專利名稱：人尿中低密度脂蛋白含量酶聯免疫吸附試驗試劑盒及制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術產品，具體涉及一種人尿中低密度脂蛋白(Low density lipoprotein LDL)含量的酶聯免疫吸附試驗試劑盒及制備方法。
本發明提供了一種LDL含量酶免試劑盒，該試劑盒是用抗體LDL(IgG)包被，抗體LDL(IgG)聯接辣根過氧化物酶為檢測抗體的夾心法，檢測人尿中的LDL含量。并由下列試劑組成①LDL抗體IgG預包被板1塊②LDL抗體IgG酶標記液1瓶③LDL標準(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶④濃縮洗滌液1瓶⑤底物液沖液甲、乙各1瓶⑥終止液1瓶本發明的另一所要解決的技術問題是提供了上述尿中LDL含量的ELISA試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟一、原材料及其規格正常人血清動物新西蘭大白兔，健康雄性，體重2～3kg超速離心機日立牌80-P-7型，RPZ-48T區帶轉子，RPS-50-2水平轉子密度梯度形成儀日立牌，DGP-2型Unic紫外分光度計SP-800型酶聯免疫測定儀Labosystems Dragon Multiskam MK3UV754分光光度計旋渦混合器XW-80型PHS-20型精密酸度計電泳儀上海酶標板華東理工大學ELISA測定CV％(％)＜10％辣根過氧化物酶(RZ3.0，SigMA)NaIO4A.R(進口分裝)NaBH4A.R(進口分裝)其他試劑Na2HPO4.12H2O A.R檸檬酸 A.RNaclA.R甘油化學純H2O2A.RTween-20化學純鄰苯二胺化學純H2SO4A.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規定Low Density lipoprotein，LDL標準品(SigMA)二、包被抗體LDL多克隆抗體的制備(一)區帶密度梯度離心純化LDL操作流程本文參考Hinton(1976)區帶密度梯度離心法，但做了較大改進。使用日立30-P-7離心機，RPZ-48T轉子做區帶離心。先用阿貝折射儀，將NaBr梯度液配制成密度為1.4的液體，然后將密度為1.4的NaBr和密度為1.0的蒸餾水經密度梯度形成儀由邊孔加區帶轉子內，此時轉速維持在2800/rpm。加至中孔有梯度液流出時，再經邊孔用恒流泵注入密度為1.4的人血清50ml。待血樣全部加入后，將轉速上升至42000/rpm離心18小時后共得到四個峰，由中孔收樣，樣品流經Unic紫外分光光度計測得四個脂蛋白組分峰。其中第一個峰呈乳白色，集中在第一管，為極低密度脂蛋白(vLDL)。其余幾個峰均呈淺黃色，分別為低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。其余系去脂血清，含其他雜蛋白高峰。將收集到的峰，選主峰頂部數管不可太寬，以免混入中間密度脂蛋白(IDL)。(二)脂蛋白抗血清LDL的制備按常規制備蛋白質抗血清制備法。首先用純化的LDL溶于0.01MPH7.4磷酸緩沖液中，加等量的福氏完全佐劑乳化后，給新西蘭太白兔，頸背部多點及腳墊內注射2.0mg，為基礎免疫。每兩周加強一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血測試效價，效價滿意者，由心臟抽血收集抗血清，抗血清再經硫酸銨兩次鹽析(50％及33％飽和(NH4)SO4)分步沉淀純化成兔抗人(LDL)抗體IgG(簡稱LDL抗體IgG)。(三)酶標兔抗人LDL抗體IgG交聯物的制備經純化所得的兔抗人LDL抗體IgG與辣根過氧化物酶用改良的過碘酸鈉法交聯獲得“酶標抗體IgG”。試劑配制和操作步驟如下1.過碘酸鈉標記法試劑(1)0.06M NaIO4(0.13克NaIO4，加水至10ml)(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml)(4)0.05M PH9.5碳酸鹽緩沖液甲液無水碳酸鈉10.6克加水至500ml乙液無水碳酸氫鈉16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS(用0.1M PH7.4 PBS稀釋)2.