專利名稱：刺五加葉的質量檢測方法
技術領域：
本發明屬于刺五加葉的質量檢測方法。
刺五加是五加屬五加科植物，為長白山地區特產中藥材之一，通常用其干燥的根及根莖入藥，商品名為五加參。刺五加已有悠久的藥用歷史。其根及根莖、莖的質量標準已列入藥典1996年版，近年來的研究表明，刺五加葉中含有豐富的具有廣泛藥理活性的黃酮和皂甙類化合物，可以進一步開發利用。并且將葉子作為藥材，具有保護藥用資源，環境友好的特點。由于刺五加葉的質量標準未列入藥典，建立一種能夠準確可靠的質量檢測手段，對于刺五加葉的開發利用是十分重要的。
本發明的目的是提供一種刺五加葉的質量檢測方法。利用刺五加葉粗提物的電噴霧質譜作為指紋圖譜，利用紫外-可見分光光度法確定刺五加葉中總黃酮、總皂甙的含量，保證了質量檢測標準的準確性和先進性。
本發明利用軟電離質譜技術對刺五加葉的粗提物進行檢測，根據得到的刺五加葉粗提物的電噴霧指紋圖譜中黃酮及皂甙的個數及分布，對刺五加葉的質量進行初步評價。該指紋圖譜可以清晰反映出由于產地、采收季節所帶來的黃酮和皂甙種類的不同。本發明考慮到刺五加葉中所含皂甙的甙元以齊墩果酸為主，基于齊墩果酸與香蘭素-濃硫酸能發生顯色反應這一原理，以齊墩果酸作為標準品，通過測定總皂甙水解產物中齊墩果酸的含量來測定刺五加葉總皂甙含量。而總黃酮的含量測定采用蘆丁作為標準品，硝酸鋁與黃酮類化合物形成配合物的顯色原理進行測定。
本發明選擇60％-90％的乙醇作為溶媒，稱取已粉碎的刺五加葉60-100g于2000ml燒瓶中，加360ml-1000ml 60％-90％乙醇，通過超聲提取2-3次，20-40min/次，或熱浸2-3次，1-3h/次；合并兩次提取液并濃縮至約60-100ml，再用石油醚萃取近無色，將下層蒸干成固體物，精確稱取50mg于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即為黃酮含量測定用樣品a，水定容后飽和正丁醇萃取4次，分別合并4次萃取的正丁醇層，減壓蒸干，殘渣以甲醇溶解，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，作為總皂甙含量測定的樣品b。
樣品的電噴霧指紋圖譜通過如下步驟得到取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓3.5-5.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。利用負離子電噴霧質譜確認黃酮的種類，在m/z50-700范圍內，存在m/z301，m/z447，m/z463，m/z609等離子；利用正離子電噴霧質譜確認皂甙的種類，在m/z900-1500范圍內，存在m/z1065，m/z1081，m/z1097，m/z1108，m/z1123，m/z1211，m/z1227，m/z1243，m/z1253，m/z1269，m/z1285等離子。總皂甙含量測定的方法如下精密稱取約15mg的齊墩果酸置于10ml容量瓶中，加甲醇定容；香蘭素配成8％乙醇溶液；硫酸配成72％(V/V)溶液。
用微量注射器精密移取齊墩果酸標準品溶液0μl-100μl及50μl樣品溶液b分別置于六個小試管中，揮干溶劑，分別加入8％香蘭素乙醇溶液0.5ml，72％(V/V)硫酸5ml，搖勻后于60℃恒溫水浴加熱10min，然后置冰水浴中冷卻15min，反應物作為待測溶液。
首先測定標準溶液在530-545nm波長下的可見光吸收，作標準工作曲線，然后根據標準曲線測得樣品中總皂甙的含量。
總黃酮含量測定方法如下精密稱量約10mg的蘆丁，置于10ml容量瓶中，加乙醇定容，用微量注射器精密移取蘆丁標準品溶液0μl-50μl及25μl樣品溶液a分別置于25ml容量瓶中，分別加入5％亞硝酸鈉1.0ml，搖勻，靜止5min，再加入4％氫氧化鈉溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490-510nm波長下首先測定標準溶液的吸收，作標準工作曲線，然后根據標準曲線測得樣品中總黃酮的含量。
本方法的樣品前處理過程較為簡單，提取效率較高。利用刺五加葉提取物的電噴霧質譜作為指紋圖譜，通過黃酮、皂甙的種類可以清晰地看出不同產地、不同季節采收的刺五加葉的質量差異，再結合紫外-可見分光光度計對刺五加葉提取物中總黃酮、總皂甙的含量測定結果，可以對刺五加葉的質量進行評價。
本發明提供的實施例如下實施例1(1).樣品制備稱取已粉碎的刺五加葉60g于2000ml燒瓶中，加360ml 60％乙醇，超聲提取三次，每次20分鐘；合并兩次提取液并濃縮至約100ml，再用石油醚萃取近無色，將下層蒸干成固體物，精確稱取50mg于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即為黃酮含量測定用樣品a。水定容后飽和正丁醇萃取4次，分別合并4次萃取的正丁醇層，減壓蒸干，殘渣以甲醇溶解，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，作為總皂甙含量測定的樣品b。
