1個月、2個月、3個月、6個月、1年等。
以下將通過實施例更為詳細地描述本發明。以下的實施例僅是用于說明目的。因此，本發明的范圍僅由權利要求書來限定，而不是用實施例限定。
最后，上述硝基纖維素膜貼附在白色PET的基板13上，該基板的厚度為0.5mm，然后切成5mm×50mm的條，由此制成免疫層析裝置。
按照與實施例1相同的方式制備在標記區域中不包含山梨糖醇的免疫層析裝置，該方法的不同之處在于在制備金膠體增感的抗-hCG-α抗體溶液時不使用山梨糖醇。制備樣品溶液將具有已知濃度的hCG溶液添加至人尿中，將其濃度調節為100U/l、1000U/l和10000U/l。定量測定hCG濃度在實施例1的免疫層析裝置制成后立即、其制成后的第3天、14天、28天和62天，以及對比例1的免疫層析裝置制成后立即、其制成后的第7天、14天、28天和62天時，定量測定樣品中的hCG濃度。在此期間，實施例1和對比例1的免疫層析裝置都在4℃、25℃和40℃分別儲存。
在測量時，在所制得的免疫層析裝置的樣品導入區域10中添加40μl的100U/l、1000U/l和10000U/l hCG溶液，并使它們在膜上展開。5分鐘之后，使用反射吸光分光光度計(由導津制作所制造CS9300)由520nm處的反射吸光度測量測定區域12中的顯色，由此進行樣品溶液中hCG濃度的定量。
圖2是顯示實施例1的免疫層析裝置在4℃時的儲存穩定性的曲線圖。圖3是顯示對比例1的免疫層析裝置在4℃時的儲存穩定性的曲線圖。圖4是顯示實施例1的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的曲線圖。圖5是顯示對比例的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的曲線圖。圖6是顯示實施例1的免疫層析裝置在40℃時的儲存穩定性的曲線圖。圖7是顯示對比例的免疫層析裝置在40℃時的儲存穩定性的曲線圖。在圖2-7中，橫軸代表免疫層析裝置由制成后到進行測量時的儲存天數，而縱軸代表基于裝置制成后立即制得的hCG濃度—反射吸光度校正曲線由各測量點的反射吸光度得到的hCG濃度與樣品溶液的實際hCG濃度之間的差異。實心圓表示濃度為100U/l的樣品溶液的數據，空心圓表示濃度為1000U/l的樣品溶液的數據，而三角表示濃度為10000U/l的樣品溶液的數據。
由這些圖中可以看出，在對比例1的免疫層析裝置中，儲存天數越多，則靈敏度越低。在儲存溫度增加時，該趨勢更為顯著。與此相反，實施例1的免疫層析裝置表明，在任何儲存溫度下，由制成的那一天直至第14天的靈敏度變化，而且實際上在第14天后直至第62天，都有穩定的靈敏度。在實施例1的免疫層析裝置中，如圖6中所示的在40℃下的儲存穩定性加速試驗中，在40℃下的儲存穩定性由第14天開始保持1個月。因此，如果將上述時間轉化為室溫下的儲存穩定性，則可確保約1-1.5年的儲存穩定性。另外，根據CV值的變化，可確保精密度。實施例2蔗糖濃度的最優化按照與實施例1相同的方式制備免疫層析裝置，但在制備金膠體增感的抗-hCG-α抗體溶液時，在相應的條件下向金膠體增感的抗-hCG-α抗體溶液中添加0、1、3、5、7或10％的蔗糖。制備樣品溶液向血清中添加具有已知濃度的hCG溶液，將其濃度調節為0.01、0.1和1mg/dl。定量測定hCG濃度將實施例2中含有相應蔗糖濃度的免疫層析裝置在40℃下儲存30天。在該免疫層析裝置制成后立即以及制成后第30天評估該免疫層析裝置的測量結果，以測定最優的蔗糖濃度。根據實施例1的結果(圖2-7)，如果在40℃下儲存1個月后的靈敏度下降可被抑制在-20℃以內，則可確保4℃和25℃下1.5年的儲存穩定性。
在測量時，向所制得的免疫層析裝置的樣品導入區域10中添加40μl的0.01、0.1和1mg/dl hCG溶液，并使它們在膜上展開。5分鐘之后，使用反射吸光分光光度計(由導津制作所制造CS9300)由520nm處的反射吸光度測量測定區域12中的顯色，由此進行樣品溶液中hCG濃度的定量。
圖8顯示了實施例2的免疫層析裝置在40℃下儲存1個月后的下降比例，其中使用該免疫層析裝置剛制成后的顯色強度作為基準。根據上述結果，其中蔗糖濃度不低于3％的裝置所達到的顯色強度，盡管條件嚴苛，即、在40℃下儲存，僅被抑制約-20％。
