艾滋病病毒快速檢測試紙及其制備方法

專利名稱：艾滋病病毒快速檢測試紙及其制備方法
技術領域：
本發明涉及病毒檢測方法，特別是一種艾滋病病毒(人類免疫缺陷病毒)快速檢測試紙及其制備方法。
在中國，由于許多地區和高危人群對艾滋病的認識和防范意識不強，導致艾滋病病毒感染人群已經在一些地區迅速蔓延。中國艾滋病的傳播已經從特殊人群向一般人群擴散，經性傳播途徑傳播的病例正在持續增加。據2000年最新的統計報告表明，中國的艾滋病病毒總感染人數已達86萬人，并以每年30％的速度增長，若不采取有效預防措施。艾滋病毒感染者和艾滋病病人將以更快速度增加，預計到2010年將超過1000萬人，因而如何在預防和檢測艾滋病病毒(HIV)方面做好工作，不僅政府和衛生防疫部門應加大力度，而且在檢測和控制艾滋病病毒(HIV)的技術方面也應加快我們的研究步伐。
在艾滋病病毒檢測方面，目前公開文獻報道和實際使用的主要有三種方法(一)酶聯免疫法(ELISA法)；(二)免疫印跡法(WB法)；(三)快速測試法。
以上三種方法的測試原理都是利用“抗原——抗體”反應來檢查測試者血液或體液中是否含有抗艾滋病病毒(HIV)的抗體。
其中，酶聯免疫法和免疫印跡法是利用“抗原——抗體”所標記的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶的活力來測定“抗原——抗體復合物”，判斷測試者血液或體液中是否含有抗艾滋病病毒(HIV)的抗體，因而這兩種方法檢測較準確和靈敏。但這兩種檢測方法操作復雜，專業性強，檢查時需到專門的機構由專業人員進行操作，檢測耗時長，而且檢測試劑需要在特殊條件下保存，不利于在全社會推廣使用。
第三種方法是通過“抗原——抗體復合物”由其所結合的“膠體金或硒”的濃度高低來區分，因而靈敏度比第一、第二兩種方法稍偏低，但第三種方法由于檢測時不需要任何儀器設備，檢測時間較短(需30分鐘左右)，檢測成本較低，因此快速測定法已經變得越來越流行。此外，以上三種艾滋病病毒(HIV)檢測方法中，完整的或部分重組的艾滋病病毒(HIV)結構蛋白都可以用來作為抗原，但現有技術都存在著檢測試劑需要特殊條件保存、未經過培訓學習的普通醫務人員不能掌握操作技能的缺點，以及不能適應大規模體檢、供采血、乃至根據需要由受試者自己在家中依據產品使用說明書的指導、自己進行檢測的要求。由于艾滋病的特殊社會原因，以及艾滋病病人和艾滋病病毒(HIV)感染者所擁有的特殊的心理狀態，導致其中的絕大部分人不愿意到專業機構中去做艾滋病病毒(HIV)的檢測。這就必將導致目前使用的艾滋病病毒(HIV)檢(監)測方法，無法對社會中的艾滋病流行狀況及艾滋病病毒(HIV)的感染情況做出真正準確的報告，同時也無法真正監控艾滋病的流行趨勢。因此，這就使得在日常生活中，在我們身邊隨時都可能出現艾滋病病人或艾滋病病毒(HIV)感染者的現象成為可能。
本發明人經過比較和分析100多種艾滋病病毒的基因序列，最后設計了6種多肽抗原，這6種多肽抗原本通過人工合成之后，以單一或數種多肽以不同的組合混合后為特異性抗原(原快速測定法中是以蛋白為抗原)經過溶解后，噴涂到試紙基質上，經過干燥后與噴有膠體金的試紙按一定的要求粘貼在一起，再經過切割、包裝后，做成艾滋病的快速檢測試紙。
以“特異性多肽”為抗原在快速測定法中具有很大的優勢，特異性多肽抗原的優點在于其易于合成，檢測重復性好，穩定性高，用其制成的檢測試劑可以在室溫中長期運輸和保存(至少1年以上)。而且檢測的靈敏度可以通過增加所摻入的抗原(多肽)的劑量來提高。因此，本發明所公布的“多肽抗原艾滋病病毒(HIV)檢測試紙快速測定法”，是目前正在使用的檢測艾滋病病毒(HIV)的方法所無法比擬和替代的。具備了操作方便、簡潔、快速、準確度高、重復性好的特點，并且已經在美國經過小規模臨床試驗，取得了成功。
本發明中所應用的數種多肽抗原物質是通過分析和比較全世界的100多種艾滋病病毒株的基因組序列后并結合在中國流行的艾滋病病毒(HIV)株中分離的基因序列，最后綜合研究的成果。目前通過測試15例已知的HIV-1/2型患者的標準血樣，準確率達100％。最重要的是，這些多肽抗原對中國流行的病毒株產生的抗體更為靈敏和特異，因此檢測的準確率更高。
本檢測試紙使用的多肽類物質主要包括以下幾種1、多肽A——其序列來源于蛋白質gp36 (國際標準命名)2、多肽B——其序列來源于蛋白質gp41 (國際標準命名)3、多肽C——其序列來源于蛋白質gp120(國際標準命名)4、多肽D——其序列來源于蛋白質p24 (國際標準命名)5、多肽E——其序列來源于蛋白質P55 (國際標準命名)6、多肽F——其序列來源序列于蛋白質P17 (國際標準命名)上述六種多肽物質可以用各種不同氨基酸經過化學合成的方法得到，也可以利用重組DNA技術制備得到。
