專利名稱：轉基因棉花種子純度鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種轉基因農作物種子純度的鑒定方法，尤其是一種轉基因棉花種子純度鑒定方法，屬于農業科學技術領域。
背景技術：
轉基因抗蟲棉由于在遏制棉蟲為害、節省農本、降低勞動強度、減少因噴施農藥帶來的環境污染、促進農田微觀和宏觀環境改善等多方面的作用，越來越引起各國科研工作者的重視[1，2，3]。抗蟲棉是中國目前準予商品性生產的農作物之一。但在抗蟲棉推廣過程中缺乏快速有效的純度鑒定方法，抗蟲棉中混雜非抗蟲棉種子，將使抗性問題變得不可預測和控制。有研究表明[3]用不同齡期的棉鈴蟲在棉田內接蟲調查表明，棉鈴蟲3齡以上幼蟲有在棉株間轉株擴散的行為。如果在抗蟲棉中混有較多地非抗蟲棉種子，則非抗蟲棉株上的3齡以上幼蟲可轉移到附近的抗蟲棉株上，造成取食、存活和抗性淘汰篩選、會加速棉鈴蟲抗性發展速度；而通過保證田間抗蟲棉種子的純度，將有助于控制昆蟲抗性發展，保持品種的持續抗性。
關于轉基因棉花純度快速檢測方法，利用CAB Abstracts光盤(1984-2001年)、AGRIS光盤(1975-2000年)、AGRICOLA光盤(1970-2000年)，按關鍵詞“Purity”and“Transgenic Cotton”所做的計算機文獻檢索結果，尚未發現國外有此類相關研究的文獻報道。
在國內，李燕蛾等(1998)[4]報道一種效果較好的轉基因棉花純度快速測定方法，將轉基因棉花種子經H2O2表面消毒后，無菌水浸種24小時，種入含卡那霉素(濃度1g/L)的1/2MS種苗培養基，27±2℃培養4天，根據棉苗子葉是否出現黃斑或變為黃化苗，來確定該棉種的抗蟲性，依此來檢測轉基因棉花的純度。但該方法存在以下缺點①對試驗設施要求較高，需配制特定的組織培養基，無菌操作條件要求嚴格，難以實現農作物品種純度檢測所需的操作簡單、快速、高效、具有可普及性等基本目標，因此無法在農業生產中推廣應用；②祝建波等(2000)[5]利用李燕蛾報道的方法進行驗證性試驗，發現該方法會嚴重抑制轉基因棉苗胚根及根的生長，對棉苗的正常生長發育有不良影響。
另外，馬麗華等(2000)[6]、祝建波等(2000)[5]、周玉(2000)等[7]報道了轉Bt基因抗蟲棉采用卡那霉素涂葉的田間快速檢測方法，但這些方法僅可用于大田抗蟲棉品種的育種篩選或繁殖過程中的棉種抗蟲性基因的純化，不能直接用于轉基因抗蟲棉銷售過程中種子純度的快速鑒定。
發明內容
本發明的目的在于提出一種無需MS固體培養基、操作簡單的轉基因棉花種子純度鑒定方法，以解決目前抗蟲棉種產業化過程中急需解決的種子純度鑒定問題，為轉基因棉花種子的生產銷售和推廣應用創造良好條件。
目前，在農作物基因工程廣泛使用一種稱Npt-II的報告基因，它來源于細菌轉座子Tn5上的aphA2，該基因編碼氨基糖苷-3-磷酸轉移酶(aminnoglycoside-3’-phosphotransferase II)，又稱新霉素磷酸轉移酶(neomycin phosphotrans-frase II)，英文縮寫為Npt-II。該酶使氨基糖苷類抗生素(新霉素、卡那霉素、巴龍霉素等)磷酸化而失活。此類抗生素通過抑制原核生物(或真核生物的葉綠體與線粒體)蛋白質生物合成70S起始復合體的生成，并使fMet-tRNA從70S起始復合體上解離，從而阻礙原核生物的蛋白質生物合成。
此類抗生素對植物細胞毒性的機理是與植物細胞葉綠體中的核糖體30S亞基結合，影響70S起始復合體生成，干擾葉綠體的蛋白質生物合成，最終導致植物組織失綠乃至死亡。Npt-II的作用是使ATP分子上的γ-磷酸基轉移到抗生素分子上，影響抗生素與核糖體亞基的結合，從而使抗生素失活，不再對植物細胞具有毒性作用。