過碘酸標記法的操作步驟7.5mg HRP+0.5ml蒸餾水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分鐘↓加0.16M乙二醇0.5ml室溫30分鐘↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗體IgG 0.5ml(約含LDL抗體IgG 7mg)，混合后裝透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸緩沖液透析過液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小時↓吸出上述結合物混合液，加入等體積飽和硫酸銨，冰箱4℃ 30’后，離心4000轉/分×15分鐘棄上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析過液，換液三次，每次1000ml↓次日，再離心除去不溶物即得“酶標抗體IgG”，分裝于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白LDL酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法的操作步驟尿樣原液包被稀釋液Na2CO30.16克，NaHCO30.29克，NaN30.02克，加水至100ml成為pH9.6碳酸鹽緩沖液。樣品稀釋液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成為pH7.4PBS-Tween 20樣品稀釋液。洗滌液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成為pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗滌液。基質液0.1M Na2HPO45.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M檸檬酸4.86ml(1克檸檬酸加水100ml)鄰苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成為基質液。雙抗體夾心法操作程序0.1ml抗體IgG包被(20μg/ml IgG 4℃過夜)↓洗滌0.1ml樣品(0.1ml尿原液)(37℃2小時)0.1ml脂蛋白標準液LDL標準品(SigMA進口)0-2500ng/ml↓洗滌0.1ml酶標抗體IgG(1∶2000)(37℃2小時)↓洗滌0.1ml基質液(鄰苯二胺4mg溶于10ml)檸檬酸磷酸氫(37℃10分鐘)二鈉緩沖液加3％H2O20.05ml)↓0.05ml 3M H2SO4終止反應↓490nm測OD值(DG3022酶聯免疫測定儀)↓計算含量(五)分離和純化的脂蛋白LDL的鑒定經區帶離心和純化的脂蛋白LDL應用瓊脂糖免疫雙擴散結果顯示出LDL為單一沉淀線，證明抗原已經純化，再經0.22μ除菌濾膜過濾除菌。分別用Lowry氏法測定蛋白質含量做抗原。做免疫原時需新鮮制備品。(六)抗體IgG的鑒定經兩次鹽析純化的LDL抗體IgG，經長海醫院實驗診斷科血清室用免疫電泳鑒定結果，LDL為單一沉淀線。(七)標準曲線的制備倍比稀釋的LDL(SigMA進口)標準液，作雙抗體夾心法ELISA測定，分別繪出標準曲線圖。曲線呈“S”型，靈敏度良好，LDL-蛋白質(LDL-P)最低檢測量均為100μg。標準曲線測定LDL-P含量范圍為100-1000ng/ml。均在正常人含量波動范圍之內。在ELISA雙抗體夾心法的酶標板上的標準曲線的梯度濃度良好。(八)精密度試驗為了明確和證明本研究的脂蛋白(LDL)ELISA的精密度，作了批內、批間和各醫院實驗室間重復性試驗。
批內及批間實驗，用混合血清分別作LDL批內測定，結果見表1。用混合血清作LDL-P批間含量測定，結果見表2。所得變異系數(CV％)，說明本法重復性良好。
表1 ELISA法測定各脂蛋白之批內實驗類別稀釋倍數n X(g/L) SD CV％LDL-P 1∶2000 30 0.80 0.057.01∶4000 30 0.82 0.056.6HDL-P 1∶2000 30 0.27 0.035.01∶4000 30 0.23 0.0210表2 ELISA法測定各脂蛋白之批間實驗類別稀釋倍數n X(g/L) SD CV％LDL-P 1∶2000 45 0.70 0.048.6HDL-P 1∶2000 30 0.22 0.029.0(九)準確性實驗ELISA法與UC法測LDL-P(低密度脂蛋白-蛋白質)的比較。
用14例血樣，每例血樣分別用UC法和ELISA法分離測定LDL-P含量。
UC法，用日立80P-7型離心機及RPS50-2轉子。取血樣0.5ml，以密度為1.003-1.006的NaCL輕梯度液及密度為1.35的NaBr重梯度液配成線性梯度，49000rpm，10～15℃離心4.5小時。用恒流泵將四條LP帶吸出(先用乙酰蘇丹黑B予染呈蘭色)。用Lowry法分別測定LDL-P含量。
ELISA法和UC法測定同一份血樣結果非常顯著相關，其相關系數為r＝0.975(P＜0.01)。上海長海醫院腎內科進行尿脂蛋白測定的試驗目前對腎臟病人尿中各種蛋白質的檢測項目日益增多，而尿脂蛋白測定至今未見報道。本文測定55例各種慢性腎臟病患者尿中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。并對其臨床意義進行初步探討。