以下是本發明“艾滋病病毒(HIV)檢測試紙”的制備方法一、配料選擇上述多肽中的一種或若干種混合，用生理鹽水稀釋到0.5-10mg/ml的濃度，使其充分溶解或混勻，靜置3-6小時，最好4-5小時，過濾，置無菌室(箱)中待用。稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％。二、噴涂用上述配好的多肽溶液均勻、準確地呈線狀噴涂到試紙基質上，噴后烘干，溫度為10℃-80℃，最好30℃-50℃，然后噴涂多次，每噴一次都要烘干，噴涂的多肽溶液為特異性多肽的單一溶液或混合溶液。三、制備膠體金試紙片當特異的抗體結合蛋白被膠體金標記后，可以用它們浸泡玻璃纖維試紙。浸泡后的試紙片經干燥后備用。四、粘貼將噴涂了溶液并干燥后的試紙基質一側粘上干燥過的膠體金試紙，在另一側粘上用于吸水的厚層濾紙片，并保證多肽抗原線條的位置位于塑料外殼的觀察窗口中。五、切割包裝將上述粘合好的試紙按規格切割，然后用塑料殼封裝或安放到保護盒中密封保存，得到產品。六、外包裝將包裝好的檢測試紙條與彈簧針、毛細管、消毒巾、包扎帶、稀釋液、廢棄物收集袋等，組合在一起裝入外包裝盒內，使其形成一個完整的，可以家庭化使用的最終產品。本發明的工作原理當艾滋病病毒侵入人體后，在1-2周內病毒大量復制，此時的病人的癥狀與感冒十分相似(渾身無力、發燒、出現紅色皰疹)，一般在病毒侵入人體后3-4周，人體會產生相應的抗體，此時就是所謂的“血清陽性”期，我們的快速艾滋病病毒檢測試紙，就是通過檢測病人體內產生的抗艾滋病病毒抗體，來檢定受檢者是否是陽性或陰性。
對受試者取血樣(可以用血清、血漿或全血)，加到HIV快速檢測試紙的點樣孔內，當樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解固化在結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原(或抗體)的區域時，待測物和金標試劑的復合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，通過可自測的膠體金標記物得到直觀的顯色結果，而流離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。本發明與已有技術相比，其突出的實質性特點和顯著的進步是1、檢測迅速從被試者取出血樣或體液，到用試紙檢測獲得檢測結果，期間只需3-5分鐘便可。
2、檢測準確率高、靈敏度高檢測靈敏度和特異性靈敏度達到99％以上，比現有技術的快速檢測法的準確率和靈敏度大大提高。
3、改變了原先要到專業機構并且必須經專業人員檢測才能得到結果的傳統檢測方式，使用者可以在產品使用說明書的指導下，自己進行檢測，并且不影響檢測結果的可靠性。因此可以最大限度地保護受試者的隱私權，并且可以解決人們在進行艾滋病病毒(HIV)檢測時所帶來的敏感的社會問題和沉重的心理壓力的問題。所以本發明的產品能夠在大范圍內的推廣使用成為可能，能夠在社會各個領域全面進行艾滋病疫情的監測，為預防艾滋病的監控體系的建立起到了重要的不可替代的作用。如臨床采、供血，出入境人員、入學、參軍、婚檢、手術病人手術前的檢測、高危人群的自我監測等都可進行快速而準確的測定。
4、操作方法簡單普通醫務人員只需在使用說明書的指導下，即可學會操作，還可適合艾滋病患者或HIV感染者以及高危人群的個體自我檢測，達到有目的的預防、控制和保護作用。同時其操作簡便和可以家庭化使用的特點，可以使其監測的范圍更大、更廣，自我保護的功能更強，這樣就可以為控制艾滋病的迅速蔓延起到更為積極的作用，并可為科學家研制出有效的治療艾滋病的藥物贏得更加寶貴的時間。
5、本項發明的“艾滋病病毒快速檢測試紙”的制作工藝簡單，成本低。用普通氨基酸進行人工合成或用DNA重組技術可以得到多種特異性的多肽抗原物質。整個檢測費用只是酶聯免疫法(ELISA)或免疫印跡法(WB)的1/5或1/10。較低的檢測費用，使產品的普及使用成為可能。
6、試紙不需要在低溫或特殊條件下保存，在0℃-40℃，特別在4℃-37℃的條件下只要不曝曬或受潮，有效期可達1.5年，并且檢測的靈敏度和特異性靈敏度及準確率均不會發生變化，而且檢測的重復性好。
7、抗干擾能力強本發明所使用的特異性多肽抗原具有很強的選擇性。在檢測過程中，它可以排除流感、乙肝、丙肝等多種人類常見的病毒性感染疾病和一些細菌性感染疾病、以及一些常見的過敏性疾病在人體血液內形成的抗體對檢測結果的干擾，因此，靈敏度極高，特異性極強。
試紙制作實施例二按照多肽B和多肽C中的氨基酸排序的要求，以亮氨酸、絲氨酸等氨基酸為原料，在特定的條件和設備內，經人工合成，分別得到多肽B、多肽C，經分離、純化后備用。將上述兩種物質按一定比例用生理鹽水配成0.5-10mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾備用。將多肽B、多肽C的混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，在30-50℃烘箱烘干，然后與已噴涂了膠體金的試紙基質按一定的要求粘貼好，并按一定的規格剪切，包裝得到產品。
