專利名稱：基于自身抗體譜抗原微陣列的制作方法
技術領域：
本發明是一種生物技術微陣列的制作方法，尤其是一種基于自身抗體譜抗原微陣列的制作方法。
背景技術：
生物芯片是通過平面微細加工與生物分子的自組裝技術相結合，在一微小玻片上組裝成數目眾多的不同生物分子微陣列，以實現對目標DNA或蛋白質分子信息的大規模檢測。這種技術被認為是生命科學研究中的高效工具，因而成為目前國內外科學技術發展的熱點。
蛋白質免疫檢測型芯片有別于一般的DNA芯片檢測技術，其原理主要是基于抗原與抗體的特異結合反應來設計的，所測的目的分子僅有結構上的專一性，而無序列特異性。目前有關自身抗體的檢測方法有膠體金免疫滲濾技術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和放射免疫分析(RIA)等，前者由于方法敏感性欠佳，后者則存在有同位素污染和不穩定等特點，使用中總難令人滿意，而目前臨床實驗室廣泛應用的ELISA技術，其方法重復性又容易受多種測定因素的干擾，且上述方法僅適用于對單個項目的測定(即一種實驗每次只能檢測1種自身抗體)，為此有必要尋找一種敏感、穩定的高通量的檢測方法。
德國Max planck分子遺傳學研究院的Angelika Lueking等領導的研究小組于1999年報道了用于基因表達與抗體篩選的蛋白質分子微陣列，他們用92個人cDNA克隆表達所得的細菌溶胞物作為抗原，用機械手臂方法將蛋白點至PVDF膜上制成抗原微陣列，用該法可檢出10pg的蛋白質(陣列點間距為4.5mm，點直徑為250μm)，而后用單克隆抗體來見鑒定蛋白表達產物(詳見Analytical Biochemistry.1999；270103-11)，同年美國的Mendoza LG.等則在聚苯乙烯反應板上制作了“基于酶聯免疫吸附實驗的抗原微陣列(144點/孔)，采用標準的ELISA方法進行檢測(見Biotechniques.1999；27(4).778-788)。這種基于蛋白質微陣列的制作技術，對于實現抗原與抗體乃至配體與受體的高通量檢測進行了有益的嘗試。但對于一些小分子半抗原(如磷脂)、重組多肽、DNA及大分子蛋白等同時組裝于同一固相載體(如載玻片)，則還有許多需要進一步改進和完善的工作要做。
發明內容
本發明的目的就是提供一種用凝膠粘結層與分子組裝技術相結合，使固相后的抗原分子仍保持原有的空間構型，從而達到確保后續自身抗體檢測結果真實性的基于自身抗體譜抗原微陣列的制作方法。
本發明制作的方法為①基片的預處理將擬選擇的固相載體表面進行清潔度和平整度的處理，使基片表面趨向單一的特性，以適應分子自組裝；②基片表面瓊脂糖凝膠粘結層的制作與化學修飾；在基片表面形成一層有序的雙功能分子薄膜即瓊脂糖凝膠分子層，使雙功能分子一端通過共價鍵與基片表面牢固結合，另一端與待組裝的抗原分子偶聯；③抗原微陣列設計每種抗原點制4個點，點直徑為0.1mm～0.5mm，點間距為0.5mm～1.0mm，陣列的四角為自身抗體陽性與陰性控制點，中間為點制的已知自身抗原微陣列；④制作抗原微陣列通過點樣設備將不同的生物大分子抗原點至上述修飾后的基片表面，制作的抗原分子可與雙功能分子層的外延端發生化學或物理的鍵合，制成所需芯片；⑤對芯片信號進行檢測，用顯微鏡或熒光掃描采集樣本信息。
檢測的方法是將制作好的抗原微陣列芯片與被測樣本溫育后，再用三種不同熒光素標記的第二抗體探針進行雜交，采用多通道熒光掃描采集樣本信息，用以確定自身抗體的不同免疫球蛋白類型。檢測用的三種熒光素分別用FIFC、TRITC和AMCA標記羊抗人IgG、IgA和IgM抗體分子。
本發明的優點在于1.采用凝膠粘結層分子組裝技術使固相后的抗原分子仍保持原有的空間構型，從而達到確保后續檢測結果真實性。
2.實用性強，具有技術設計合理、實驗流程清晰和實施便利等特點，有較強的實用和產業開發價值。應用此種模式還可擴展到其他的實驗診斷領域，如傳染病、腫瘤標志物與小分子激素等的測定(基于抗原/或抗體的微陣列)。