在實施例2中，因為樣品是血清，具有一定的粘度，有可能對定量測定的精密度產生負面影響。因此，優選糖濃度在可抑制顯色強度下降的范圍內盡可能地低。實施例3進行儲存穩定性試驗接下來，制備用于測量hCG的免疫層析裝置，其中一些的糖濃度為5％，而另一些不包含糖，然后進行真時(real-time)儲存穩定性試驗。該試驗示于實施例3中。
按照與實施例2相同的方式制備實施例3的免疫層析裝置，但在調節金增感的抗-hCG-α抗體溶液時，向該溶液中添加蔗糖至5％，或者不添加蔗糖。由此制得的裝置之一在其標記區域中不包含蔗糖，并用作對比例，而其他包含5w/v％蔗糖的裝置則作為實施例。這些裝置將在以下詳細描述。定量測定hCG濃度在實施例3的免疫層析裝置制成后立即、以及該裝置儲存3天、7天、14天、25天、52天和80天后，定量測定樣品中的hCG濃度。對于對比例的免疫層析裝置，則在該裝置制成后立即、以及該裝置儲存3天、7天、14天、26天和54天后，進行定量測定。儲存溫度為25℃。
在測量時，向所制得的免疫層析裝置的樣品導入區域10中添加40μl的0.01、0.1和1mg/dl hCG溶液，并使它們在膜上展開。5分鐘之后，使用反射吸光分光光度計(由導津制作所制造CS9300)由520nm處的反射吸光度測量測定區域12中的顯色，進行樣品溶液中hCG濃度的定量。
圖9顯示了根據實施例3的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性。圖10顯示了實施例3的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的精密度(CV值)。圖11顯示了對比例的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性。圖12顯示了對比例的免疫層析裝置在25℃時的儲存穩定性的精密度(CV值)。在圖9和10中，橫軸代表免疫層析裝置在制成后直至進行測量時的儲存天數，而縱軸代表裝置剛制成后相對于顯色強度的下降比例。在圖11和12中，橫軸代表免疫層析裝置在制成后直至進行測量時的儲存天數，而縱軸代表作為定量精密度指數的CV值。另外，圖13和14分別顯示實施例3和對比例的下降比例，其中使用第14天的測量值作為基準。
由這些圖中可以看出，在對比例的免疫層析裝置中，儲存的天數越多，則靈敏度越低。與此相反，實施例3的免疫層析裝置顯示了由制成的那一天直至第14天的靈敏度下降，而且在第14天后實際上仍具有穩定的靈敏度。對于CV值，對比例表明性能下降，而實施例3的免疫層析裝置的下降比例在約5％的范圍內，而且可確保定量精密度。
具體地，將根據穩定性指數討論免疫層析裝置。在實施例3(圖13)中，穩定性指數保持在±20以內，而且在三個點(第25、52和80天)的測量結果之間靈敏度幾乎沒有變化。對于隨后的測量，不發生下降的可能性非常高。另一方面，在對比例(圖14)中，雖然穩定性指數在最大濃度時保持在±20以內，但在第26天和第54天之間觀察到的變化(降低)最大(0.01mg/dl)可達到70％。在其他濃度時，也觀察到類似的趨勢。因此可以預測，在隨后的測量中穩定性指數將在非所希望的范圍之內。如上所述表明，本發明的體外診斷劑在相當長的時間內都可提供精確的結果根據本發明，通過添加糖或者糖衍生物，即使在進行定量測定時，也可提高體外診斷劑的儲存穩定性。本發明的體外診斷劑具有高可靠性，而且使用者易于處理，不僅可用于臨床測試中，還可用于POC中。
權利要求
1.用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑，其包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
2.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述試劑是抗體或者抗原或者它們的衍生物。
3.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述化合物是糖或者糖衍生物。
