專利名稱：用于固定配體的基質的制作方法
技術領域：
本發明涉及可在生化領域中使用的一種用于連續、高速地獲得有關配體與受體間結合的大量信息的基質、一種使用該基質的儀器、一種用于檢測配體與受體間結合的儀器和一種用于檢測結合的方法。
在一項實施方案中，該配體的示例有核酸、糖類、肽或蛋白。核酸的示例有雙鏈DNA或單鏈DNA，而DNA的示例有多核苷酸或寡核苷酸。優選的是，該基質可用于高速檢測配體和能夠與該配體結合的受體之間的結合。本發明所述基質的一個實例是，基質上的區域間距至少為1mm、基質上的區域密度小于100個區域/cm2、基質上的區域密度小于10個區域/cm2、基質上的區域數量為100或100以上，或基質上的區域數量為1000或1000以上。受體的示例包括能夠與一種核酸、糖類、肽或蛋白結合的核酸、糖類、肽或蛋白。可以用帶標記的受體作為受體。
第二方面，本發明涉及一種儀器，用于檢測配體與受體間的結合，該儀器包括a)一種索狀、帶狀或盤狀基質，其表面的預定區域固定有多個不同的配體；
b)將基質暴露于至少能結合一種配體的受體的一種設備；以及c)檢測受體與基質上至少一種配體之間發生結合的區域的一種設備。
第三方面，本發明涉及一種儀器，用于檢測配體和受體之間的結合，該儀器包括一種設備，用于高速檢測受體與表面預定區域固定有配體的索狀、帶狀或盤狀基質上多個不同配體中的一種配體之間發生結合的區域。
第四方面，本發明涉及一種方法，用于檢測配體和受體之間的結合，該方法包括a)將表面預定區域固定有多個不同配體的索狀、帶狀或盤狀基質暴露于至少能結合其中一種配體的受體；并且b)檢測受體與基質上至少一種配體之間發生結合的區域。
在第二至第四方面中，優選的是采用第一方面的基質。可以使用一種帶標記的受體，并通過該標記來檢測受體與基質上的配體之間發生結合的區域。優選的是用一種能夠與作為配體的核酸、糖類、肽或蛋白結合的核酸、糖類、肽或蛋白來作為受體。
發明詳述本發明的配體只需是一種能夠被特異性受體識別并結合的分子，除此之外并無特別的限制。例如，該配體可以是一種核酸、一種糖、一種蛋白或一種肽。
配體的實例包括細胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒表位、激素(如鎮靜劑、阿片制劑和類固醇)、激素受體、肽、酶、酶底物、輔因子、藥物、外源凝集素、糖類、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、寡糖、蛋白和單克隆抗體。
本發明的受體只需具有與上述配體結合的能力，除此之外并無特別的限制。本發明的受體可以是天然分子，也可以是人造分子。受體的實例包括核酸、糖類、蛋白和肽，如酶、細胞表面蛋白(受體)、糖蛋白和抗體。
本發明的配體與能夠結合該配體的受體的接觸面特性彼此互補。
文中使用的術語“索狀”是指物質的寬度小于帶狀物質的寬度，該術語包括索狀、線狀和繩狀。索狀基質可以由任何材料制成，條件是能夠將配體固定在該基質表面的預定區域。帶狀基質是一種狹長的系帶樣基質。帶狀基質可以由任何材料制成，條件是能夠將配體固定在該基質表面的預定區域。本發明的盤狀基質是一種圓盤形基質，它可以由任何材料制成，條件是能夠將配體固定在該基質表面的預定區域。
索狀基質可以采用任何柔性或半柔性材料。理想的是在物理上分離的表面位置分布有多個配體固定化區域。帶狀基質可以采用任何柔性或半柔性材料。帶狀基質至少有一個面基本上為平面。理想的是在物理上分離的表面位置分布有多個配體固定化區域。盤狀基質可優選地采用任何剛性、柔性或半柔性材料。盤狀基質至少有一個面基本上為平面。理想的是在物理上分離的表面位置分布有多個配體固定化區域。
索狀、帶狀或盤狀基質表面上配體固定化位置的排列方式沒有特別的限制。其排列方式可根據用途的不同而有所改變。
例如，索狀基質上的配體可以按1-100個配體/cm、1-100個配體/cm2或1-100個配體/cm3的密度呈點狀排列。帶狀基質上的配體可以沿短邊和長邊均按1-100個配體/cm的密度呈點狀排列。盤狀基質上的配體可以按1-10000個配體/cm2的密度呈點狀排列。
可以用一種商品化的定位儀方便地將配體定位在基質上。某些類型的配體可以在基質上合成。
優選的是，本發明的基質采用一種可用于高速檢測配體與能夠結合該配體的受體之間的結合的基質。當利用該基質可以高速檢測出配體與能夠結合該配體的受體之間的結合時，即使所用基質上的配體固定化區域的位置彼此有一定距離，也可以在短時間內檢測出配體與能夠結合該配體的受體之間的大量結合。配體固定化區域的位置彼此有一定距離的基質可以用簡便的制備方法獲得。即使采用這種基質，也可通過由該基質高速獲得信息的方法產生與具有高密度配體固定化區域的基質相類似的結果。
此外，配體固定化區域的位置彼此有一定距離的基質可以減少制備后的配體間污染的幾率。
以下為該基質的范例，這些范例均可根據本發明優選地使用配體固定化區域的位置間隔至少為1mm的一種索狀、帶狀或盤狀基質；配體固定化區域的位置密度小于100個區域/cm2的一種索狀、帶狀或盤狀基質；配體固定化區域的位置密度小于10個區域/cm2的一種索狀、帶狀或盤狀基質；所含配體固定化區域的數量為100或100以上的一種索狀、帶狀或盤狀基質；以及所含配體固定化區域的數量為1000或1000以上的一種索狀、帶狀或盤狀基質。
根據本發明，如果配體固定化區域在特定范圍內呈單線形排列，則只需一維掃描即可檢測出配體與目的受體之間的結合。另一方面，當采用含有高密度配體固定化區域的常規基質時，需要通過二維掃描來檢測配體與目的受體之間的結合。因此，本發明提供一種檢測配體與目的受體結合的簡便方法，該方法與傳統方法相比具有劃時代的意義。
上文所述的線形并不局限于直線形或曲線形。
本發明的索狀或帶狀基質可優選地采用一種由基本不溶的材料制成的基質。這種材料的實例包括能夠與配體共價或非共價連接的雜聚物、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚亞芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯、聚氯乙烯、尼龍和本申請書公開后將被該領域所了解的其他聚合物，另外還包括紙、尼龍、纖維素，以及纖維素衍生物如硝化纖維素。