檢測對象均為各種慢性腎臟病患者，其中原發性腎病綜合癥(腎病)24例(I型10例，II型14例)；慢性腎功能衰竭(慢性腎衰)19例，慢性腎炎6例；其它腎病包括隱匿性腎炎、肝硬化性腎炎、狼瘡性腎炎、痛風性腎病和雙腎鈣化，糖尿病腎病各1例。所有檢測對象均留24小時尿，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定尿中高密度脂蛋白-蛋白質(HDL-P)和低密度脂蛋白-蛋白質(LDL-P)，以μg/L為單位。另設對照組19例，均為正常成人。結果一、正常人尿中HDL-P和LDL-P的含量對照組正常人19例尿中HDL-P和LDL-P均為“0”。二、腎病病人尿中HDL-P和LDL-P的含量腎病病人24例，尿中HDL-P全部陽性，其中I型平均為226±178.09μg/L；*上海醫學測試中心II型為357.86±172.14μg/L。I型尿LDL-P全部陰性(均為0)；II型則全部為陽性。平均105.63±112.96μg/L，且全部病例尿中HDL-P均＞LDL-P，無1例LDL-P＞HDL-P。三、慢性腎衰病人尿中HDL-P和LDL-P的含量慢性腎衰病人19例，尿中HDL-P陽性者16例(84％)，平均為411.63±392.24μg/L；尿中LDL-P陽性者12例(63％)，平均為353.33±295.91μg/L。尿中HDL-P＞LDL-P者5例(26％)。四、慢性腎炎病人HDL-P和LDL-P的含量慢性腎炎病人6例，尿中HDL-P與LDL-P均陽性，HDL-P平均為3.01±162.50μg/L，LDL-P平均為164.50±127.90μg/L。全部病例尿中HDL-P均＞LDL-P。五、其他腎臟病人尿中HDL-P和LDL-P的含量其他腎臟病人共6例，尿中HDL-P除1例狼瘡性腎炎外，其余5例均陽性；但尿中LDL-P有3例陰性(狼瘡性腎炎、肝硬化腎炎和痛風性腎病各1例)，兩者均陽性者，HDL-P＞LDL-P。討論檢驗中查見正常人對照組尿中HDL-P和LDL-P均為陰性，而慢性腎臟病人皆為陽性(兩者均陽性或二者之一為陽性)者52例(95％)，可見尿脂蛋白測定可作為慢性腎臟損害的指標之一。
在無明顯腎功能不全的腎病組，慢性腎炎和其他腎臟病人尿中HDL-P檢出的陽性率分別為100％、100％和83％，而LDL-P則為58％、100％和50％，前者平均為94％，后者平均為69％。就例數而言，上述3組病人尿中HDL-P陽性者共35例(僅1例陰性)，而尿中LDL-P陽性者23例(13例陰性)。也就是在尿中HDL-P陽性者中有12例尿中LDL-P陰性。就數值而言，腎病組和慢性腎炎組病人尿中HDL-P平均值明顯＞LDL-P平均值(腎病組尿HDL-P平均值與尿LDL-P平均值相差非常顯著，P＜0.001)；其它腎病組各例尿中HDL-P均＞LDL-P。故認為對于無明顯腎功能不全的腎臟病人檢測其尿中HDL-P較LDL-P敏感。
慢性腎衰組尿中HDL-P雖檢出陽性率及平均值均＞LDL-P(兩者平均值相差不顯著，P＞0.05)，但其中5例尿中LDL-P明顯＞HDL-P(包括尿HDL-P陰性者而尿LDL-P460μg/I1例)，1例中尿中HDL-P與LDL-P相等(均為500μg/L)。經統計學處理證明與尿HDL-P或血LDL-P均無相關性。另2例兩者均陰性，但與血中尿素氮，血清肌酐或肌酐清除率均無相關性。
24例腎病病人中I型者尿中HDL-P均陽性，而LDL-P均陰性；II型者兩者均陽性，故可作為腎病I型與II型鑒別的指標之一。I型尿脂蛋白檢查與尿中C3測定或園盤電泳檢測白蛋白相吻合；II型尿脂蛋白檢查與激素反應相吻合。這種差異的機理似與兩種脂蛋白的園形顆粒直徑大小不同有關，HDL-P為6.5～9.5mum，LDL為20～25mum，HDL明顯＜LDL，一般認為I型腎小球濾過膜損害較輕，推測其僅允許顆粒直徑小的HDL通過，而不允許顆粒直徑大的LDL通過；而II型腎小球濾過膜損害嚴重，則顆粒直徑大的LDL也可通過。故初步認為對尿脂蛋白測定可作為選擇性蛋白尿與非選擇性蛋白尿鑒別指標之一。
采用上海新新醫學生物工程有限公司提供ELISA法及其試劑盒測定尿中HDL-P和LDL-P是一種簡單快速、不需特殊儀器、易掌握的優于腎臟病尿中其檢驗方法，并具有高度的敏感性和特異性。故從方法學來講，對腎臟病的診斷和分型有重要的臨床應用價值，應大力推廣。上海第二醫科大學附屬新華醫院用ELISA法測定尿中脂蛋白的試驗在某些疾病中，尿中可出現脂蛋白。本文用酶聯免疫吸附試驗(簡稱ELISA)法，在我院首次用于臨床檢測38例慢性腎臟疾患尿中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)，現將結果公布如下一、方法用上海新新醫學生物工程有限公司提供的藥盒，以ELISA法進行檢測。二、對象(1)選正常人3個年齡組，4～16歲組(男25人，女12人)，17～23歲組(男28人，女17人)，45～60歲組(男40人，女27人)。測定其中高密度脂蛋白—蛋白質(HDL-P)及低密度脂蛋白—蛋白質(LDL-P)含量。