(2)樣品的電噴霧指紋圖譜取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋至一定濃度后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓4.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。利用負離子電噴霧質譜確認黃酮的種類，m/z50-700范圍內，存在m/z301，m/z447，m/z463，m/z609離子；利用正離子電噴霧質譜確認皂甙的種類，在m/z900-1500范圍內，存在m/z1065，m/z1081，m/z1097，m/z1108，m/z1123，m/z1211，m/z1227，m/z1243，m/z1253，m/z1269，m/z1285等離子。
(3)總皂甙含量測定的方法精密稱取約15mg的齊墩果酸置于10ml容量瓶中，加甲醇定容；香蘭素配成8％乙醇溶液；硫酸配成72％(V/V)溶液。
用微量注射器精密移取齊墩果酸標準品溶液0μl-100μl及50μl樣品溶液b分別置于六個小試管中，揮干溶劑，分別加入8％香蘭素乙醇溶液0.5ml，72％(V/V)硫酸5ml，搖勻后于60℃恒溫水浴加熱10min，然后置冰水浴中冷卻15min，反應物作為待測溶液。
首先測定標準溶液在530nm波長下的可見光吸收，作標準工作曲線，然后根據標準曲線測得樣品中總皂甙的含量。
(4)總黃酮含量測定精密稱量約10mg的蘆丁，置于10ml容量瓶中，加乙醇定容，用微量注射器精密移取蘆丁標準品溶液0μl-50μl及25μl樣品溶液a分別置于六個25ml容量瓶中，分別加入5％亞硝酸鈉1.0ml，搖勻，靜止5min，再加入4％氫氧化鈉溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490nm波長下首先測定標準溶液的吸收，作標準工作曲線，然后根據標準曲線測得樣品中總黃酮的含量。
實施例2(1).樣品制備稱取已粉碎的刺五加葉80g于2000mL燒瓶中，加640ml 80％乙醇，超聲提取二次，每次30分鐘；按照實施例1的樣品制備步驟得到黃酮含量測定用樣品a和作為總皂甙含量測定的樣品b。
(2)樣品的電噴霧指紋圖譜取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋至一定濃度后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓4.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。按照實施例1的步驟(2)確認黃酮和皂甙的種類。
(3)總皂甙含量測定的方法利用實施例1中總皂甙含量測定的方法在537.5nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總皂甙的含量。
(4)總黃酮含量測定利用實施例1中總黃酮含量測定的方法在510nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總黃酮的含量。
實施例3(1).樣品制備稱取已粉碎的刺五加葉100g于2000mL燒瓶中，加1000ml 90％乙醇，超聲提取二次，每次40分鐘；按照實施例1的樣品制備步驟得到黃酮含量測定用樣品a和作為總皂甙含量測定的樣品b。
(2)樣品的電噴霧指紋圖譜取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋至一定濃度后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓5.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。按照實施例1的步驟(2)確認黃酮和皂甙的種類。
(3)總皂甙含量測定的方法利用實施例1中總皂甙含量測定的方法在545nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總皂甙的含量。
(4)總黃酮含量測定利用實施例1中總黃酮含量測定的方法在500nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總黃酮的含量。
實施例4(1).樣品制備稱取已粉碎的刺五加葉60g于2000mL燒瓶中，加360ml 60％乙醇，60℃熱浸提取三次，每次2小時；按照實施例1的樣品制備步驟得到黃酮含量測定用樣品a和作為總皂甙含量測定的樣品b。
(2)樣品的電噴霧指紋圖譜取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋至一定濃度后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓4.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。按照實施例1的步驟(2)確認黃酮和皂甙的種類。
(3)總皂甙含量測定的方法利用實施例1中總皂甙含量測定的方法在545nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總皂甙的含量。
(4)總黃酮含量測定利用實施例1中總黃酮含量測定的方法在510nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總黃酮的含量。