本發明的盤狀基質可優選地采用一種由基本不溶的材料制成的基質。這種材料的實例包括能夠與配體共價或非共價連接的雜聚物、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚亞芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯、聚氯乙烯、尼龍和本申請書公開后將被該領域所了解的其他聚合物、紙、尼龍、纖維素、纖維素衍生物如硝化纖維素，塑料，如聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚丙烯，以及塑料衍生物、磁性或非磁性金屬、石英和玻璃。
本發明的索狀、帶狀或盤狀基質可以由一種帶有平滑表面的聚合或非聚合多孔材料制成。但是，本發明的基質并不局限于由這種材料制成的基質。例如，本發明的基質可以是能夠作為DNA芯片或生物傳感器的基質和能夠使DNA在其表面得以固定的基質。舉例來說，優選的是使用一種表面帶有親水性或疏水性官能團的基質。官能團的實例包括羥基、胺基、巰基、醛基、羧基和酰基。本發明的基質還包括表面帶有這種性質的官能團作為基質材料的性質的基質。甚至當一種基質的表面不具有親水性或疏水性官能團時，只要能通過表面處理使該基質的表面獲得這種官能團，則其使用同樣不受限制。
經過這種表面處理的基質的實例包括，表面經過氨基烷基硅烷等商品化硅烷偶聯劑處理的基質、表面經過聚賴氨酸或聚氮丙啶等多聚陽離子處理的基質，或表面經過氨基烷基硅烷和戊二醛處理的基質。
帶負電荷、不帶電荷或帶正電荷的基質均可優選地作為本發明的索狀、帶狀或盤狀基質，條件是其表面能夠有效地固定配體。此外，本發明的基質可含有兩部分結構，一部分用于配體固定化，一部分用來支持配體固定化部分。可以根據索狀、帶狀或盤狀基質的配體固定化效率和強度來進行選擇。
可以先制備出配體固定化部分，再將其與支持部分粘接，然后即可使用。配體固定化部分的形狀不受限制。索狀、帶狀或盤狀基質的制備可采用已事先完成配體固定化的小珠，或表面能夠合成配體的小珠，等等。
只要本底被充分抑制，使信號檢測可以用檢測器來完成，則任何材料都可以不受限制地優選用于本發明的索狀、帶狀或盤狀基質。根據本發明，可優選地使用一種透明的、半透明的或不透明的基質。根據基質材料的不同，可以選擇使用透射光型檢測器、反射光型檢測器，等等。
在用檢測器檢測時，可以使基質進行一維移動。作為選擇，也可以使檢測器在基質上進行一維移動。
測定配體與其受體間結合的方法可以是，將帶有多個配體的索狀、帶狀或盤狀基質暴露于至少一種要檢測與該配體結合能力的受體(如帶標記的配體)，然后檢測基質上的標記位置。可以將整個基質暴露于受體，也可以將基質的不同部分依次暴露于受體。例如，依次測定配體與受體間結合的方法如下當使用索狀基質時，可以從基質的頂端開始，依次暴露于受體；當使用帶狀基質時，可以從短邊開始，依次暴露于帶標記的受體，然后檢測基質上的標記位置；當使用盤狀基質時，可以從基質的任意位置開始，依次暴露于帶標記的受體，然后檢測基質上的標記位置。還可以選擇性地在上述方法中適當加入將索狀、帶狀或盤狀基質清洗和(或)干燥的步驟。
在測定配體與受體間的結合時，可以適當地選擇索狀、帶狀或盤狀基質穿過基質檢測器的速度。例如，該速度可以是恒定的。作為選擇，也可以在需要精確檢測的區域改變該速度。如果基質以恒定速度穿過，則獲得10μm分辨率的優選速度為，例如，15秒/cm2或更低，更優選為10秒/cm2或更低。獲得80μm分辨率的優選速度為1秒/cm2或更低，更優選的為0.5秒/cm2或更低。進行檢測的方法可以是反復將整個索狀、帶狀或盤狀基質或其需要精確檢測的部分穿過檢測器，期間需要翻轉基質的移動方向，以使信號數據統一。
通過使用一種已預先經過受體與配體結合步驟的基質，可以高速實現配體與受體結合的檢測步驟。此時，即使采用一種含有低密度配體固定化區域的基質，也可以因高速度而獲得與含有高密度配體固定化區域的基質相類似的結果。此外，由于在低密度基質上固定配體可以精確而又方便地實現，并且其成本低廉，所以本發明的該基質具有與包含高密度配體固定化區域的基質相同的或更強的工業實用性。
在一項優選實施方案中，所用基質上帶有連接分子。配體與該連接分子上暴露的官能團反應。在一項優選實施方案中，配體的末端具有氨基或羧基基團，而連接分子具有能與配體的該末端反應的氨基或羧基基團。
所得基質具有多種用途，其中包括，例如，對大量受體進行生物活性篩選。為了進行生物活性篩選，可以將基質暴露于一種或多種受體。使用的受體可選自，例如，抗體、完整細胞、囊泡上的受體、脂類或其他不同的受體。優選的是該受體帶有，例如，一種熒光標記、一種放射性標記，或能夠與該受體反應的一種標記抗體。基質上的標記位置可通過，例如，光子檢測法或放射自顯影法來檢測。例如，可以用單熒光標記來進行檢測，但本發明并不局限于此。在這種情況下，可以對不同測試樣品的受體存在情況進行比較和分析，方法是用本發明的多個索狀、帶狀或盤狀基質分別與帶有單熒光標記的多個測試樣品反應，然后同時或分別高速檢測多個索狀、帶狀或盤狀基質上的熒光信號。也可以用兩種或多種熒光標記來進行分析。
此外，還可以用磁性材料來標記受體，并通過磁性材料的磁場來檢測受體與固定在基質上的配體之間的結合。
因此，本發明提供一種方法，用于檢測配體和受體之間的結合，其中，受體被一種磁性材料標記，從而可通過磁性材料的磁場來檢測受體與固定在基質的預定區域的配體之間的結合。
例如，在該方法中，可以用一種消磁的磁性微粒來標記受體，該微粒結合有或涂有一種連接分子，該分子具有一種能夠與該受體結合的官能團。
將標記有消磁的磁性微粒的受體暴露于配體，然后清洗并去除未與配體結合的受體。
將配體結合的受體上連接的磁性微粒重新磁化，方法是將其暴露于適當的磁場。
這樣就可以通過重新磁化的磁性微粒的磁場來檢測配體與受體之間的結合。
本發明的磁性微粒可以采用硬磁材料。使磁石(Fe3O4)或磁赤鐵礦(γFe2O3)微粒逐漸形成針狀物，這樣制成的磁粉即可作為一種硬磁材料，但本發明并不局限于此。利用磁飽和點較高的硬磁材料或未經熱消磁的硬磁材料可以實現高精度的檢測。作為選擇，也可以使用經疏水鍵連接有磁性材料的受體。可以使用未消磁的磁性材料。也可以使用來源于微生物的磁性材料。
利用檢測到結合的位置上的配體信息，可以快速確定與受體結合的這種配體。因此，可以用這種技術對大量受體進行篩選。本發明的其他可能用途還包括診斷。此時，在基質上分布有不同的特定受體的配體，因而可根據測試樣品中的受體存在情況來診斷與受體異常相關的疾病。