(2)選正常人15人，慢性腎臟疾患38例，其中腎病綜合癥18例。測定其尿中HDL-P及LDL-P含量。三、結果1.ELISA方法學鑒定(1)HDL-P及LDL-P的標準曲線(如
圖1 ELISA法測脂蛋白的標準曲線所示)，曲線呈“S”狀，可測范圍在80～1000ng/L之間，與長海醫院的標準曲線基本一致。
(2)我院與長海醫院同做一組血樣結果，發現HDL-P含量呈顯著相關(如圖2所示)n＝10，r＝0.642，P＜0.05。LDL-P含量(如圖3所示)呈非常顯著相關。N＝10，r＝0.817，P＜0.01。
2.正常人血中脂蛋白含量血中HDL-P含量，三個年齡組含量均值相差不大。LDL-P含量均值隨年齡而增加。HDL-P及LDL-P含量，均女性高于男性。
3.正常人尿中脂蛋白含量檢測正常人對照15例，尿中HDL-P及LDL-P均為陰性。檢測腎病綜合癥18例，結果見表3。I型(8例)腎病綜合癥尿中HDL-P為陽性，LDL-P為陰性，II型(10例)腎病綜合癥尿中HDL-P及LDL-P均為陽性。四、討論根據我院試用ELISA方法結果，呈“S”型的標準曲線與長海醫院基本一致。同做一組樣品呈顯著相關。說明該法準確性及重演性均較好。
正常人血中HDL-P及LDL-P含量與長海醫院結果相一致。
15例正常人尿中均未見HDL及LDL，而腎病綜合癥組患者，I型(輕型)尿中只出現HDL而II型(重型)尿中出現HDL及LDL。由于呈球狀的LP分子顆粒大小不一樣，LDL分子直徑約為HDL的2～3倍，因此尿中LP出現的種類不同不僅說明腎小球瀘過膜受到損害，而且還能說明其損害的程度，故用ELISA法對腎病綜合癥進行分型比其他方法更為敏感，而HDL比LDL又更敏感些。ELISA法簡便快速，特異性強，靈敏度高，用于臨床有較大的社會效益和經濟效益。
表3 腎病綜合癥尿中HDL及LDL含量(μg/L)I型 II型HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P0 0 450 1003000 440 1004000 300 2003000 500 4004500 620 3000 0 400 3005000 820 8000 0 500 300600 450400 260上海第六人民醫院用ELISA法測定血和尿中脂蛋白的試驗上海新新醫學生物工程有限公司創立了用ELISA法檢測腎病病人尿中脂蛋白組分的新方法。我院用其提供的藥盒用于臨床，感到較原來的方法更為科學，合理。現將結果公布如下一、方法用上海新新醫學生物工程有限公司提供的藥盒，以ELISA法進行檢測。二、對象選正常健康人10人，急慢性腎臟疾患28例，其中急慢性腎炎8例，腎病綜合癥10例，蛋白尿10例，測定其尿中HDL-P及LDL-P含量。三、結果(一)ELISA方法學鑒定1.HDL-P及LDL-P的標準曲線(如圖4所示)，曲線呈“S”狀，可測范圍在80～1000ng/L之間，與長海醫院的標準曲線基本一致。
2.我院與長海醫院同做一組血樣結果，發現HDL-P含量呈顯著相關(如圖5所示)，LDL-P含量呈非常顯著相關(如圖6所示)。(二)檢測健康人尿液10例，HDL-P和LDL-P均為陰性檢測各種腎病28例尿液中脂蛋白組分含量，其中急慢性腎炎3例，3例HDL陽性(陽性率38％)，2例LDL陽性(陽性率25％)，腎病綜合癥10例，8例HDL陽性，(陽性率80％)，5例LDL陽性(陽性率50％)，蛋白尿10例，6例HDL陽性(陽性率60％)，3例LDL陽性(陽性率30％)，見附表4。
表4 各腎臟疾患尿中脂蛋白含量(μg/L)急慢性腎炎腎病綜合癥 蛋白尿HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P- - 200- - -700- - - - -360- 640100*620100300- 640250*520-- - 2000 320*450200- - - - 300-40032045080*460-400260300- 540150400- - -44070*- -注*者為腎病綜合癥II型四、討論根據我院試用ELISA方法，呈“S”型的標準曲線與長海醫院基本一致。同做一組樣品呈顯著相關。說明該法準確性及重復性均較好。10例健康人尿中均未見HDL及LDL，而各種腎臟疾患則程度不同地出現HDL或(LDL)。有意義的是，在10例腎病綜合癥患者中，僅含有HDL均為陰性的是臨床診斷為I型(輕型)的病人，而II型(重型)尿中出現HDL和LDL這是由于腎小球濾過膜受損的嚴重程度不一，以及小分子量的HDL比LDL更容易濾出的原因故用ELISA法對腎病綜合癥進行分型比其他方法更為敏感。在蛋白尿和急慢性腎炎時，我們也可根據其尿中LP的種類及多少，來診斷其病情的嚴重程度以及預后等等。同濟大學上海放射免疫研究所用ELISA法測定人尿中脂蛋白的試驗在某些腎臟疾病中，尿中可出現不同類型的脂蛋白，但以往沒有見過這方面的報導。我所首先運用上海新新醫學生物工程有限公司創立的用酶聯免疫吸附試驗(簡稱ELISA)法檢測人尿中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。
