專利名稱：免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，特別涉及一種在醫學檢驗中應用的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒。
免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，其發展十分迅速，在生物醫學各研究領域，特別是在醫學檢驗中得到了日益廣泛的應用。膠體金已成為繼熒光素、放射同位素和酶之后，在免疫標記技術中較為常用的一種非放射性標劑。
膠體金是由氯金酸在還原劑如鞣酸、檸檬酸三鈉的作用下聚合形成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，它具有高電子密度、能與多種生物大分子結合的特點。免疫金標記技術主要利用了金顆粒的這一特征，在金標蛋白結合處于顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或紫紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。
由于膠體金檢測試劑盒與放免、酶標試劑盒相比，具有操作使用安全(無放免物的污染)、簡便(簡單操作一步完成)、適于單人份檢測(放免和酶標試劑盒不適于單人份或少量樣品檢測)和快速(10分鐘左右即可有結果)等優點，因此近幾年來金標診斷試劑盒正日益流行，在某些項目上已逐漸替代了放免、酶標試劑盒，如早早孕試劑條(HCG Test Strip)等。
免疫磁性粒子技術是近年來發展起來的新技術，多用于分離濃縮等試驗中。磁性粒子能與蛋白質以共價方式結合而不影響其活性，所以常用來捕獲特定蛋白或分離蛋白。其原理如下將某抗體標記磁性粒子，放入含目的抗原的溶液中，經充分混合反應后，形成抗原抗體磁性粒子混合物，使溶液通過一磁性柱，由于磁性粒子被吸附而使目的抗原截留下來。同時它又能用作定量檢測，可根據磁性強弱確定捕獲抗體或抗原量的多少。
目前，免疫膠體金技術在金標檢測試劑上運用具有下列缺點1.單純以顯色深淺來判斷結果的膠體金檢測條，只能作半定量而不能作定量檢測。
2.現有的金標快速診斷試劑盒一般對檢測樣本只能進行定性檢測，而無法進行定量檢測，故此種試劑盒只適用于普查篩選。
3.由于方法學的限制，只使用免疫膠體金技術建立的快速診斷試劑盒，其靈敏度較低。
4.對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，如使用此種技術建立的快速檢測試劑盒，由于靈敏度限制，會造成假陰性，因而檢出率較低。
本發明的目的是提供一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，將免疫膠體金技術和免疫磁性粒子技術同時運用到快速檢測試劑盒中，既能進行定性檢測同時又能做定量測定，省時省力，節約了成本。
本發明的技術方案如下一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，本雙標記技術將目的蛋白的抗體或抗原標記一磁性粒子，形成一磁珠，再以此磁珠去標記膠體金，使該抗體或抗原上同時帶有兩個標示物；然后以此雙標記了的抗體或抗原去結合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應抗體或抗原捕獲，形成一檢測帶；然后在肉眼對檢測帶進行初步定性或半定量檢測的基礎上，以磁性測定儀對該檢測帶進行定量檢測。
所形成的檢測帶是一可見或不可見的T帶，可見T帶為樣本中有目的蛋白并且濃度很高使檢測帶上積聚的膠體金能為肉眼所見，不可見T帶為樣本中無目的蛋白或者濃度很低使檢測帶上積聚的膠體金不能被肉眼看見。
所述磁珠的制備是選用顆粒直徑為50nm的磁性粒子，將其標記到目的抗體或抗原相應的抗原或抗體上，成為一磁珠。
所述膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
所述磁珠的膠體金標記和固相化是將膠體金標記到磁珠上，再以百德(Bio-Dot)儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
分別將檢測目的物相應的另一個抗體或抗原以百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到硝酸纖維素膜上形成檢測帶即T帶，同時將二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對照線，以中性蛋白封閉，干燥。
