專利名稱：多分析物免疫測定的制作方法
技術領域：
本發明涉及多分析物免疫測定，例如使用在其上面具有一系列分析物特異性配體的生物芯片或微片進行的多分析物免疫測定。
背景技術：
現有技術中已描述過生物芯片/微片在免疫測定或核苷酸雜交測定的大量測定中的應用。對于通常設計的裝配式陣列，有大量獨立反應位點位于固體載體上的空間不同區域中。這些陣列可包含高密度的固定在固體載體表面上的相同或不同分子。
不論在何時測試一組多分析物，都需要正確地定量測定出存在于未知樣本中的各分析物的量。因此，對于呈現在一組多分析物上的各個分析物，必須產生最佳標準曲線。該標準曲線必須覆蓋適用于測定其所呈現的特定分析物和適于欲測定的患者樣本類型的動態范圍。該動態范圍是衡量該測定法對所測定的分析物的靈敏度的量度標準。
在必須檢測各分析物的濃度范圍方面會產生困難。因為對于一組分析物，必需測定的各分析物的濃度范圍可能相差很大，所以對各標準曲線的最優化會帶來靈敏度問題。
在一組多分析物的標準曲線中必須包括的這種動態范圍的多樣性會在必須加到各生物芯片中的多綴合物的生成過程中帶來實際問題。這樣的多綴合物是用于將適于各獨立免疫測定的可檢測標記物加到生物芯片中的試劑。這樣的可檢測標記物使得各免疫測定能夠顯現出來，并且隨后能夠在生物芯片上被定量測定。
例如，對于一系列結合生物芯片格式中濫用藥物的配體，需要控制標準曲線的形狀。常規篩選指標覆蓋廣泛的濃度范圍；例如，截止范圍是從LSD的0.5ng/ml到鴉片劑的2000ng/ml。
如果所討論的分子在其分子量和免疫原性方面非常類似，這有相當的難度。因此這些分子的所有抗體在可達到的檢測限方面具有非常類似的特征。在目前的測試方法中，各種藥物有其自己的特異性試驗。這使得試驗廠商可以調整各獨立試驗以給該特定藥物試驗提供最好的篩選指標。然而，在多分析物格式中，將這些條件應用于生物芯片上出現的全部的測定范圍。因此，可用于提供寬范圍截止限的選擇很有限。
US-A-4722889和US-A-5026653公開了通過與對分析物有特異性的標記抗體反應來測定樣本中分析物的方法。此外，可使用對分析物有低特異性、但是對起干擾物作用的類似物有高特異性的清除單克隆抗體。
WO-A-98/26644公開了使用與分析物反應的“檢測抗體”來測定樣本中的分析物例如濫用的藥物的方法。第二個反應使用了“中和抗體”(可能與檢測抗體相同)，這樣的抗體結合分析物，并由此阻止分析物在用檢測抗體進行的測定中發生正反應。因此，與檢測抗體發生正反應、但是在第二個反應中反應下降的樣本含有目的分析物；在這兩個反應中給出類似正反應的樣本含有干擾物。該方法的優點是無需知道干擾物的確切性質。
發明概述本發明是基于下述認識，即當考慮到每一分析物必須在與一組分析物的其它分析物非常不同的濃度下檢測，并且每一綴合物必須以適于其所識別的特定分析物的濃度/稀釋度呈現在多綴合物試劑中時，可能難以將動態范圍最優化。現在已經認識到，可能需要以彼此非常不同的濃度檢測和定量測定一組分析物中的分析物。
具體來說，本發明涉及改變發現在一個區域中靈敏度太高、而在另一區域中靈敏度不夠高的標準曲線(對于在所考慮的一組多分析物中發現的一種分析物/一系列分析物)的靈敏度。它包括向測定系統中，例如向測定緩沖液中加入一定量的清除抗體或其它清除物質。這樣的清除物質可以與固定在生物芯片表面上以捕獲分析物的清除劑相同或不同。使用清除物質的目的是特異性地清除/掃除樣本(標準或患者樣本)中的一些分析物，并由此降低其有效的可檢測濃度。這也降低了標準曲線的非常靈敏部分的靈敏度，并改善了標準曲線另一區域的靈敏度。
本發明描述用于本發明的生物芯片可通過已知方法制得。參見例如GB-A-2324866。
這樣的生物芯片提供了一組配體，例如抗體。可能有幾種對于不同分析物有特異性的不同配體。這種新的測定方法可用于測試一種或多種這樣的分析物，并且可使用一種或多種抗體。可以使用的其它清除物質對于本領域技術人員來說是顯而易見的，并包括aptamer。這樣的清除物質一般包含在測定緩沖液中，測定緩沖液通常含有常規組分如溶劑等。
標準曲線的靈敏度是B/Bo的函數，其中B和Bo分別代表結合物質和零標準物的光單位值。可以在需要定量測定的每一情況下構建標準曲線。或者，例如對于濫用藥物測定，是/否測定是令人滿意的，對于此在100％截止的校準是合適的。