凡具有外源Npt-II基因的轉化植物，可以使植物細胞獲得對上述抗生素的抗性。因此用此類抗生素處理，凡具有Npt-II基因的棉籽出苗以后子葉為正常綠色；而沒有Npt-II基因的普通棉籽出苗以后，其子葉耳基部出現黃斑或擴展為子葉局部乃至整片子葉變黃。
依據上述研究結果，本發明的轉基因棉花種子純度鑒定方法包括以下步驟(1)配液用氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龍霉素等)配制(5-15)×106單位/L濃度的浸種水溶液，浸種液體的用量是種子重量的3-5倍；(2)浸種將被測種子加浸種液體后充分搖勻，浸潤于液體之中。浸種的時間為24小時左右，浸種溫度在25℃±2℃；(3)播種用淡水沙做為發芽床，沙的含水量以手捏成團、松開即散為度，在塑料盤中先鋪一層約3厘米厚的沙層，在沙層上播種棉籽，然后蓋一層1厘米的沙層，插上標簽，用透明的塑料袋封好；(4)出苗把塑料盤放在光線良好的環境中，保持出苗所需的濕度，日間溫度控制在25℃以上，夜間溫度不低于15℃；(5)考苗經過7天左右，待棉苗子葉完全平展后，對棉苗進行考察，數每個送檢樣品的總苗數與黃斑苗數，重復2次以上，求平均值，凡在子葉的耳基部出現黃斑，即判定為黃斑苗；(6)計算按以下算式計算抗蟲棉種子純度與黃斑率。1)抗蟲棉種子純度＝(總苗數-黃斑苗數)/總苗數×100％2)黃斑率＝黃斑苗數/總苗數×100％
上述方法突破了以MS固體培養基進行無菌育苗鑒定抗蟲棉純度的常規，利用一定濃度的氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龍霉素等)浸種，采用淡水沙做為發芽床，在發芽過程中不會出現種子因病菌感染造成霉變或因培養基組分造成爛根現象，試驗無需對棉種進行消毒，無需進行嚴格的無菌操作，可直接用自來水配制浸種液體。另外，在日間溫度25℃以上，夜間溫度不低于15℃，鑒定試驗也可直接在光線良好的室內進行，無需溫光種子發芽箱設備。
不難看出，本發明對試驗條件要求簡單，試驗所用試劑及物品價格低廉，特別適宜在農業領域推廣應用。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
1、本方法實施的具體步驟為(1)配液用獸用卡那霉素配制107單位/L濃度的浸種水溶液。浸種液體可直接用自來水(或蒸餾水)配制。浸種液體的用量是種子重量的4倍，(2)浸種被測樣品為硫酸脫絨的棉花種子。種子加浸種液體后充分搖勻，浸潤于液體之中。浸種的時間為24小時左右，浸種溫度在25℃±2℃。在浸種過程中罩塑料袋以防止水分蒸發。(3)播種用淡水沙做為發芽床，沙的含水量要適宜，以手捏成團、松開即散為度(含水量為8.3％±0.6％)。在每塑料盤中先鋪一層約3厘米厚的沙層，在沙層上播種100粒棉籽，然后蓋一層1厘米的沙層，插上標簽，用透明的塑料袋封好。(4)出苗保持發芽所需的濕度。把塑料盤放入種子溫光發芽箱中，發芽箱的溫度控制在27℃±2℃。照光可在種子頂土后進行。每個被測樣品重復4次，求平均值。(當日間溫度25℃以上、夜間溫度不低于15℃時，發芽試驗也可直接在光線良好的室內進行，無需溫光發芽箱設備。)(5)考苗經過7天左右，棉苗子葉完全平展，對棉苗進行考察，數每個送檢樣品的總苗數與黃斑苗數，求各重復的平均值。凡在子葉的耳基部出現黃斑，即判定為黃斑苗。(6)計算按以下算式計算抗蟲棉種子純度與黃斑率。1)抗蟲棉種子純度＝(總苗數-黃斑苗數)/總苗數×100％2)黃斑率＝黃斑苗數/總苗數×100％2、最宜卡那霉素浸種濃度的確定
非轉基因普通棉省1-省6，用分別5×106單位/L、107單位/L濃度的卡那霉素浸種24小時，試驗結果見表1。
表1 不同濃度卡那霉素浸種后棉苗情況
平均總苗數 平均黃斑苗數 平均黃斑率(％)
品種
5g/L 10g/L 5g/L 10g/L 5g/L10g/L