利用本發明第二方面描述的用于檢測配體與受體間結合的儀器可以自動實現對配體與受體間結合的檢測。該儀器可以檢測在表面預定區域固定有多個不同配體的索狀、帶狀或盤狀基質上的配體與測試樣品中的受體之間的結合，該儀器包括a)將基質暴露于至少能結合一種配體的受體的一種設備；以及b)檢測受體與基質上至少一種配體之間發生結合的區域的一種設備。
例如，該儀器可由一種移動索狀、帶狀或盤狀基質的設備、一種前預雜交池、一種預雜交池、一種標記受體池、一種清洗池、一種干燥設備、一種檢測配體與受體間結合的設備、一臺分析配體與受體間結合的數據的計算機組成。可以用單池或多池來充當各種池。
圖1顯示本發明的一種典型檢測儀器的結構。利用由滾輪(21)驅動的帶狀基質移動設備(20)將固定有配體的帶狀基質(10)移到前預雜交池(30)進行預處理。將預處理過的基質移到預雜交池(40)，然后再移到標記受體池(50)。在標記受體池中，配體與受體發生結合。在清洗池I(60)中清洗基質，然后在清洗池II(70)中清洗基質。然后用移動設備將基質轉移，用于干燥(80)，并用干燥設備(90)使其干燥。然后用移動設備將基質轉移，用于檢測配體與受體間的結合(100)。利用檢測配體與受體間結合的設備(110)檢測配體與受體之間的結合。利用分析配體與受體間結合的數據的計算機(120)分析檢測到的結合信息。
盒表示一種用單池充當各種池的儀器。該盒含有一種可作為池的容器，該容器帶有一個進口和一個出口，容器中含有索狀或帶狀基質與一種纏繞設備的組合，或盤狀基質與一種旋轉設備的組合。此時，舉例來說，從預處理步驟到清洗步驟的操作可以在這種盒中進行，期間需要更換流體。然后將干燥/檢測設備裝在盒上，以使基質干燥并檢測配體與受體之間的結合，期間需要用纏繞設備或旋轉設備移動基質。
此外，利用本發明第三方面描述的用于檢測配體與受體間結合的儀器也可以自動實現對配體與受體間結合的檢測。該儀器可以檢測表面預定區域固定有多個不同配體的索狀、帶狀或盤狀基質上的配體與測試樣品中的受體之間的結合，該儀器包括檢測受體與基質上的配體之間發生結合的區域的一種設備。
如果采用這種儀器，則可以方便地使用已預先經過受體與基質上配體結合的步驟的一種基質。
在受體與基質上的配體結合之后，可以制備出含有固定這些配體的區域的索狀、帶狀或盤狀基質。然后用該儀器檢測這些區域。
該儀器的測量所需時間可以通過改變索狀、帶狀或盤狀基質在儀器中的移動速度來加以調節。這樣就能夠以更高的速度檢測配體與受體之間的結合。
本申請書公開一種改良的檢測儀器和一種改進的檢測方法。該檢測儀器和檢測方法使用一種在表面的已知位置固定有多個配體的索狀、帶狀或盤狀基質。例如，可以將這種索狀、帶狀或盤狀基質依次暴露于一種受體(如帶有熒光標記的受體)。該受體可以與一個配體或一些配體相結合。如果在索狀、帶狀或盤狀基質上重復固定有若干組配體，則可以將每一組配體作為一個單位暴露于一種受體。也就是說，如果該儀器含有多個標記受體池，則可以將每一組配體作為一個單位暴露于一種標記受體。然后將索狀、帶狀或盤狀基質依次放置在一種檢測器中(如顯微檢測器)，以確定結合的位置。顯微檢測器可包含一種用于把光導向基質的光源、一種檢測設備，例如檢測基質發出的熒光的設備，和一種確定熒光位置的設備。也可使用一種將配體與受體間的結合作為隨時間而改變的電流來加以檢測的檢測器。可以對索狀、帶狀或盤狀基質進行多次測量并將信號整合，以提高檢測信號的信號本底比(信噪比)。
索狀、帶狀或盤狀基質的熒光檢測設備的實例包括光子計數器。可以將配體與受體結合位置的檢測設備固定，并使索狀、帶狀或盤狀基質穿過該檢測設備。作為選擇，也可以使其進行X-Y移動。由穿過檢測器的索狀、帶狀或盤狀基質獲取的數據可以用一種適當編程的數字式計算機進行記錄，然后進行分析。
表1
*CAP商品化引物。
選自表1的基因或其DNA片段的制備方法如下。由GenBank獲得要固定的基因的核苷酸序列信息或產物的源基因，這些基因的序列在遞交時都具有特定的登記號。根據這些信息構建出用于PCR擴增的引物對。構建時采用了OLIGOTM引物分析軟件(Takara Shuzo)，設定軟件的參數，以產生約100b-1kb的DNA片段，這種片段最適合于本發明的方法。然后根據已確定的核苷酸序列用DNA合成儀合成引物。組織蛋白酶G、NGF受體和CSF1受體的基因分別采用HumanUniGene DNA組(Research Genetics)中包含的引物。
以基因組DNA、基因組DNA文庫或cDNA文庫為模板，根據商品化PCR試劑盒中附帶的標準方案由引物對獲得所需的PCR擴增片段。并用SUPREC-02(Takara Shuzo)將獲得的DNA片段純化。對擴增出的cDNAs的核苷酸序列進行分析，以確定是否為所需片段。用乙醇沉淀法回收各種擴增片段，并以1μM的濃度溶解在100mM碳酸緩沖液(pH9.5)中。此外，還利用類似方式制備出一種管家基因，β-肌動蛋白基因，并將其作為陽性對照。陰性對照則采用pBR322質粒DNA。
將每種純化DNA片段的一部分溶解在50mM碳酸緩沖液(pH9.5)中，然后分別制備成5種連續稀釋液，并在260nm下測量吸光度，以確定其濃度。每種稀釋液含有濃度為0.1-0.5mg/ml的DNA片段。制備出用于如下文所述進行堿變性的樣品，使處理后的樣品具有如上所述的濃度。
分別將樣品按原樣室溫放置10分鐘，或分別添加到含有0.5M氯化鈉的0.25N氫氧化鈉中(Nacalai Tesque)之后再室溫放置10分鐘，然后冰浴冷卻。用GMS417陣列儀(Genetic MicroSystems，GMS)將DNA溶液點在索狀、帶狀或盤狀基質上。索狀基質的制備方法是，將Hybond-N(Amersham)和Gene Screen Plus(NEN)這兩種尼龍膜中的一種切成寬1mm、長1m的細條，再將細條捻成索。將樣品以1mm或更長的間距點在索上，產生直徑為0.1mm的點。35種DNA片段有5種連續稀釋液，按堿變性(35×5＝175個點)或未堿變性(35×5＝175個點)兩組分別進行重復點樣。帶狀基質采用Hybond-N(Amersham)和Gene Screen Plus(NEN)這兩種尼龍膜。帶狀基質的制備方法是將膜切成寬1cm、長1m的帶。將樣品點在帶上，以形成點(直徑0.1mm)的陣列。該陣列含有5列700行(4組，每組175行)。詳細地說，也就是35種DNA片段有5種連續稀釋液，以堿變性(35×5＝175個點)或未堿變性(35×5＝175個點)兩組為一套進行重復點樣。另一方面，盤狀基質的點樣方法是，35種DNA片段有5種連續稀釋液，按堿變性(35×5＝175個點)或未堿變性(35×5＝175個點)兩組在直徑87mm的盤狀Hybond-N(Amersham)尼龍膜上進行重復點樣。