4.如權利要求1所述的體外診斷劑，其進一步包括牛血清白蛋白、酪蛋白、表面活性劑、或者脫脂乳。
5.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述化合物包括糖醇或其衍生物。
6.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述化合物包括蔗糖或者山梨糖醇。
7.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述化合物包括蔗糖和山梨糖醇。
8.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述化合物的濃度不低于約3w/v％。
9.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述化合物的濃度為約3-10w/v％。
10.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中該體外診斷劑包括多個特異性地結合蛋白質的試劑，該多個試劑包括第一抗體或者抗原或者它們的衍生物、以及第二抗體或者抗原或者它們的衍生物。
11.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述試劑用膠體顆粒、膠乳顆粒、色素、膠束、酶、熒光物質、或者磷光物質標記。
12.如權利要求1所述的體外診斷劑，其中所述試劑和化合物保留在支持體上。
13.如權利要求12所述的體外診斷劑，其中所述試劑和化合物保留在支持體的不同區域上。
14.如權利要求12所述的體外診斷劑，其中所述支持體是固相基質。
15.如權利要求12所述的體外診斷劑，其中所述支持體包括多孔性材料。
16.如權利要求12所述的體外診斷劑，其中所述支持體包括標記區域、測定區域、以及樣品導入區域，1)所述標記區域包括結合待測試物質的第一抗體或者抗原，2)所述測定區域包括結合待測試物質的第二抗體或者抗原，而且其配置成與所述標記區域流體相通，3)所述樣品導入區域配置成與所述標記區域流體相通。
17.如權利要求16所述的體外診斷劑，其中所述化合物被包含在標記區域和測定區域中的至少一個區域中。
18.如權利要求16所述的體外診斷劑，其中所述化合物被包含在所述標記區域中。
19.制備用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑的方法，其包括以下步驟1)提供與待測試物質特異性結合的試劑，以及2)提供包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
20.檢測樣品中待測試物質的方法，其包括以下步驟A)提供體外診斷劑，該體外診斷劑包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物，B)向所述體外診斷劑上提供樣品，C)使所述體外診斷劑處于所述試劑特異性地與所述樣品反應的條件之下，以及D)檢測由所述試劑與所述樣品的特異性反應產生的信號。
21.體外診斷劑在測量樣品中待測試物質中的應用，該體外診斷劑包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑，以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
全文摘要
本發明提供一種用于測量樣品中的待測試物質的體外診斷劑。該體外診斷劑包括特異性與待測試物質反應的試劑、以及親水性材料(如糖或者糖衍生物)。更具體而言，本發明涉及用于測量樣品中待測試物質的體外診斷劑，其包括1)特異性地與待測試物質反應的試劑、以及2)包含至少一個羥基和至少一個醛基或酮基的化合物。
文檔編號G01N33/558GK1395685SQ01803982
公開日2003年2月5日 申請日期2001年11月19日 優先權日2000年11月20日
發明者北脅文久, 灘岡正剛, 高橋三枝, 田中宏橋, 中山浩 申請人:松下電器產業株式會社