為了舉例說明，本發明涉及一組濫用藥物多分析物，并使用抗體作為清除劑。典型的這樣一組多分析物包括用于測定下述濫用藥物的競爭性免疫測定苯丙胺、脫氧麻黃堿、THC、苯并二氮雜、鴉片劑、巴比妥類藥物、苯甲酰愛康寧、美沙酮、PCP和LSD。
對于濫用藥物標準曲線(0％-300％)，100％標準含有每一這些藥物的截止濃度，即在截止濃度以下能斷定樣本在藥物方面呈陰性，在截止濃度以上能斷定樣本在藥物方面呈陽性。是如下所列出的寬范圍截止濃度在從加入多綴合物中獲得所有分析物的合適標準曲線過程中引起問題。濫用藥物 截止苯丙胺 1000ng/ml脫氧麻黃堿 1000ng/mlTHC 50ng/ml苯并二氮雜 200ng/ml鴉片劑 2000ng/ml或300ng/ml巴比妥類藥物 200ng/ml苯甲酰愛康寧 300ng/ml美沙酮 300ng/mlPCP25ng/mlLSD0.5ng/ml在確定清除抗體的用量時，通常必須在下述兩個方面折中即在0％-25％標準之間增加B/Bo的值，和在75％-100％-125％之間不減小降低值。換句話說，雖然目的是使得曲線的靈敏度在0％-25％之間降低，但是在確定每種藥物的截止判定值的75％-125％之間靈敏度必須不能降低。因此非常重要的是，使靈敏度在截止區域附近最大，以精確地確定樣本的肯定性或否定性。
任一特定分析物的截止區域是已知的，或者可由本領域技術人員容易地確定出。本領域技術人員還可以容易地確定出如何使曲線的靈敏度在截止點附近最大。
使用PCP、BZG和苯丙胺進行實驗，以證實通過加入不同量的適當清除抗體在截止區域所達到的標準曲線的改變程度。更具體地說，下述PCP、BZG和苯丙胺的數據證實了在不加入清除抗體的情況下標準曲線在截止區域不夠靈敏(對于每一種情況下其在0％-25％之間過于靈敏)。對于本發明目的和這些分析物，曲線在0％-25％之間過于靈敏，在超過該點的區域內不夠靈敏。
PCP的結果如下所示
表1
加入1-2mg/L PCP抗體顯著地改善了曲線在75-125％截止區域附近的靈敏度。這清楚地表明了抑制下降百分比從沒有加入抗體時的11.45％(B/Bo從75％時的31.79減小到125％時的20.34)減小到加入2mg/L PCP抗體時的46.22％(B/Bo從75％時的95.72減小到125％時的49.50)。
BZG的結果如下所示表2
為了顯著改善此標準曲線的靈敏度，必須加入大量BZG抗體。必須加入50-80mg/L來改善截止區域的靈敏度。在沒有加入抗體時，抑制下降百分比是4.99％(B/Bo從75％時的14.46減小到125％時的9.47)，加入80mg/L BZG抗體時改善至17.51％(B/Bo從75％時的47.89減小到125％時的30.38)。苯丙胺的結果如下所示表3
為了改善標準曲線的截止區域的靈敏度，1.25mg/L苯丙胺抗體是最佳加入量。超過1.25mg/L的濃度不能進一步改善結果。在沒有加入抗體時，抑制下降百分比是2.12％(B/Bo從75％時的5.61％減小到125％時的3.49％)，加入1.25mg/L苯丙胺抗體時改善至26.92％(B/Bo從75％時的67.83％減小到125％時的40.91％)。
權利要求
1.測定樣本中分析物的方法，其中是將樣本與包括對分析物有特異性的配體在內的一組配體接觸，并且還加入能結合分析物以由此降低其有效濃度的清除物質。
2.根據權利要求1的測定方法，其中所述分析物是濫用藥物。
3.根據權利要求1或2的測定方法，其中抗體的加入量使得標準曲線的靈敏度在截止區域附近達到最大。
4.根據任一前述權利要求的測定方法，其中所述清除物質是抗體。
全文摘要
測定樣本中分析物的方法,其中是將樣本與包括對分析物有特異性的配體在內的一組配體接觸,并且還加入能結合分析物以由此降低其有效濃度的清除物質。
文檔編號G01N33/543GK1353312SQ01137938
公開日2002年6月12日 申請日期2001年11月6日 優先權日2000年11月6日
發明者S·P·菲茨格拉德, J·V·拉蒙特, R·I·麥克康奈爾 申請人:蘭道克斯實驗有限公司