將點有DNA片段的上述索狀、帶狀或盤狀基質在室溫下各靜置30分鐘，用含有0.5M氯化鈉的0.5M tris-鹽酸(pH7.5)清洗，然后用2×SSC(Wako Pure Chemical Industries)沖洗。用一種透照儀對基質進行大約2分鐘的UV照射，以固定DNAs。這樣就在索狀、帶狀或盤狀基質上制成了DNA陣列。
(2)檢測不同的內分泌干擾劑對培養細胞的影響。
在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培養基上培養人乳癌MCF-7細胞。用胰蛋白酶進行消化，然后把2×106個細胞置于10cm平皿上。將細胞置于含有已利用活性碳-葡聚糖處理方法去除了甾體類激素的5％胎牛血清的DME培養基中培養24小時。去除培養基，然后將細胞置于含有10nM已烯雌酚(DES)的相同培養基中培養2小時。在不含該化學物質的條件下以類似方式培養細胞，作為對照。將處理后的細胞回收，并分別用TRIzol試劑(Gibco-BRL)制備總RNAs。
(3)用DNA酶處理上文(2)中制備的總RNA。制備含有約100-300μg總RNA、10μl 10×AMV緩沖液(Life Science)和10U DNA酶I(Takara Shuzo)的12μl反應混合物，37℃溫育10分鐘，然后進行兩次酚-氯仿提取，再進行乙醇沉淀。用所得總RNA的一部分進行濃度測定。
(4)用上文(3)中制備的總RNA進行逆轉錄反應。反應混合物的成分如下反應混合物A約130μg總RNA、10μg寡聚(dT)引物(TakaraShuzo)和20μl用焦碳酸二乙酯(DEPC，Wako Pure ChemicalIndustries)處理過的水；以及反應混合物B12μl 5×AMV RTase緩沖液(Life Science)、0.5mMdATP、0.5mM dCTP、0.5mM dGTP、0.2mM dTTP、60U RNA酶抑制劑(Takara Shuzo)、0.1mM Cy3標記的dUTP(AmershamPharmacia)。
將反應混合物A 70℃溫育10分鐘，然后冰浴冷卻。將反應混合物B加至其中，并將所得混合物42℃溫育5分鐘。再將約60U AMVRTase(Life Science)加至其中，所得總反應體積為60μl。將RT反應混合物42℃溫育70分鐘。然后在反應混合物中添加7.5μl的500mMEDTA溶液和15μl的1M氫氧化鈉。將所得混合物60℃溫育1小時，以降解模板RNA。冷卻至室溫后，將37.5μl的1M tris-鹽酸(pH7.5)加至其中。用MicroconTM-30(Millipore)將所得溶液濃縮至20μl。將200μl含有1mM EDTA的10mM tris-鹽酸加至其中，然后再將混合物濃縮至20μl。下文的雜交即采用這種Cy3標記的DNA溶液。
(5)用2×SSC將上文(1)中制備的索狀、帶狀或盤狀基質滲透1分鐘，然后在含有4×SSC、0.2％ SDS和100μg/ml鮭魚精子DNA的溶液中40℃預雜交1小時。然后將索狀、帶狀或盤狀基質上的DNA陣列置于一種雜交溶液中，40℃溫育過夜。該雜交溶液的制備方法是，將上文(4)中制備的Cy3標記靶DNA進行熱變性，并將其懸浮在含有4×SSC、0.2％ SDS和100μg/ml鮭魚精子DNA的溶液中，使熱變性的靶DNA的濃度約為10μg/ml。雜交結束后，在室溫條件下用含有2×SSC和0.1％ SDS的溶液將基質清洗5分鐘，共清洗兩次，然后在68℃條件下用含有0.1×SSC和0.1％SDS的溶液將基質清洗15分鐘，也清洗兩次。對基質上的各個點發出的熒光信號進行檢測，方法如下。將基質放在一種熒光檢測器中。可以用該檢測器從短邊(當使用索狀或帶狀基質時)或任意的測量起始點(當使用盤狀基質時)依次進行測量。然后對標記受體與配體之間的結合進行分析。用數字來表示基質上的陣列的分析結果，方法是將內分泌干擾劑處理樣品的熒光信號值除以對照樣品的熒光信號值。如果計算結果大于1.00，說明用內分泌干擾劑處理可加強該基因的表達。反之，如果計算結果小于1.00，說明這種處理可抑制其表達。如果計算結果等于1.00，則用該物質處理不會影響這種基因。
利用上述分析方法，N-COR/SMRT與ARA70(核受體與核受體轉錄偶聯因子)、p38r、JNK2和BMK2(激酶類信號轉導因子)以及PDGF受體(受體類激酶)的分析結果小于1.00。這就證明，利用具有內分泌干擾活性的DES進行刺激抑制了這些基因的表達。而且還證明在點樣前變性為單鏈產生更高的信號強度。此外，根據本發明使用Hybond-N和Gene Screen Plus這兩種尼龍膜也獲得了類似的結果。如上所述，利用本發明的索狀、帶狀或盤狀基質可以觀測到與內分泌干擾劑可能影響的基因的表達相對應的信號的明顯變化。因此可以檢測和確定受內分泌干擾劑影響的基因。
(2)將實施例1(1)中制備的帶狀基質放入該儀器，并從一條短邊開始穿過室溫條件下的前預雜交池。再將其置于40℃的預雜交池中，溫育1小時。然后將該基質放在裝有Cy3-標記靶DNA(受體)的40℃的標記受體池中，溫育過夜。清洗該基質，方法是使其穿過室溫條件下的清洗池I，然后穿過68℃條件下的清洗池II。然后將這種帶狀基質放在一種熒光檢測器中，以測量各個點發出的熒光信號。然后對標記受體與配體之間的結合進行分析。結果是獲得了與實施例1中類似的結果。
(3)在一種儀器中對實施例1(1)中制備的盤狀基質進行如上文(2)所述的操作。該儀器與上文(1)中描述的儀器類似，只是該儀器包括一種移動盤狀基質的設備，而不是移動索狀或帶狀基質的設備。對這種盤狀基質上的各個點發出的熒光信號進行測量。然后對標記受體與配體之間的結合進行分析。結果是獲得了與實施例1中類似的結果。