實施例5
(1).樣品制備稱取已粉碎的刺五加葉80g于2000mL燒瓶中，加640ml 80％乙醇，60℃熱浸提取三次，每次1小時；按照實施例1的樣品制備步驟得到黃酮含量測定用樣品a和作為總皂甙含量測定的樣品b。
(2)樣品的電噴霧指紋圖譜取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋至一定濃度后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓3.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。按照實施例1的步驟(2)確認黃酮和皂甙的種類。
(3)總皂甙含量測定的方法利用實施例1中總皂甙含量測定的方法在537.5nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總皂甙的含量。
(4)總黃酮含量測定利用實施例1中總黃酮含量測定的方法在500nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總黃酮的含量。
實施例6(1).樣品制備稱取已粉碎的刺五加葉100g于2000mL燒瓶中，加1000ml 90％乙醇，60℃熱浸提取二次，每次3小時；按照實施例1的樣品制備步驟得到黃酮含量測定用樣品a和作為總皂甙含量測定的樣品b。
(2)樣品的電噴霧指紋圖譜取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋至一定濃度后，作電噴霧質譜分析。電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓5.5kV。流動注入泵進樣。掃描范圍m/z50-2000。按照實施例1的步驟(2)確認黃酮和皂甙的種類。
(3)總皂甙含量測定的方法利用實施例1中總皂甙含量測定的方法在530nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總皂甙的含量。
(4)總黃酮含量測定利用實施例1中總黃酮含量測定的方法在490nm波長下對標準溶液和樣品溶液進行測定，確定樣品中總黃酮的含量。
權利要求
1.一種刺五加葉的質量檢測方法，其特征在于選擇60％-90％的乙醇作為溶媒，稱取已粉碎的刺五加葉60-100g于2000ml燒瓶中，加360ml-1000ml 60％-90％乙醇，通過超聲提取2-3次，20-40min/次，或熱浸2-3次，1-3h/次；合并兩次提取液并濃縮至約60-100ml，再用石油醚萃取近無色，將下層蒸干成固體物，精確稱取50mg于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即為黃酮含量測定用樣品a；水定容后飽和正丁醇萃取4次，分別合并4次萃取的正丁醇層，減壓蒸干，殘渣以甲醇溶解，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，作為總皂甙含量測定的樣品b；樣品的電噴霧指紋圖譜通過如下步驟得到取少量的樣品溶液a，用甲醇稀釋后，作電噴霧質譜分析，電噴霧質譜實驗條件如下電噴霧源，正、負離子電離方式，噴霧電壓3.5-5.5kV，流動注入泵進樣；掃描范圍m/z50-2000，利用負離子電噴霧質譜確認黃酮的種類，利用正離子電噴霧質譜確認皂甙的種類；總皂甙含量測定的方法如下精密稱取約15mg的齊墩果酸置于10ml容量瓶中，加甲醇定容；香蘭素配成8％乙醇溶液；硫酸配成72％(V/V)溶液；用微量注射器精密移取齊墩果酸標準品溶液0μl-100μl及50μl樣品溶液b分別置于六個小試管中，揮干溶劑，分別加入8％香蘭素乙醇溶液0.5ml，72％(V/V)硫酸5ml，搖勻后于60℃恒溫水浴加熱10min，然后置冰水浴中冷卻15min，反應物作為待測溶液；首先測定標準溶液在530-545nm波長下的可見光吸收，作標準工作曲線，然后根據標準曲線測得樣品中總皂甙的含量；總黃酮含量測定方法如下精密稱量約10mg的蘆丁，置于10ml容量瓶中，加乙醇定容，用微量注射器精密移取蘆丁標準品溶液0μl-50μl及25μl樣品溶液a分別置于25ml容量瓶中，分別加入5％亞硝酸鈉1.0ml，搖勻，靜止5min，再加入4％氫氧化鈉溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490-510nm波長下首先測定標準溶液的吸收，作標準工作曲線，然后根據標準曲線測得樣品中總黃酮的含量。
全文摘要
本發明提供了一種長白山地道藥材刺五加葉的質量檢測方法。利用乙醇提取、濃縮、過濾、除脂等樣品前處理手段將刺五加葉處理后,通過電噴霧質譜得到總黃酮、總皂甙的指紋圖譜,根據其指紋圖譜確定刺五加葉中所含的黃酮、皂甙的種類;利用紫外－可見分光光度計測定總黃酮,總皂甙的含量。綜合其指紋圖譜及含量測定數據,可以對刺五加葉的質量進行評價。
文檔編號G01N21/33GK1369704SQ0110400
公開日2002年9月18日 申請日期2001年2月16日 優先權日2001年2月16日
發明者劉淑瑩, 宋鳳瑞, 劉志強, 郭明全, 陳貌連, 崔勐 申請人:中國科學院長春應用化學研究所