3.我們制作的抗原微陣列包括有不同的生物大分子(如磷脂、重組多肽、DNA和蛋白質等)，有別于一般的單純蛋白質/或DNA微陣列，抗原固相后(通過物理與化學的鍵合)仍保持原有的分子構型，而有利于與后續的抗體結合反應。
4.芯片信號采集可采用熒光顯微鏡鏡檢或通過熒光掃描儀作多通道的熒光掃描(3色熒光FITC、TRITC與AMCA)，可同時測定多種自身抗體的不同免疫球蛋白類型，亦可選用普通的光學顯微鏡觀察(信號顯示采用固相酶-底物/或免疫金銀染色)。
具體實施例方式
①基片(載玻片)的預處理達到適于分子組裝的要求(包括清潔要求，粗糙度要求等)。
②將潔凈的羥基化表面處理的載玻片，置于一定濃度的APTES(2％)丙酮溶液，浸泡適應時間后，取出依次用丙酮和乙醚漂洗，自然晾干后備用。
③基片表面再制作凝膠分子層(瓊脂糖)→NalO4氧化20min→蒸餾水洗滌30min→干燥后用一定濃度的GA制作醛基化表面，于烘箱中干燥備用。
④用點樣設備將不同的抗原分子(條件預先摸索)點至載玻片，點樣濃度100μg/ml，點樣量0.1μl，同時設抗人γ球蛋白與牛血清白蛋白(BSA)作為陽性與陰性控制點；37℃溫育4h后置4℃冰箱過夜；再用1.Omg/ml的BSA(含1％的甘氨酸)封閉37℃ 1h，PBS洗滌后晾干。
⑤分別加一定稀釋度的被檢樣本和標記的第二抗體探針，溫育條件均為37℃ 30min。(抗體標記物為HRP時，后繼反應則需加酶作用底物)。
⑥鏡檢或熒光掃描當標記抗體分子選用酶(HRP)或納米金(10nm)時，則可用普通光學顯微鏡觀察，結果以出現棕黃色或黑色斑點者為陽性；標記抗體為熒光素則采用熒光鏡檢(帶CCD攝像頭)或熒光掃描進行信號采集，結果以斑點出現熒光者為陽性反應有紅、綠、藍3種不同顏色的熒光，它們分別代表不同免疫球蛋白類別的自身抗體。
權利要求
1.一種基于自身抗體譜抗原微陣列的制作方法，其特征在于制作的方法為①基片的預處理將擬選擇的固相載體表面進行清潔度和平整度的處理，使基片表面趨向單一的特性，以適應分子自組裝；②基片表面瓊脂糖凝膠粘結層的制作與化學修飾；在基片表面形成一層有序的雙功能分子薄膜即瓊脂糖凝膠分子層，使雙功能分子一端通過共價鍵與基片表面牢固結合，另一端與待組裝的抗原分子偶聯；③抗原微陣列設計每種抗原點制4個點，點直徑為0.1mm～0.5mm，點間距為0.5mm～1.0mm，陣列的四角為自身抗體陽性與陰性控制點，中間為點制的已知自身抗原微陣列；④制作抗原微陣列通過點樣設備將不同的生物大分子抗原點至上述修飾后的基片表面，制作的抗原分子可與雙功能分子層的外延端發生化學或物理的鍵合，制成所需芯片；⑤對芯片信號進行檢測，用顯微鏡或熒光掃描采集樣本信息。
2.根據權利要求1所述的基于自身抗體譜抗原微陣列的制作方法，其特征在于檢測的方法是將制作好的抗原微陣列芯片與被測樣本溫育后，再用三種不同熒光素標記的第二抗體探針進行雜交，采用多通道熒光掃描采集樣本信息，用以確定自身抗體的不同免疫球蛋白類型。
3.根據權利要求1或2所述的基于自身抗體譜抗原微陣列的制作方法，其特征在于檢測用的三種熒光素分別用FIFC、TRITC和AMCA標記羊抗人IgG、IgA和IgM抗體分子。
全文摘要
基于自身抗體譜抗原微陣列的制作及檢測方法是一種生物技術中微陣列的制作及檢測方法,其制作方法為:①基片的預處理:以適應分子自組裝;②基片表面瓊脂糖凝膠粘結層的制作與化學修飾;在基片表面形成一層有序的雙功能分子薄膜即瓊脂糖凝膠分子層;③抗原微陣列設計:每種抗原點制4個點,陣列的四角為自身抗體陽性與陰性控制點,中間為點制的已知自身抗原微陣列;④制作抗原微陣列:通過點樣設備將不同的生物大分子抗原點至上述修飾后的基片表面,制成所需芯片;⑤對芯片信號進行檢測,用顯微鏡或熒光掃描采集樣本信息。檢測方法為:將制作好的抗原微陣列芯片與被測樣本溫育后,再用三種不同熒光素標記的第二抗體探針進行雜交,采用多通道熒光掃描采集樣本信息。
文檔編號G01N33/53GK1343887SQ0112707
公開日2002年4月10日 申請日期2001年8月7日 優先權日2001年8月7日
發明者虞偉, 顧寧, 武建國, 廖建輝, 張海黔 申請人:東南大學