工業實用性本發明提供一種基質和一種測量儀器，用于依次高速測定配體與受體之間的結合。本發明提供一種固定有核酸、糖類、蛋白或肽的索狀、帶狀或盤狀基質，該基質可應用于生化、診斷等不同的領域。此外，利用這種索狀、帶狀或盤狀基質可以在不提高其單位面積的配體密度的條件下高速測定配體與受體之間的結合。因此，本發明能夠高速檢測配體與受體之間的結合。這種高速檢測可以產生與提高基質上的密度相類似的結果。這樣就可以用一種含有低密度配體固定化區域的基質獲得與高密度基質相類似甚至更多的結果。這種基質的制備可以精確而又方便地實現，并且其成本低廉。此外，由于配體的位置可以根據本發明呈單線形排列，所以只需用檢測器檢測配體與受體之間是否存在結合，而無需用檢測器對標記物進行二次掃描測定。在這一點上，本發明也顯得異常方便。
無序列表的文字序列編號1設計的寡核苷酸引物，用于擴增Smad3基因的一部分。序列編號2設計的寡核苷酸引物，用于擴增Smad3基因的一部分。序列編號3設計的寡核苷酸引物，用于擴增VEGF受體基因的一部分。序列編號4設計的寡核苷酸引物，用于擴增VEGF受體基因的一部分。序列編號5設計的寡核苷酸引物，用于擴增ACTR基因的一部分。序列編號6設計的寡核苷酸引物，用于擴增ACTR基因的一部分。序列編號7設計的寡核苷酸引物，用于擴增N-CoR/SMRT基因的一部分。序列編號8設計的寡核苷酸引物，用于擴增N-CoR/SMRT基因的一部分。序列編號9設計的寡核苷酸引物，用于擴增efp基因的一部分。序列編號10設計的寡核苷酸引物，用于擴增efp基因的一部分。序列編號11設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-1基因的一部分。序列編號12設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-1基因的一部分。序列編號13設計的寡核苷酸引物，用于擴增維生素D受體基因的一部分。序列編號14設計的寡核苷酸引物，用于擴增維生素D受體基因的一部分。序列編號15設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-2基因的一部分。序列編號16設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-2基因的一部分。序列編號17設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax基因的一部分。序列編號18設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax基因的一部分。序列編號19設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK1基因的一部分。序列編號20設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK1基因的一部分。序列編號21設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38基因的一部分。序列編號22設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38基因的一部分。序列編號23設計的寡核苷酸引物，用于擴增TRIP1基因的一部分。序列編號24設計的寡核苷酸引物，用于擴增TRIP1基因的一部分。序列編號25設計的寡核苷酸引物，用于擴增ARA70基因的一部分。序列編號26設計的寡核苷酸引物，用于擴增ARA70基因的一部分。序列編號27設計的寡核苷酸引物，用于擴增胰島素受體基因的一部分。序列編號28設計的寡核苷酸引物，用于擴增胰島素受體基因的一部分。序列編號29設計的寡核苷酸引物，用于擴增PDGF受體基因的一部分。序列編號30設計的寡核苷酸引物，用于擴增PDGF受體基因的一部分。序列編號31設計的寡核苷酸引物，用于擴增CSF1受體-2基因的一部分。序列編號32設計的寡核苷酸引物，用于擴增CSF1受體-2基因的一部分。序列編號33設計的寡核苷酸引物，用于擴增FGF受體基因的一部分。序列編號34設計的寡核苷酸引物，用于擴增FGF受體基因的一部分。序列編號35設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38gamma基因的一部分。序列編號36設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38gamma基因的一部分。序列編號37設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bcl-X基因的一部分。序列編號38設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bcl-X基因的一部分。序列編號39設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-3基因的一部分。序列編號40設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-3基因的一部分。序列編號41設計的寡核苷酸引物，用于擴增pS2蛋白基因的一部分。序列編號42設計的寡核苷酸引物，用于擴增pS2蛋白基因的一部分。序列編號43設計的寡核苷酸引物，用于擴增乳鐵蛋白基因的一部分。序列編號44設計的寡核苷酸引物，用于擴增乳鐵蛋白基因的一部分。序列編號45設計的寡核苷酸引物，用于擴增RIP140基因的一部分。序列編號46設計的寡核苷酸引物，用于擴增RIP140基因的一部分。序列編號47設計的寡核苷酸引物，用于擴增TIF2基因的一部分。序列編號48設計的寡核苷酸引物，用于擴增TIF2基因的一部分。序列編號49設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK2基因的一部分。序列編號50設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK2基因的一部分。序列編號51設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax delta基因的一部分。序列編號52設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax delta基因的一部分。