專利名稱：一種篩選抑制新血管生成藥物的方法和用于該方法的細胞系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選抑制新血管生成藥物的方法和用于該方法的細胞系。
目前，對CD146功能方面的認識非常有限。已證實它是細胞黏附分子和細胞胞內外的信號傳導分子[4-6]，對局部的黏附集合，細胞骨架重組，細胞間相互作用，細胞形態維護，細胞遷移、增生控制都起著作用。另外，CD146在腫瘤發展、胚泡植入、胎盤形成中等過程發揮著重要的作用[7-9]。
本發明的另一個目的是提供一種用于本發明的方法的細胞系。
本發明提供了一種篩選抑制新血管生成藥物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表達CD146蛋白的細胞篩選出具有CD146結合活性的生物分子；用天然表達CD146分子的細胞檢測上述的具有CD146結合活性的生物分子是否能夠抑制或激活這種細胞生長。
在本發明的方法中，所述的生物分子可以是配體、抗體分子或基因工程片段、多肽、或者免疫毒素；所述的表達CD146的細胞可以是293-EBNA細胞系，其保藏編號為CGMCC0642；所述的篩選具有CD146結合活性的生物分子可以是通過競爭性ELISA進行的。
本發明還提供了一種用于篩選抑制新血管生成藥物的表達CD146蛋白的293-EBNA細胞系。該細胞系已與2001年10月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中國，北京，中關村。保藏編號為CGMCC0642。
本發明的細胞系的制備方法如下首先把CD146全長基因插入到高效表達載體pCEP-Pu，構建一個含有CD146基因的重組質粒。將該質粒轉染宿主細胞系293-EBNA。在選擇培養基上篩選含有重組質粒的陽性克隆。由于CD146分子可表達于宿主細胞的細胞膜表面，因此該細胞可以用于篩選各種各樣與CD146結合的物質，并可以通過天然表達CD146分子的細胞檢測篩選出來的配體、抗體、多肽或蛋白毒素是否具有特異性的抑制或激活效應。
該模型的應用可示例于以下幾個方面1)通過競爭性結合篩選CD146靶向藥物。即使獲得的只是親和力較弱的分子，也可經進一步的結構研究對分子加以改進從而獲得親和力高的藥物。它的進一步鑒定與應用包括動物實驗甚至臨床實驗，均將與最初的篩選模型的效率息息相關。2)檢測篩選出的藥物是否具有阻斷或激活信號傳導的作用。在天然表達CD146分子的細胞中，加入篩選出的藥物分子(抗體，多肽，免疫毒素等)，若能抑制或激活信號轉導，必將導致細胞某些表型的改變，如生長率、細胞多態性、細胞集落形成、在軟瓊脂上的生長狀態、細胞的抗腫瘤活性、抗原的表達等方面，而其對照組細胞將不表現此類特征。3)該模型還提供了一種從抗血清中選擇抗體的方法。將合成的肽段免疫動物得到的抗血清經細胞模型進行篩選，獲得高親和力的抗體，進而研究其與CD146相互作用引發的生物學過程以及確定CD146的相關活性部位。若其具有潛在的藥物活性，可進行相關的毒理、藥理學測定。
本發明的應用價值在于(1)CD146偶聯物或CD146工程細胞可以作為疫苗，用于上述疾病的預防和治療，(2)CD146工程細胞可以作為一種藥物篩選分子模型，用于篩選各種各樣的配體、抗體、多肽或蛋白毒素，(3)CD146的天然配體可以是一種藥物和藥物靶向，用于血管生成相關疾病的預防、診斷和治療，而且可作為一種新型流產避孕藥物，用于人口控制。
我們研制得CD146特異性的單克隆抗體，首次發現抗體與CD146的相互作用可以導致以下結果(1)抑制血管內皮細胞增殖和遷移，(2)抑制血管生成，(3)引起腫瘤血管的萎縮和堵塞，抑制多種腫瘤的生長和轉移，其抑制率分別為平滑肌肉瘤50％，肝癌71.9％，胰腺癌48.7％。(4)通過抑制滋養層細胞，導致懷孕小鼠流產，說明CD146是胚胎發育早期的關鍵分子和特有標志物，對于胚胎發育和妊娠維持至關重要。我們的實驗結果證實CD146蛋白是一種新的血管標志分子，它參與血管生成、胚胎發育和腫瘤生長與轉移。