試紙制作實施例三按照多肽A和多肽D中的氨基酸排序的要求，以L-賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸為原料，在特定的條件和中，經人工合成，分別合成出多肽A和多肽D，并經分離純化后備用。
將多肽A和多肽D按一定的比例混合后用生理鹽水稀釋成0.5-10mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾備用。將多肽A、多肽D的混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，在30-60℃烘干，再與已經噴有膠體金的試紙基質按一定的要求粘貼在一起，按一定的規格切割成條狀，包裝得到產品。
試紙制作實施例四用實施例一的多肽物質A、實施例二的多肽物質B和多肽物質C、實施例三的多肽物質D，用生理鹽水分別配成0.5-10mg/ml的濃度，靜置3-6小時，過濾，備用。
在預先準備好的試紙基質上先噴涂多肽物質A，烘干，再依次噴涂多肽物質B、C、D，每次噴涂后均烘干，最后將噴涂了多肽的試紙基質與已預先噴好膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼好，按一定規格剪切，包裝得到產品。
試紙制作實施例五將實施例四的四種多肽物質按均等的重量混合，用生理鹽水溶解成1.5-30mg/ml的濃度，靜置3-6小時，過濾，備用。
將上述配好的混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，烘干，然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例六按照多肽A、B、E、F的中的氨基酸排序的要求，以相應的單體氨基酸為原料，在特定的條件和設備內，經過人工合成，分別得到的多肽A、B、E、F，并經分離純化后備用。
將多肽A、B、E、F分別用生理鹽水配成0.5-10mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。在預先準備好的試紙基質上分別依次噴上多肽A、B、E、F的溶液，每次噴涂后均烘干然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例七用試紙制作實施例六的多肽A、B、E、F，按等量配比混勻，用生理鹽水配成1-30mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。
將上述多肽混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，烘干，然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例八按照多肽C、D、E、F的中的氨基酸排序的要求，以相應的單體氨基酸為原料，在特定的條件和設備內，經過人工合成，分別得到的多肽C、D、E、F，并經分離純化后備用。
將多肽C、D、E、F分別用生理鹽水配成0.5-10mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。在預先準備好的試紙基質上分別依次噴上多肽C、D、E、F的溶液，每次噴涂后均烘干然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例九用試紙制作實施例八的多肽C、D、E、F，按等量配比混勻，用生理鹽水配成1-30mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。
將上述多肽混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，烘干，然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例十按照多肽E、F的中的氨基酸排序的要求，以相應的單體氨基酸為原料，在特定的條件和設備內，經過人工合成，分別得到的多肽E、F，并經分離純化后備用。
將多肽E、F分別用生理鹽水配成0.5-10mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。在預先準備好的試紙基質上分別依此噴上多肽E、F的溶液，每次噴涂后均烘干然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例十一用試紙制作實施例十的多肽E、F，按等量配比混勻，用生理鹽水配成0.5-20mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。
試紙制作實施例十二按照多肽A、B、E、F的中的氨基酸排序的要求，以相應的單體氨基酸為原料，在特定的條件和設備內，經過人工合成，分別得到的多肽A、B、E、F，并經分離純化后備用。