序列編號53設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-1基因的一部分。序列編號54設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-1基因的一部分。序列編號55設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-2基因的一部分。序列編號56設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-2基因的一部分。序列編號57設計的寡核苷酸引物，用于擴增Src-1基因的一部分。序列編號58設計的寡核苷酸引物，用于擴增Src-1基因的一部分。序列編號59設計的寡核苷酸引物，用于擴增p300/CBP基因的一部分。序列編號60設計的寡核苷酸引物，用于擴增p300/CBP基因的一部分。序列編號61設計的寡核苷酸引物，用于擴增β-肌動蛋白基因的一部分。序列編號62設計的寡核苷酸引物，用于擴增β-肌動蛋白基因的一部分。
序 列 表序列表<110>寶酒造株式會社<120>用于固定配體的基質<130>662221<150>JP 11-315610<151>1999-11-05<160>62<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Smad3基因的一部分。<400>1caggtgtccc atcggaagg<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Smad3基因的一部分。<400>2ctctctggta gtggtaggga tt 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增VEGF受體基因的一部分。<400>3tacaagatcg acgttagctc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增VEGF受體基因的一部分。<400>4cagccaaatt cacagttaaa 20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增ACTR基因的一部分。<400>5gctttgaaga tataatccga aggt24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增ACTR基因的一部分。<400>6ggcctggtga tgacagagta gataa 25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增N-CoR/SMRT基因的一部分。<400>7tatggaggac cctatgaaag tgta24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增N-CoR/SMRT基因的一部分。<400>8ttacgaccat gttctactag acctt 25<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增efp基因的一部分。<400>9cgccgtgaag acgtgcttgg 20<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增efp基因的一部分。<400>10tcttggtcag gctctgttca atctc 25<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-1基因的一部分。<400>11cgccaagctc gtctca 16<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-1基因的一部分。<400>12tcaactgttc tcgtcgtttc 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增維生素D受體基因的一部分。<400>13caaacgctgt gtggacatcg g 21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增維生素D受體基因的一部分。<400>14ttctggatca tcttggcata gag 23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-2基因的一部分。<400>15gtagtaattc cagcgagagg 20<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-2基因的一部分。<400>16ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax基因的一部分。<400>17tgttttctga cggcaacttc 20<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax基因的一部分。<400>18gagcactccc gccacaa17<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK1基因的一部分。<400>19gagcagaagc aagcgtgac 19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK1基因的一部分。<400>20gacattgatg tacgggtgtt 20<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38基因的一部分。<400>21gtgcccgagc gttacca17<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38基因的一部分。<400>22aaagttcatc ttcggcatct 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增TRIP1基因的一部分。