現將結果公布如下一、方法用上海新新醫學生物工程有限公司提供的藥盒，以ELISA法進行檢測。二、對象(1)選正常健康人3個年齡組，4～16歲組(男20人，女30人)，17～23歲組(男25人，女20人)和45～60歲組(男35人，女30人)，測定其中高密度脂蛋白2-蛋白質(HDL-P)及低密度脂蛋白—蛋白質(LDL-P)含量。
(2)選正常健康人10人，慢性腎臟疾患27例，其中腎病綜合癥16例，慢性腎炎11例，測定其尿中HDL-P及LDL-P含量。三、結果1.ELISA方法學鑒定(1)HDL-P及LDL-P的標準曲線(如圖7 ELISA法測脂蛋白的標準曲線所示)，曲線呈“S”狀。可測范圍在80～1000ng/L之間，與長海醫院的標準曲線基本一致。
(2)我所與長海醫院同做一組樣品，結果發現HDL-P含量呈顯著相關。n＝10，r＝0.726，P＜0.05(如圖8所示)，LDL-P含量呈非常顯著相關。n＝10，r＝0.866，p＜0.01(如圖9所示)。
(3)檢測正常健康人尿中脂蛋白組分含量尿中HDL-P及LDL-P均為“0”。檢測腎病綜合癥16例，其中I型7例，II型9例，尿中脂蛋白含量見表5。檢測慢性腎炎11例，尿中脂蛋白含量見表6。
表5 腎病綜合癥病人尿中脂蛋白含量(μg/L)I型 II型HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P450 0 300200300 0 500400400 0 100400440 0 100240300 0 220210450 0 300 1600 0 530 110700 230800 250四、討論根據我所試用ELISA方法結果，呈“S”型的標準曲線與長海醫院基本一致。同做一組樣品呈顯著相關。說明該法準確性及重演性均好。10例健康人尿中均未見HDL和LDL，而腎病綜合癥16例表6 慢性腎炎病人尿中脂蛋白的含量(μg/L)HDL-PLDL-P400 32000400 260500 2500000100 000250 10000600 320尿中HDL陽性有15例，陽性率為93.7％，LDL陽性有9例，陽性率為60％，有意義的是，I型(輕型)尿中只出現HDL，而II型(重型)尿中出現HDL和LDL。由于呈球狀的LP分子顆粒大小不一樣，LDL分子直徑約為HDL的2～3倍，因此尿中LP出現的種類不同有僅說明腎小球瀘過膜受到損害，而且還能說明其損害的程度，故用ELISA法對腎病綜合癥進行分型比其他方法更為敏感。慢性腎炎病人11例，其中6例HDL陽性，陽性率為54％，5例LDL陽性，陽性率為45％，可根據該病人尿中是否出現LP，以及出現的種類，含量的多少，來判斷腎炎病人的病情輕重，以及預后。ELISA法簡便快速，特異性強，靈敏度高，用于臨床有較大的社會效益和經濟效益。
本文參考Hinton(1976)區帶密度梯度離心法，但做了較大改進。使用日立30-P-7離心機，RPZ-48T轉子做區帶離心。先用阿貝折射儀，將NaBr梯度液配制成密度為1.4的液體，然后將密度為1.4的NaBr和密度為1.0的蒸餾水經密度梯度形成儀由邊孔加區帶轉子內，此時轉速維持在2800/rpm。加至中孔有梯度液流出時，再經邊孔用恒流泵注入密度為1.4的人血清50ml。待血樣全部加入后，將轉速上升至42000/rpm離心18小時后共得到四個峰，由中孔收樣，樣品流經Unic紫外分光光度計測得四個脂蛋白組分峰。其中第一個峰呈乳白色，集中在第一管，為極低密度脂蛋白(vLDL)。其余幾個峰均呈淺黃色，分別為低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。其余系去脂血清，含其他雜蛋白高峰。將收集到的峰，選主峰頂部數管不可太寬，以免混入中間密度脂蛋白(IDL)。(二)脂蛋白抗血清LDL的制備按常規制備蛋白質抗血清制備法。首先用純化的LDL溶于0.01MPH7.4磷酸緩沖液中，加等量的福氏完全佐劑乳化后，給新西蘭大白兔，頸背部多點及腳墊內注射2.0mg，為基礎免疫。每兩周加強一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血測試效價，效價滿意者，由心臟抽血收集抗血清，抗血清再經硫酸銨兩次鹽析(50％及33％飽和(NH4)SO4)分步沉淀純化成兔抗人(LDL)抗體IgG(簡稱LDL抗體IgG)。(三)酶標兔抗人LDL抗體IgG交聯物的制備經純化所得的兔抗人LDL抗體IgG與辣根過氧化物酶用改良的過碘酸鈉法交聯獲得“酶標抗體IgG”。試劑配制和操作步驟如下1.過碘酸鈉標記法試劑(1)0.06M NaIO4(0.13克NaIO4，加水至10ml)(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml)(4)0.05M PH9.5碳酸鹽緩沖液甲液無水碳酸鈉10.6克加水至500ml乙液無水碳酸氫鈉16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS(用0.1M PH7.4 PBS稀釋)。2.過碘酸標記法的操作步驟7.5mg HRP+0.5ml蒸餾水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分鐘↓加0.16M乙二醇0.5ml室溫30分鐘
↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗體IgG 0.5ml(約含LDL抗體IgG 7mg)，混合后裝透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸緩沖液透析過液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小時↓吸出上述結合物混合液，加入等體積飽和硫酸銨，冰箱4℃ 30’后，離心4000轉/分×15分鐘棄上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析過液，換液三次，每次1000ml↓次日，再離心除去不溶物即得“酶標抗體IgG”，分裝于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白LDL酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法的操作步驟尿樣原液包被稀釋液Na2CO30.16克，NaHCO30.29克，NaN30.02克，加水至100ml成為pH9.6碳酸鹽緩沖液樣品稀釋液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成為pH7.4PBS-Tween 20樣品稀釋液洗滌液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成為pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗滌液。基質液0.1M Na2HPO45.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M檸檬酸4.86ml(1克檸檬酸加水100ml)鄰苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成為基質液。
表I 雙抗體夾心法操作程序0.1ml抗體IgG包被(20μg/ml IgG 4℃過夜)↓洗滌0.1ml樣品(0.1ml尿原液)(37℃2小時)0.1ml脂蛋白標準液 LDL標準品(SigMA進口)0-2500ng/ml↓洗滌0.1ml酶標抗體IgG(1∶2000)(37℃2小時)↓洗滌0.1ml基質液(鄰苯二胺4mg溶于10ml)檸檬酸磷酸氫(37℃ 10分鐘)二鈉緩沖液加3％H2O20.05ml)
↓0.05ml 3M H2SO4終止反應↓490nm測OD值(DG 3022酶聯免疫測定儀)↓計算含量(五)分離和純化的脂蛋白LDL的鑒定經區帶離心和純化的脂蛋白LDL應用瓊脂糖免疫雙擴散結果顯示出LDL為單一沉淀線，證明抗原已經純化，再經0.22μ除菌濾膜過濾除菌。分別用Lowry氏法測定蛋白質含量做抗原。做免疫原時需新鮮制備品。(六)抗體IgG的鑒定經兩次鹽析純化的LDL抗體IgG，經長海醫院實驗診斷科血清室用免疫電泳鑒定結果，LDL為單一沉淀線。(七)標準曲線的制備倍比稀釋的LDL(SigMA進口)標準液，作雙抗體夾心法ELISA測定，分別繪出標準曲線圖。曲線呈“S”型，靈敏度良好，LDL-蛋白質(LDL-P)最低檢測量均為100μg。標準曲線測定LDL-P含量范圍為100-1000ng/ml。均在正常人含量波動范圍之內。在ELISA雙抗體夾心法的酶標板上的標準曲線的梯度濃度良好。(七)精密度試驗為了明確和證明本研究的脂蛋白(LDL)ELISA的精密度，作了批內、批間和各醫院實驗室間重復性試驗。
批內及批間實驗，用混合血清分別作LDL批內測定，結果見表1。用混合血清作LDL-P批間含量測定，結果見表2。所得變異系數(CV％)，說明本法重復性良好。
表1 ELISA法測定各脂蛋白之批內實驗類別 稀釋倍數n X(g/L) SD CV％LDL-P 1∶2000 300.80 0.057.01∶4000 300.82 0.056.6HDL-P 1∶2000 300.27 0.035.01∶4000 300.23 0.0210
表2 ELISA法測定各脂蛋白之批間實驗類別 稀釋倍數 nX(g/L) SD CV％LDL-P1∶200045 0.70 0.048.6HDL-P1∶200030 0.22 0.029.0(九)準確性實驗ELISA法與UC法測LDL-P(低密度脂蛋白-蛋白質)的比較。