實施例一CD146藥物篩選細胞模型的建立1.CD146基因表達載體的構建從臍帶靜脈內皮提取總mRNA，通過反轉錄合成第一鏈cDNA。根據CD146的基因序列(P43121)設計含有限制酶切位點的5‘和3’端引物。以cDNA為模板，通過PGR反應擴增出CD146全長基因片段。通過雙酶切將其插入到高效表達載體pCEP-Pu(Eddie Kohfeldt，1996)的多克隆位點，使之與載體的開放閱讀框吻合。通過DNA瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物及重組質粒進行鑒定。酶切重組質粒結果顯示外源基因已被克隆至載體的多克隆位點。DNA序列分析證實重組質粒含有CD146基因。
2.CD146工程細胞系的構建及鑒定制備293-EBNA感受態細胞，通過磷酸鈣沉淀法將構建好的含有CD146基因的表達載體pCEP-Pu導入宿主細胞系293-EBNA(Invitrogen，CatNo.R620-07)。轉染的細胞在含有Puromycin和G418的選擇培養基中培養，挑取細胞集落，繼續在選擇培養基上擴大培養一周后凍存工程細胞。
在基因和蛋白水平鑒定CD146分子在293-EBNA細胞系中的表達。首先，用PCR方法確定CD146基因是否存在于293-EBNA細胞中。收集并裂解細胞，加入PCR反應體系和引物，PCR擴增結果顯示，轉染CD146基因的293-EBNA細胞出現一條約2000bp的基因條帶，而未轉染的293-EBNA細胞沒有任何PCR產物出現。說明CD146基因存在于293-EBNA細胞中。該細胞系已與2001年10月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中國，北京，中關村。保藏編號為CGMCC0642。
進一步鑒定CD146基因是否在293-EBNA細胞系中表達。我們向細胞培養液中加入細胞裂解緩沖液，刮下細胞后離心，用SDS-PAGE及Westernblotting方法鑒定CD146分子的表達情況，結果顯示293-EBNA細胞中表達的CD146分子可被CD146特異性抗體識別。
實施例二采用流式細胞儀(FACS)分析CD146結合物方法如下將106工程細胞懸浮于100μl含10μg/mlCD146特異性抗體的的培養基中，孵育1h，經培養基洗三次，加入FITC-羊抗鼠IgG，孵育45分鐘，洗三遍后，將細胞重新懸浮在200μl-500μl PBS中，在FACS上進行免疫熒光分析并測定平均熒光密度。FACS分析顯示，所構建的細胞能在其表面表達CD146分子，并與抗體發生特異性的結合。說明構建的細胞所表達的CD146分子較好的維持了其天然構象。
實施例三CD146分子細胞模型篩選特異性抗體1.ELISA法篩選與CD146特異結合的抗體ELISA方法可以用于篩選與CD146-293-EBNA細胞結合的物質，如抗體。方法如下以每孔105細胞接種96孔細胞培養板，待細胞80％鋪滿培養孔時，用甲醇固定細胞，2％BSA封閉2h，加入待檢測的抗體樣品(雜交瘤上清、可溶性抗體分子片段)，相應的細胞培養基或緩沖液為陰性對照，37℃孵育2h，PBS洗3次，加入AP標記的羊抗鼠κ，37℃孵育1h，以PNPP為底物顯色。酶標儀讀數。根據顯色反應的結果，初步篩選出反應信號強的樣品，進行Western blot鑒定。
2.利用抗體庫及肽庫篩選CD146分子的特異性抗體及結合肽以105細胞/孔接種96孔細胞培養板，37℃培養過夜，4％多聚甲醛固定，2％BSA封閉2h，每孔加入100μl 1010噬菌體抗體庫或肽庫(溶于0.5％BSA)，37℃孵育2h，PBST及PBS各洗10次，再以100μl 0.1MpH11.6三乙胺洗脫，收集洗脫液，以不同比例稀釋后感染宿主菌，涂LB平板。陽性克隆經擴大培養后離心取上清進行下一輪篩選。
經數輪篩選后獲得的克隆通過ELISA競爭抑制實驗一步鑒定。