<400>23aaatgctaaa gttcgcctat 20<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增TRIP1基因的一部分。<400>24acatggactc gccgttct 18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增ARA70基因的一部分。<400>25agttgcataa gccgtcac 18<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增ARA70基因的一部分。<400>26actagccaat ctgataggtc 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增胰島素受體基因的一部分。<400>27gctgccacca atacgtcatt 20<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增胰島素受體基因的一部分。<400>28gcatcctgcc catcgaact 19<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增PDGF受體基因的一部分。<400>29tcaccattcc atgccgagta acaga 25<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增PDGF受體基因的一部分。<400>30aggacagtgg gcggtgggta gg 22<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增CSF1受體-2基因的一部分。<400>31ccaccctgaa tgaagtcaac 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增CSF1受體-2基因的一部分。<400>32ggtggatgga ttaagactga 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增FGF受體基因的一部分。<400>33cagactccgg cctctatgct 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增FGF受體基因的一部分。<400>34gggcttccag aacggtcaac 20<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38 gamma基因的一部分。<400>35tgatcgggct gctggacgta ttc 23<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增p38gamma基因的一部分。<400>36agagggcttg cattggtcag gatag 25<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bcl-X基因的一部分。<400>37ccgggagctg gtggttgact tt 22<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bcl-X基因的一部分。<400>38ttcttaccca gccgccgttc t 21<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-3基因的一部分。<400>39gtagtaattc cagcgagagg 20<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增c-Myc-3基因的一部分。<400>40ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增pS2蛋白基因的一部分。<400>41ggcccagaca gagacgtgta 20<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增pS2蛋白基因的一部分。<400>42gctcgatggt attaggatag aa 22<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增乳鐵蛋白基因的一部分。<400>43ggagctgcgc aagtgtaac 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增乳鐵蛋白基因的一部分。<400>44attagtaatg cctgcgacat 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增RIP140基因的一部分。<400>45gcctctttgc ttcagtcatt 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增RIP140基因的一部分。<400>46ttggcttagg tatagtctgg 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增TIF2基因的一部分。<400>47tccaaggcaa gatcacgtct 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增TIF2基因的一部分。<400>48aagccaacga tgaccctaat 20<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK2基因的一部分。<400>49tatagtgtcc aagtggcaga ctcaa 25<210>50<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增JNK2基因的一部分。