用14例血樣，每例血樣分別用UC法和ELISA法分離測定LDL-P含量。
UC法，用日立80P-7型離心機及RPS50-2轉子。取血樣0.5ml，以密度為1.003-1.006的NaCL輕梯度液及密度為1.35的NaBr重梯度液配成線性梯度，49000rpm，10～15℃離心4.5小時。用恒流泵將四條LP帶吸出(先用乙酰蘇丹黑B予染呈蘭色)。用Lowry法分別測定LDL-P含量。
ELISA法和UC法測定同一份血樣結果非常顯著相關，其相關系數為r＝0.975(P＜0.01)。
權利要求
1.一種人尿中低密度脂蛋白的含量酶聯免疫吸附試驗試劑盒，其特征在于該試劑盒是由下列試劑組成的①LDL抗體IgG預包被板1塊②LDL抗體IgG酶標記液1瓶③LDL標準(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶④濃縮洗滌液1瓶⑤底物液沖液甲、乙各1瓶⑥終止液1瓶
2.一種如權利要求1所述的一種人尿中低密度脂蛋白含量酶聯免疫吸附試驗試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟一、原材料及其規格正常人血清動物新西蘭大白兔，健康雄性，體重2～3kg超速離心機日立牌80-P-7型，RPZ-48T區帶轉子，RPS-50-2水平轉子密度梯度形成儀日立牌，DGP-2型Unic紫外分光度計SP-800型酶聯免疫測定儀Labosys tems Dragon Multiskan MK3UV754分光光度計旋渦混合器XW-80型PHS-20型精密酸度計電泳儀上海酶標板華東理工大學ELISA測定CV％＜10％辣根過氧化物酶RZ3.0，SigMANaIO4A.R進口分裝NaBH4A.R進口分裝其他試劑Na2HPO4.12H2O A.R檸檬酸 A.RNaclA.R甘油化學純H2O2A.RTween-20化學純鄰苯二胺化學純H2SO4A.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規定Low Density lipoprotein，LDL標準品SigMA二、包被抗體LDL多克隆抗體的制備(一)區帶密度梯度離心純化LDL操作流程本文參考Hinton 1976區帶密度梯度離心法，但做了較大改進。使用日立30-P-7離心機，RPZ-48T轉子做區帶離心，先用阿貝折射儀，將NaBr梯度液配制成密度為1.4的液體，然后將密度為1.4的NaBr和密度為1.0的蒸餾水經密度梯度形成儀由邊孔加區帶轉子內，此時轉速維持在2800/rpm，加至中孔有梯度液流出時，再經邊孔用恒流泵注入密度為1.4的人血清50ml，待血樣全部加入后，將轉速上升至42000/rpm離心18小時后共得到四個峰，由中孔收樣，樣品流經Unic紫外分光光度計測得四個脂蛋白組分峰，其中第一個峰呈乳白色，集中在第一管，為極低密度脂蛋白vLDL，其余幾個峰均呈淺黃色，分別為低密度脂蛋白LDL及高密度脂蛋白HDL，其余系去脂血清，含其他雜蛋白高峰，將收集到的峰，選主峰頂部數管不可太寬，以免混入中間密度脂蛋白IDL；(二)脂蛋白抗血清LDL的制備按常規制備蛋白質抗血清制備法，首先用純化的LDL溶于0.01MPH7.4磷酸緩沖液中，加等量的福氏完全佐劑乳化后，給新西蘭大白兔，頸背部多點及腳墊內注射2.0mg，為基礎免疫，每兩周加強一次，共免疫6次，最后一次免疫后8-10天抽血測試效價，效價滿意者，由心臟抽血收集抗血清，抗血清再經硫酸銨兩次鹽析，50％及33％飽和(NH4)SO4分步沉淀純化成兔抗人LDL抗體IgG，簡稱LDL抗體IgG；(三)酶標兔抗人LDL抗體IgG交聯物的制備經純化所得的兔抗人LDL抗體IgG與辣根過氧化物酶用改良的過碘酸鈉法交聯獲得“酶標抗體IgG”，試劑配制和操作步驟如下I.過碘酸鈉標記法試劑(1)0.06M NaIO4，0.13克NaIO4，加水至10ml(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4，5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml(4)0.05M PH9.5碳酸鹽緩沖液甲液無水碳酸鈉10.6克加水至500ml乙液無水碳酸氫鈉16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS，用0.1M PH7.4 PBS稀釋II.