省1 676460 6389.55 98.44
省2 644762 4796.88 100
省3 544753 4698.15 97.87
省4 616061 60100 100
省5 736071 6097.26 100
省6 475147 51100 100
由表1可知，用5×106單位/L卡那霉素浸種，普通棉省1抗蟲性的黃斑率最低，為89％；省4、省6最高，達100％。說明普通棉不同品種對卡那霉素的敏感程度存在一定程度的差異，某些普通棉品種對卡那霉素具有一定耐性。
當浸種濃度達107單位/L時，省2、省4、省5及省6黃斑率均達100％，省1及省3也高達98％，6個普通棉品種的平均黃斑率達99.38％，表明在該濃度下可以消除可能由于某些品種本身對卡那霉素有一定耐性而造成對抗性鑒定結果的干擾，從而提供了關于不同品種是否具有抗卡那霉素基因的真實的抗性鑒定結果，尤其是該濃度對棉種出苗率沒有產生明顯的不良影響(表2中列出了9個不同棉種經卡那霉素浸種后的平均出苗率與清水浸種后的平均出苗率)。因此，確定把107單位/L卡那霉素濃度作為鑒定棉花品種是否具有抗卡那霉素基因比較合適的濃度。根據該濃度浸種后出現的黃斑率高低，可判斷一個品種是否是轉基因抗蟲棉或非轉基因普通棉。
由表2的鑒定結果可見，其中K068、凡8、R086為轉基因抗蟲棉；石遠321、寧早1號、泗168為非抗蟲的普通棉；寧雜210、寧雜209、寧雜205為轉基因抗蟲雜種棉。
表2、107單位/L卡那霉素對不同品種屬性鑒定結果3、幾個抗蟲棉品系(或雜交種)純度鑒定結果
用107單位/L濃度的卡那霉素浸種，各品種的黃斑率結果見表3。4個2000年參加抗蟲棉區試的品系，其中GK22的品種純度為100％，GK14為91.78％，蘇抗103為83.12％；但鹽抗1211的品種純度僅16.95％，說明該品種的抗蟲性已極度退化，或抗蟲基因發生了丟失。
抗蟲棉品系A065的品種純度很低，僅68.99％。雜交抗蟲棉寧雜210的品種純度為99.46％，寧雜209的品種純度為96.07％，寧雜202的品種純度為91.01％；雙價抗蟲棉SGK321的品種純度為98.52％；美國2個抗蟲棉32B、33B的品種純度均為100％。
表3 卡那霉素浸種法對棉花抗蟲性純度鑒定結果
為了保障品種的抗蟲性，防止棉種抗蟲性的退化，作為生產上推廣的抗蟲棉良種，其抗蟲性純度應在95％以上，黃斑率應控制在5％以內。育種家掌握的原種純度則不低于99％。4、品系黃斑率與抗蟲性的相關分析
隨機選擇2000年抗蟲棉區試中的5個品系，分析結果表明，黃斑率與抗蟲性指數具有顯著的負相關(R＝-0.9562*)，即品系的黃斑率愈高，其抗蟲性愈差；反之亦然。當品系的黃斑率在80％以上時，可以判斷該棉種基本上不再具有抗蟲性(見表4)，是一種不再具有商品價值退化的或摻雜的假抗蟲棉。
表4、黃斑率與抗蟲性相關分析注2000年江蘇省抗蟲棉區試的抗蟲性鑒定，依據室內接蟲和田間罩籠接蛾二種方法。為了方便數學分析，我們把抗性指標做如下數量化高抗-3；中抗-2；低抗-1；不抗-0。依據室內接蟲和田間罩籠接蛾二種方法，對苗期室內鑒定、蕾鈴期田間罩籠鑒定結果，按各品系的抗蟲性強弱進行數量定級，求得抗蟲性平均值，即抗蟲性指數。