<400>50atgtatgggt gacgcagagc ttc 23<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax delta基因的一部分。<400>51gatgattgcc gccgtggaca caga24<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Bax delta基因的一部分。<400>52ggtgagcact cccgccacaa agatg 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-1基因的一部分。<400>53ttaaagcccg ctccttcgat gtgac 25<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-1基因的一部分。<400>54ggcggtcggc acctgggtac act 23<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-2基因的一部分。<400>55ggtggccatc aagaagatcc ctaat 25<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增BMK-2基因的一部分。<400>56cctcacgcct tgcatggaag tcct24<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Src-1基因的一部分。<400>57gtatgaatga aggacccaat aactc 25<210>58<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增Src-1基因的一部分。<400>58ctggcaggat ctccgatttg a 21<210>59<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增p300/CBP基因的一部分。<400>59ttcagtcacc aacgtgccaa atatg 25<210>60<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增p300/CBP基因的一部分。<400>60ttagagctgc gggatcaggt gtt 23<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增β-肌動蛋白基因的一部分。<400>61caagagatgg ccacggctgc t 21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設計的寡核苷酸引物，用于擴增β-肌動蛋白基因的一部分。<400>62tccttctgca tcctgtcggc a 2權利要求
1.一種索狀、帶狀或盤狀基質，其表面的預定區域固定有多個不同的配體。
2.權利要求1的基質，其中的配體為核酸、糖類、肽或蛋白。
3.權利要求2的基質，其中的核酸為雙鏈DNAs或單鏈DNAs。
4.權利要求3的基質，其中的DNAs為多核苷酸或寡核苷酸。
5.權利要求1-4的任意一項的基質，該基質可用于高速檢測配體與能夠結合該配體的受體之間的結合。
6.權利要求5的基質，其中，區域間的距離至少為1mm。
7.權利要求5的基質，其中，區域的密度小于100個區域/cm2。
8.權利要求5的基質，其中，區域的密度小于10個區域/cm2。
9.權利要求6-8的任意一項的基質，其中，該基質上的區域數量為100或100以上。
10.權利要求6-8的任意一項的基質，其中，該基質上的區域數量為1000或1000以上。
11.權利要求5-10的任意一項的基質，其中的受體是核酸、糖、肽或蛋白。
12.權利要求11的基質，其中的受體是一種帶標記的受體。
13.一種儀器，用于檢測配體與受體間的結合，該儀器包括a)一種索狀、帶狀或盤狀基質，其表面的預定區域固定有多個不同的配體；b)將基質暴露于至少能結合一種配體的受體的一種設備；以及c)檢測受體與基質上至少一種配體之間發生結合的區域的一種設備。
14.權利要求13的儀器，其中的索狀、帶狀或盤狀基質為權利要求2-12的任意一項所規定的索狀、帶狀或盤狀基質。
15.權利要求14的儀器，其中的受體是一種帶標記的受體。
16.權利要求15的儀器，其中，受體與基質上至少一種配體之間發生結合的區域是通過所述標記來進行檢測。
17.權利要求15或16的儀器，其中的受體是核酸、糖、肽或蛋白。
18.一種儀器，用于檢測配體與受體間的結合，該儀器包括一種設備，用于高速檢測受體與表面預定區域固定有配體的索狀、帶狀或盤狀基質上多個不同配體中的一種配體之間發生結合的區域。
19.權利要求16的儀器，其中的索狀、帶狀或盤狀基質為權利要求2-12的任意一項所規定的索狀、帶狀或盤狀基質。
20.權利要求19的儀器，其中的受體是一種帶標記的受體。
21.權利要求20的儀器，其中，受體與基質上的配體之間發生結合的區域是通過所述標記來進行檢測。
22.權利要求20或21的儀器，其中的受體是核酸、糖、肽或蛋白。
23.一種方法，用于檢測配體和受體之間的結合，該方法包括a)將表面預定區域固定有多個不同配體的索狀、帶狀或盤狀基質暴露于至少能結合其中一種配體的受體；并且b)檢測受體與基質上至少一種配體之間發生結合的區域。
24.權利要求23的方法，其中的索狀、帶狀或盤狀基質為權利要求2-12的任意一項所規定的索狀、帶狀或盤狀基質。
25.權利要求23或24的方法，其中，受體與基質上的配體之間發生結合的區域是以高速檢測。
26.權利要求25的方法，其中的受體是一種帶標記的受體。
27.權利要求26的方法，其中，受體與基質上的配體之間發生結合的區域是通過所述標記來進行檢測。
28.權利要求26或27的方法，其中的受體是核酸、糖、肽或蛋白。
全文摘要
線狀、帶狀或圓盤狀基質，其表面的預定結構域分別固定有多個不同的配體。
文檔編號G01N33/543GK1415073SQ00818184
公開日2003年4月30日 申請日期2000年10月24日 優先權日1999年11月5日
發明者加藤郁之進, 伊豆博幸, 淺田起代蔵 申請人:寶酒造株式會社