將多肽A、B、E、F分別用生理鹽水配成0.5-10mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。在預先準備好的試紙基質上分別依此噴上多肽A、B、E、F的溶液，每次噴涂后均烘干然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例十三用試紙制作實施例十二的多肽E、F，按等量配比混勻，用生理鹽水配成0.5-20mg/ml的濃度(稀釋的濃度數據可以加或減變化2.5％)，靜置3-6小時，過濾，備用。
將上述多肽混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，烘干，然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
試紙制作實施例十四將多肽A的基因序列克隆到細菌表達載體中，然后將該工程菌接種到培養基上，再經過蛋白純化即可得到重組的多肽A抗原。多肽B、C、D、E、F分別按照其特定的基因序列參照上述多肽A的制備方法分別制備得到。
用經過DNA重組技術得到的多肽A、B、C、D、E、F抗原按照實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、實施例5、實施例6、實施例7、實施例8、實施例9、實施例10、實施例11、實施例12、實施例13的方法分別制備得到本發明的產品。
將上述多肽混合溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，烘干，然后與噴有膠體金的試紙基質，按一定的要求粘貼在一起，經按一定的規格要求切割、包裝后得到產品。
將以上實施例制備的艾滋病病毒HIV1/2快速檢測試紙做成整體包裝盒，整體包裝盒中配置了“彈簧針”、“點樣管”、“稀釋液”、“消毒巾”、“包扎帶”、“廢棄袋”等六件特殊的裝備，這些裝備保證了本發明所公布的產品可以使受試者，在產品使用說明書的指導下，自己進行“家庭化”的檢測操作，不再需要到特定的專業機構去找專業的人員進行檢測操作，并且不影響檢測結果的準確性。本發明試紙的試驗效果用上述各方法制得的各種試紙通過測試15例已知的HIV-1和HIV-2患者的標準血樣，每次測試3-5分鐘，準確率達到100％，同時測試無病毒的血樣或血清，準確率也達到100％，并最后均用酶聯免疫法(ELISA)和免疫印跡法(WB)進行復核、驗證。
權利要求
1.一種艾滋病病毒快速檢測試紙，其特征是由噴涂過特異性多肽物質的試紙基質和噴涂有膠體金的試紙基質粘合而成，所述的特異性多肽物質包括多肽物質A、其序列來源于蛋白質gp 36(國際標準命名)；多肽物質B、其序列來源于蛋白質gp41(國際標準命名)；多肽物質C、其序列來源于蛋白質gp120(國際標準命名)；多肽物質D、其序列來源于蛋白質p24(國際標準命名)；多肽物質E、其序列來源于蛋白質P55(國際標準命名)；多肽物質F、其序列來源于蛋白質P17(國際標準命名)的其中一種或數種的混合物。
2.根據權利要求1所述的艾滋病病毒快速檢測試紙，其特征是多肽物質A、B、C、D、E、F是由單體氨基酸經過人工合成或DNA重組技術得到。
3.一種權利要求1所述的艾滋病快速檢測試紙的制備方法，其特征是先將一種或多種多肽物質用生理鹽水配制成0.5-10mg/ml的濃度的溶液，靜置3-6小時，過濾，備用，將配制好的多肽溶液噴涂到預先準備好的試紙基質上，在10℃-80℃條件下烘干，將烘干的噴有多肽物質的試紙基質與噴有膠體金的試紙基質粘貼在一起，然后剪切，密封包裝得到產品。
4.一種權利要求1所述的艾滋病快速檢測試紙的檢測方法，其特征是將制備的艾滋病病毒快速檢測試紙做成整體包裝盒，整體包裝盒包括彈簧針、點樣管、稀釋液、消毒巾、包扎帶、廢棄袋，使用時受試者取血樣(可以用血清、血漿或全血)，加到快速檢測試紙的點樣孔內，通過可反應的膠體金標記物得到直觀的顯色結果。
全文摘要
本發明闡述了一種快速、準確檢測艾滋病病毒的試紙及這種試紙的制備方法,它以一種或多種多肽物質按配比為抗原噴涂到試紙基質上經干燥后,再與噴有膠體金的試紙基質粘貼、剪切、包裝后得到,用這種試紙檢測艾滋病病毒HIV1/2只需3－5分鐘,準確率高,抗干擾性強,檢測靈敏度和特異性靈敏度均達到99%以上,而且制備工藝簡單,檢測操作方便易掌握,生產成本低,檢測費用少,不僅適合專業檢測機構使用,也適合例行體檢、采/供血、疫情檢測、醫療臨床等場合使用,尤其能使受試者個人在產品使用說明書的指導下進行“家庭化”的自我檢測應用。
文檔編號G01N33/569GK1353314SQ01135100
公開日2002年6月12日 申請日期2001年12月6日 優先權日2001年12月6日
發明者菲力普·許, 麥克·威, 潘勇 申請人:北海新升技術開發有限責任公司