除卡那霉素之外，采用其它氨基糖苷類抗生素，比如新霉素、巴龍霉素等，只要方法相同、浸種液的濃度適宜，也可以達到同樣的鑒定效果。有關實施情況不另一一舉例。參考文獻[1]Cousin YL，Lyon BR.Transformation of an Australian cottoncultivarprospects for cotton improvement through geneticsengineering.Aust.J Pl.Physiol.，1991，18(8)481-494[2]Benedict JH，et al.Behavior growth survival and plant injury byHeliothis viresences on transgenic Bt cotton..J Econ.Entomol.，1992，85589-593[3]賈士榮，郭三堆，安道昌.轉基因棉花.科學出版社.2001年版[4]李燕蛾等.轉基因棉花純度快速測定法.中國棉花，1998，25(8)14[5]祝建波等.轉基因棉花的田間篩選技術研究.棉花學報，2000，12(5)230-233[6]馬麗華等.轉Bt基因棉卡那霉素田間快速檢測法.中國棉花，2000，27(12)11-12[7]周玉等.轉基因抗蟲棉田間快速鑒定方法研究.山東農業科學，2000，(1)48-49
權利要求
1、一種轉基因棉花種子純度鑒定方法。其特征在于包括以下步驟(1)配液用氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龍霉素等)配制(5-15)×106單位/L濃度的浸種水溶液，浸種液體的用量是種子重量的3-5倍；(2)浸種將被測種子加浸種液體后充分搖勻，浸潤于液體之中。浸種的時間為24小時左右，浸種溫度在25℃±2℃；(3)播種用淡水沙做為發芽床，沙的含水量以手捏成團、松開即散為度，在塑料盤中先鋪一層約3厘米厚的沙層，在沙層上播種棉籽，然后蓋一層1厘米的沙層，插上標簽，用透明的塑料袋封好；(4)出苗把塑料盤放在光線良好的環境中，保持出苗所需的濕度，日間溫度控制在25℃以上，夜間溫度不低于15℃；(5)考苗經過7天左右，待棉苗子葉完全平展后，對棉苗進行考察，數每個送檢樣品的總苗數與黃斑苗數，重復2次以上，求平均值，凡在子葉的耳基部出現黃斑，即判定為黃斑苗；(6)計算按以下算式計算抗蟲棉種子純度與黃斑率1)抗蟲棉種子純度＝(總苗數-黃斑苗數)/總苗數×100％2)黃斑率＝黃斑苗數/總苗數×100％。
2、根據權利要求1所述的轉基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述氨基糖苷類抗生素為卡那霉素，濃度為107單位/L。
3、根據權利要求1所述的轉基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述氨基糖苷類抗生素也可以是新霉素、巴龍霉素。
4、根據權利要求1或2所述的轉基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述步驟(3)中淡水沙含水量為8.3％±0.6％。
5、根據權利要求1或2所述的轉基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述步驟(4)把塑料盤放入種子溫光發芽箱中，發芽箱的溫度控制在27℃±2℃。
全文摘要
本發明提供了一種轉基因棉花(包括雜交棉)種子純度鑒定方法，該方法通過用氨基糖苷類結構抗生素(卡那霉素等)配制合適濃度的浸種水溶液，將被測種子浸泡后，以不含鹽份的淡水沙為發芽床，播種后保持發芽所需的溫濕度；經過7天左右，棉苗子葉完全平展，對棉苗進行考察計數，按黃斑率鑒定出種子純度。本發明對試驗條件要求簡單，在發芽過程中不會出現種子因病菌感染造成霉變或因培養基組分造成爛根現象，試驗無需對棉種進行消毒，無需進行嚴格的無菌操作，可直接用自來水配制浸種液體，特別適宜在農業領域推廣應用。
文檔編號G01N33/00GK1394472SQ0111376
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月10日 優先權日2001年7月10日
發明者陳旭升, 狄佳春, 劉劍光, 許乃銀, 肖松華 申請人:江蘇省農業科學院經濟作物研究所