過碘酸標記法的操作步驟7.5mg HRP+0.5ml蒸餾水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分鐘↓加0.16M乙二醇0.5ml室溫30分鐘↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗體IgG 0.5ml約含LDL抗體IgG 7mg，混合后裝透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸緩沖液透析過液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml 5mg/ml置冰箱2小時↓吸出上述結合物混合液，加入等體積飽和硫酸銨，冰箱4℃ 30’后，離心4000轉/分×15分鐘棄上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析過液，換液三次，每次1000ml↓次日，再離心除去不溶物即得“酶標抗體IgG”，分裝于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白LDL酶聯免疫吸附試驗ELISA雙抗體夾心法的操作步驟尿樣原液包被稀釋液Na2CO30.16克，NaHCO30.29克，NaN30.02克，加水至100ml成為pH9.6碳酸鹽緩沖液樣品稀釋液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成為pH7.4PBS-Tween 20樣品稀釋液洗滌液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成為pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗滌液基質液0.1M Na2HPO45.14ml，3.6克Na2HPO4加水100ml，0.05M檸檬酸4.86ml，1克檸檬酸加水100ml鄰苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成為基質液。雙抗體夾心法操作程序0.1ml抗體IgG包被，20μg/ml IgG 4℃過夜↓洗滌0.1ml樣品0.1ml尿原液，37℃2小時0.1ml脂蛋白標準液 LDL標準品，SigMA進口0-2500ng/ml↓洗滌0.1ml酶標抗體IgG 1∶2000，37℃2小時↓洗滌0.1ml基質液，鄰苯二胺4mg溶于10ml檸檬酸磷酸氫，37℃ 10分鐘二鈉緩沖液加3％H2O20.05ml↓0.05ml 3M H2SO4終止反應↓490nm測OD值，DG3022酶聯免疫測定儀↓計算含量(五)分離和純化的脂蛋白LDL的鑒定經區帶離心和純化的脂蛋白LDL應用瓊脂糖免疫雙擴散結果顯示出LDL為單一沉淀線，證明抗原已經純化，再經0.22μ除菌濾膜過濾除菌，分別用Lowry氏法測定蛋白質含量做抗原。做免疫原時需新鮮制備品；(六)抗體IgG的鑒定經兩次鹽析純化的LDL抗體IgG，經長海醫院實驗診斷科血清室用免疫電泳鑒定結果，LDL為單一沉淀線；(七)標準曲線的制備倍比稀釋的LDL SigMA進口標準液，作雙抗體夾心法ELISA測定，分別繪出標準曲線圖，曲線呈“S”型，靈敏度良好，LDL-蛋白質LDL-P最低檢測量均為100μg，標準曲線測定LDL-P含量范圍為100-1000ng/ml，均在正常人含量波動范圍之內，在ELISA雙抗體夾心法的酶標板上的標準曲線的梯度濃度良好；(七)精密度試驗為了明確和證明本研究的脂蛋白LDL ELISA的精密度，作了批內、批間和各醫院實驗室間重復性試驗；批內及批間實驗，用混合血清分別作LDL批內測定，結果見表1，用混合血清作LDL-P批間含量測定，結果見表2，所得變異系數(CV％)，說明本法重復性良好；表1 ELISA法測定各脂蛋白之批內實驗類別稀釋倍數 n X(g/L)SD CV％LDL-P 1∶2000 30 0.80 0.05 7.01∶4000 30 0.82 0.05 6.6HDL-P 1∶2000 30 0.27 0.03 5.01∶4000 30 0.23 0.02 10表2 ELISA法測定各脂蛋白之批間實驗類別 稀釋倍數 n X(g/L) SD CV％LDL-P1∶2000 450.70 0.048.6HDL-P1∶2000 300.22 0.029.0(九)準確性實驗ELISA法與UC法測LDL-P，低密度脂蛋白-蛋白質的比較；用14例血樣，每例血樣分別用UC法和ELISA法分離測定LDL-P含量；UC法，用日立80P-7型離心機及RPS50-2轉子，取血樣0.5ml，以密度為1.003-1.006的NaCL輕梯度液及密度為1.35的NaBr重梯度液配成線性梯度，49000rpm，10～15℃離心4.5小時，用恒流泵將四條LP帶吸出，先用乙酰蘇丹黑B予染呈蘭色，用Lowry法分別測定LDL-P含量；ELISA法和UC法測定同一份血樣結果非常顯著相關，其相關系數為r＝0.975，P＜0.0全文摘要
本發明涉及生物技術產品技術領域。本發明公開了一種人尿中低密度脂蛋白含量酶聯免疫吸附試驗試劑盒及制備方法。本發明的試劑盒經臨床試驗結果表明對腎病患者的診斷比較確切，方法簡便快速，特異性強，靈敏度高，有較好的臨床應用前景。
文檔編號G01N33/487GK1427258SQ0114268
公開日2003年7月2日 申請日期2001年12月18日 優先權日2001年12月18日
發明者杜鳳鳴 申請人:杜鳳鳴