本發明使用磁性粒子和免疫膠體金雙標記技術建立診斷試劑盒，既能進行定性檢測同時又能做定量測定。運用本發明技術建立的試劑盒與同類定量試劑盒相比，操作簡單方便，省時省力，節約了成本。在檢測靈敏度要求較低的樣本時，可先根據試條有無顯色篩去陰性結果，再對結果為陽性的試條作進一步定量測定，免去了對所有標本都作定量測定的煩瑣。
由于磁力檢測儀對磁性粒子的檢測很靈敏，所以運用本發明技術建立的試劑盒具有靈敏度高的優點，尤其能檢測出濃度較低的目的蛋白。
使用本發明技術生產的檢測板或檢測條在檢測時，可先根據T帶的顯色與否，以肉眼判斷結果的陰陽性。接下來，根據需要以磁性測定儀對檢測板或檢測條作定量分析。在檢測需高靈敏度的項目時，可對顯色反應為陰性的試條作進一步分析，以避免可能的漏檢。
使用本發明技術生產的檢測板或檢測條，具有高靈敏度和高檢測率的特點。該檢測板或檢測條能用于一項多檢的快速檢測試劑盒；能檢測全血、血清、血漿、唾液、尿液等樣本；能用于疾病診斷、毒品檢出、細菌檢出等目的蛋白的檢測或分離。
使用本發明技術制作的檢測板或檢測條可以使用雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、間接法。
下面結合附圖對本發明作詳細說明。
圖1是本發明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記示意圖。
圖2是本發明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒在運用產品為陽性情況a時的外觀圖。
圖3是本發明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒在運用產品為陽性情況b時的外觀圖。
圖4是本發明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒在運用產品為陰性情況時的外觀圖。
圖5是本發明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒在運用于一檢多項的產品外觀圖。
圖6是本發明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒運用檢測原理圖。
參看圖1至圖6，本發明的一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒采用本雙標記技術，將目的蛋白的抗體或抗原標記一磁性粒子，形成一磁珠，再以此磁珠去標記膠體金，使該抗體或抗原上同時帶有兩個標示物。然后以此雙標記了的抗體或抗原去結合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應抗體或抗原捕獲，形成一檢測帶。然后以磁性測定儀對該檢測帶進行定量檢測。
所形成的檢測帶是一可見或不可見的T帶，可見T帶為樣本中有目的蛋白并且濃度很高使檢測帶上積聚的膠體金能為肉眼所見，不可見T帶為樣本中無目的蛋白或者濃度很低使檢測帶上積聚的膠體金不能被肉眼看見。
圖1中標記1是磁性粒子，2是膠體金，3是抗體，4是抗原。
圖2為當陽性情況a時，陽性結果為樣品中抗體或抗原濃度可使膠體金在T帶的積累可被肉眼看到。圖中標記5是加樣孔，6是檢測窗口，61是檢測帶即T帶，62是對照帶即C帶。
圖3為當陽性情況b時，陽性結果為但被捕獲的抗體或抗原濃度較少使膠體金在T帶的積累較少，未被肉眼看到，而被捕獲在此的磁性粒子形成一條不可見的T帶，能被磁性檢測儀所測出。
圖4為當陰性情況時，陰性結果為樣品中無目的抗體或抗原，T帶處無條帶出現。
圖5是用于血清糖原磷酸化酶同工酶(GPBB)和肌紅蛋白(Mb)聯檢項目，在檢測窗口6內顯示有GPBB檢測帶63、Mb檢測帶64和對照帶62。
圖6也是用于血清糖元磷酸化酶同工酶(GPBB)和肌紅蛋白(Mb)聯檢項目，圖中○表示膠體金，◎表示生物素，C為對照帶，T1為檢測帶，T2為檢測帶，標號21為聯結了膠體金的GPBB單抗a磁珠，22為聯結了膠體金的Mb單抗α磁珠，23為包被在膜上GPBB單抗b，24為包被在膜上的Mb單抗β，25為包被在膜上的羊抗鼠二抗。
本發明的檢測試劑盒的制作方法包括以下步驟1、磁珠的制備。
2、膠體金的制備。
3、磁珠的金標及固相化。
4、抗體或抗原或二抗包被到硝酸纖維素膜上及其封閉。
5、試劑盒的組裝。
磁珠的制備是選用顆粒直徑為50nm的磁性粒子，將其標記到目的抗體或抗原相應的抗原或抗體上，成為一磁珠。
膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
磁珠的膠體金標記和固相化是將膠體金標記到磁珠上，再以百德(Bio-Dot)儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