將細胞以105細胞/孔接種于細胞培養板，37℃培養2h，4％多聚甲醛固定，2％BSA封閉2h，加入待檢克隆上清及可溶性CD146分子，孵育2h，經PBST及PBS洗滌，加入HRP或AP標記的二抗，孵育1h后加入底物顯色，酶標儀讀數。與CD146特異結合的噬菌體抗體孔將呈現出弱顯色反應。
經以上步驟確認有特異結合活性的噬菌體抗體重新轉化宿主菌，制備成質粒DNA，將重、輕鏈克隆于通用載體，利用通用引物測序。
實施例四檢測CD146細胞模型篩選藥物的激活或抑制效應1.MTT法檢測CD146細胞模型篩選藥物的激活或抑制效應。
以天然表達CD146分子的內皮細胞為對象，采用MTT法檢測CD146細胞模型篩選藥物的激活或抑制效應。方法如下取新生血管內皮細胞進行培養，在對數生長期，胰酶消化并計數，以每孔3000個細胞接種于96孔板。24小時后加入不同濃度篩選出的藥物，繼續培養24-72小時。棄上清，每孔加入0.1mg/0.1ml的MTT，繼續培養4小時后加150μl DMSO振蕩，于560nm測OD值并計算存活率。空白對照為不加細胞孔。陰性對照為不加藥物組。根據細胞的存活率分析藥物對細胞的影響，判斷該藥物是內皮細胞的激活劑還是抑制劑。
2.[3H]摻入法測定藥物對內皮細胞生長的作用。
方法如下取旺盛生長的內皮細胞，胰酶消化后以3000個細胞每孔接種96孔板，加入含10％FCS的DMEM培養基，孵育2h，棄培養液，加入無血清培養基過夜，次日加入不同量的藥物，孵育48h。然后加入[3H]標記胸腺嘧啶，溫育4h，收集細胞，經液閃儀測定，分析藥物對細胞生長的作用。
3.檢測藥物對滋養層細胞黏附的影響方法如下分離培養原代天然表達CD146分子的滋養層細胞。用胞外基質蛋白鋪96孔板，室溫過夜。，以每孔約1×105個細胞接種，將不同濃度篩選出的藥物到滋養層細胞中，孵育2h。用PBS洗去沒黏附的細胞，黏附的細胞用4％多聚甲醛固定15分鐘，再用PBS洗，然后用2％Giemsa染色30分鐘，洗滌，甲醇固定，用酶標儀在630nm波長處測定O.D.值。陰性對照為不加藥物組。根據O.D.值的比較，判斷該藥物是滋養層細胞黏附的激活劑還是抑制劑。
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權利要求
1.一種篩選抑制新血管生成藥物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表達CD146蛋白的細胞篩選出具有CD146結合活性的生物分子；用天然表達CD146分子的細胞檢測上述的具有CD146結合活性的生物分子是否能夠抑制或激活這種細胞生長。
2.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的生物分子是配體、抗體分子或基因工程片段、多肽、或者免疫毒素。
3.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的表達CD146的細胞是293-EBNA細胞系，其保藏編號為CGMCC 0642。
4.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的篩選具有CD146結合活性的生物分子是通過競爭性ELISA進行的。
5.一種用于篩選抑制新血管生成藥物的表達CD146蛋白的293-EBNA細胞系，其保藏編號為CGMCC 0642。
全文摘要
本發明提供了一種篩選抑制新血管生成藥物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表達CD146蛋白的細胞篩選具有CD146結合活性的生物分子；用天然表達CD146分子的細胞檢測上述的具有CD146結合活性的生物分子是否能夠抑制或激活這種細胞生長。用本發明篩選出的藥物不僅可應用于血管生成相關疾病的預防、診斷和治療，而且可作為一種新型流產避孕藥物，用于人口控制。
文檔編號G01N33/15GK1410772SQ0113609
公開日2003年4月16日 申請日期2001年10月8日 優先權日2001年10月8日
發明者閻錫蘊, 林蕓, 劉琴 申請人:中國科學院微生物研究所