抗體或抗原或二抗包被到硝酸纖維素膜上及其封閉，是分別將檢測目的物相應的另一個抗體或抗原以百德(Bio-Dot)儀的噴頭，噴到硝酸纖維素膜上形成檢測帶即T帶，同時將抗鼠二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對照線，以中性蛋白封閉，干燥。
試劑盒的組裝是將各成份(底板、上端吸水紙、噴有抗原或抗體的膜、膠體金墊、下端吸水紙)組裝、裁剪、包裝。
使用本發明技術生產的檢測板或檢測條在如下檢測時具有使用效果A、對于自身靈敏度要求不高的檢測項目、金標方法學可達到其靈敏度的項目，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等的檢測，可先根據T帶的顯色與否，以肉眼判斷結果的陰陽性，篩去不顯色(陰性)的結果，再根據需要以磁性測定儀對顯色結果(陽性)的檢測板或檢測條作進一步的定量分析。
B、對于靈敏度要求高的檢測項目、金標方法學可能無法達到其靈敏度的項目，例如在采血流動車上的運用，對所獻的血必須進行乙肝HBV、丙肝HCV、艾滋病HIV、梅毒TP的檢測，只有結果均為陰性的血才能被接受。所以，先篩去T帶有顯色的陽性血清，由于HIV、HCV初期患者其血內的抗體水平極低，極可能被漏檢，因此要對不顯色的陰性結果作進一步磁性檢測，借用磁性的高靈敏度避免可能的漏檢，增加血液使用的安全性。
C、如果樣品中無目的抗原或抗體，則T帶處無條帶出現，即為無可見色帶，也無磁性條帶。
權利要求
1.一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，其特征在于，本雙標記技術將目的蛋白的抗體或抗原標記一磁性粒子，形成一磁珠，再以此磁珠去標記膠體金，使該抗體或抗原上同時帶有兩個標示物；然后以此雙標記了的抗體或抗原去結合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應抗體或抗原捕獲，形成一檢測帶；然后在肉眼對檢測帶進行初步定性或半定量檢測的基礎上，以磁性測定儀對該檢測帶進行定量檢測。
2.根據權利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，其特征在于，所形成的檢測帶是一可見或不可見的T帶，可見T帶為樣本中有目的蛋白并且濃度很高使檢測帶上積聚的膠體金能為肉眼所見，不可見T帶為樣本中無目的蛋白或者濃度很低使檢測帶上積聚的膠體金不能被肉眼看見。
3.根據權利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，其特征在于，所述磁珠的制備是選用顆粒直徑為50nm的磁性粒子，將其標記到目的抗體或抗原相應的抗原或抗體上，成為一磁珠。
4.根據權利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，其特征在于，所述膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
5.根據權利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，其特征在于，所述磁珠的膠體金標記和固相化是將膠體金標記到磁珠上，再以百德(Bio-Dot)儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
6.根據權利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒，其特征在于，分別將檢測目的物相應的另一個抗體或抗原以百德德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到硝酸纖維素膜上形成檢測帶即T帶，同時將二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對照線，以中性蛋白封閉，干燥。
全文摘要
本發明涉及一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒,本雙標記技術將目的蛋白的抗體或抗原標記一磁性粒子,形成一磁珠,再以此磁珠去標記膠體金,使該抗體或抗原上同時帶有兩個標示物。然后以此雙標記了的抗體或抗原去結合目的抗原或抗體,最終被固定在膜上的相應抗體或抗原捕獲,形成一檢測帶。然后在肉眼對檢測帶進行初步定性或半定量檢測的基礎上,以磁性測定儀對該檢測帶進行定量檢測。本發明將免疫膠體金技術和免疫磁性粒子技術同時運用到快速檢測試劑盒中,既能進行定性檢測同時又能做定量測定,省時省力,節約了成本。
文檔編號G01N33/53GK1335503SQ01113129
公開日2002年2月13日 申請日期2001年6月27日 優先權日2001年6月27日
發明者張濤, 李賓, 龔丹, 周軍, 彭永濟, 任一萍 申請人:上海晶泰生物技術有限公司