長寡核苷酸陣列的制作方法

專利名稱：長寡核苷酸陣列的制作方法
技術領域：
本發明的技術領域是核酸陣列。
背景技術：
核酸陣列在生物技術工業和相關領域中成為越來越重要的工具。多種核酸以陣列或模式(pattern)的形式附著在固相載體表面上形成的核酸陣列具有廣泛的用途，包括藥物篩選、核酸測序、突變分析等。差別基因表達的分析是核酸陣列的一個重要應用，在該分析中比較不同細胞(通常為感興趣的細胞和對照細胞)的基因表達并且確定表達中的任何差異。在這種分析中，差異的存在表明進行比較的細胞所表達的基因類別有差異。
在差別基因表達方法中，可將陣列用作與核酸“探針”片段結合的底物。之后可從用于進行比較的至少兩種不同細胞源，如健康器官和患病器官的類似細胞、組織或器官中獲得“靶”。然后使該靶與固定化的核酸“探針”片段雜交。然后檢測所得的雜交模式之間的差異，這種差異與兩種來源的基因表達的差異有關。
在這種檢測中所使用的陣列，其多種不同的物理參數可對檢測結果產生顯著的影響。核酸陣列的一個可對檢測結果的本質產生明顯影響的物理參數是探針的大小，即陣列中穩固地與固相載體表面結合的單個核酸探針的長度。目前常使用兩種不同類型的陣列(1)cDNA陣列，在該陣列中使用全長或部分cDNA作為探針；(2)寡核苷酸陣列，使用約8-25個核苷酸作為探針。
目前使用的cDNA探針中，基本上全長或其部分片段的雙鏈cDNA穩固地結合于固相載體如尼龍膜的表面上。cDNA陣列的優點包括高靈敏度，它的特征源于cDNA探針與它的靶的高效率結合以及可對這種陣列使用的嚴格雜交和洗脫條件。cDNA陣列的缺點包括難于大規模生產、重復性低等。
寡核苷酸陣列是目前使用的陣列之一，它使用寡核苷酸探針，每個探針的長度約為8-35個核苷酸，通常為20-35個核苷酸。雖然這種陣列在大規模生產中更容易，但是它也有缺點。與cDNA陣列相比這種陣列一個明顯的缺點是它們對靶核酸的靈敏度低。另一缺點是，在給定的步驟中不同探針對相同靶標在雜交效率上的巨大變化，它的特征是對相同的靶需要使用多種寡核苷酸探針，而這種重復顯著地增加了生產這種陣列的成本。
因此，對新的陣列形式的發展保持著興趣。特別感興趣的是整合了cDNA陣列的高靈敏度和寡核苷酸陣列的高生產效率的陣列形式的開發，而且，這種陣列不會有上述cDNA和寡核苷酸陣列所具有的缺點。
發明概要本發明提供了長的寡核苷酸陣列、制備這種陣列的方法以及它們在雜交實驗中的應用。該陣列的特征是陣列中至少有部分探針、通常是所有的探針是長寡核苷酸，如長約50-120nt的寡核苷酸。最好對陣列中的每條長寡核苷酸探針進行選擇，使其在所處條件如嚴格雜交條件中的靶標結合效率高和非特異性結合低。在許多實施例中，對特異性的探針寡核苷酸進行了選擇，使它們對各自的靶標具有基本上相同的雜交效率。本發明陣列可使用于多種用途，如差別基因表達分析。
附圖的簡短描述

圖1用圖方法表示了不同長度的寡核苷酸的雜交效率。
定義本文所用術語“核酸”指由核苷酸組成的聚合物，如天然產生的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它們的人工類似物，這種類似物與肽核酸一樣也具有序列特異性，也能參與Watson-Crick型雜交反應等。
本文所用術語“核糖核酸”指由核糖核苷酸組成的聚合物。
本文所用術語“脫氧核糖核酸”和“DNA”指由脫氧核糖核苷酸組成的聚合物。
本文所用術語“短寡核苷酸”指長約50-150個核苷酸、通常長約50-120個核苷酸的單鏈核苷酸多聚體，如50-150個核苷酸、50-120個核苷酸等。
本文所用術語“多核苷酸”指由超過約150個核苷酸、最多約5000個核苷酸組成的單鏈或雙鏈聚合物。
術語“寡核苷酸探針組合物”指由陣列上對應于靶核酸的各個探針組成的核酸組合物。因而，本發明陣列的寡核苷酸探針組合物是多種長寡核苷酸的核酸組合物，其中，根據組成該探針組合物的長寡核苷酸，該組合物可以是同種的或異種的，即探針組合物中的每條長寡核苷酸可以具有相同的序列，這樣該探針組合物是相同的，或者每個探針組合物由兩種以上不同的長寡核苷酸組成，這樣探針組合物在序列上各不相同。
術語“靶核酸”指針對于陣列上一種或多種相應的寡核苷酸探針組合物即探針寡核苷酸位點的核酸。靶核酸可由陣列上一種或多種不同的寡核苷酸探針反映。靶核酸是用陣列進行檢測的樣品中感興趣的核酸，此處“感興趣”指樣品中靶標的存在或缺乏提供了關于獲得該樣品的細胞的遺傳特性的有用的信息，如唯一的和確定的特征。同樣，靶核酸不是多種不同細胞類型中存在的、其存在或缺乏不能提供關于特殊的細胞遺傳特性的特征性信息的管家基因或其它類型的基因。
術語“背景”或“背景信號強度”指來自帶標記的靶標對陣列中底物成分的非特異性結合的雜交信號。背景信號也可由陣列成分自身的固有熒光產生。單一的背景信號可用于全陣列的計算，或者不同的背景信號可每一個靶核酸的計算。
術語”非特異性雜交“指靶核酸對陣列表面上的核酸如陣列表面上探測位點的長寡核苷酸探針、陣列表面上對照位點的核酸等的非特異性結合或雜交，其中靶標和探針基本上不互補。
特殊實施例的描述本發明提供了長寡核苷酸陣列、制備這些陣列的方法和這些陣列在雜交實驗中的應用。本發明陣列的特征是陣列中至少有一部分或片段、一般有大多數或基本上全部探針以及通常全部探針是長寡核苷酸，如長約50-120nt的寡核苷酸。最好對陣列上的每一條長寡核苷酸進行選擇，使陣列在處于如嚴格的條件下具有高靶標結合效率和低非特異性雜交。在某些實施例中，該陣列還具有陣列上各不同探針對各自靶標具有基本上相同的雜交效率的特征。在對本發明的進一步描述中，首先總述此陣列。接著描述制備這些陣列的方法。之后給出可能使用本發明陣列的代表性應用的綜述。
在進一步描述本發明前，應理解本發明不受下面所述的具體實施例限制，可在所附的權利要求的范圍內對具體實施例作出修改。還應理解所使用的術語是用于描述具體的實施例，而非限制性。本發明的范圍由所附的權利要求確立。
在本說明書和所附的權利要求書中，單數形式的“一”和“這(個)”包括復數形式，除非文中有清楚的表示。除非有其它的定義，否則本文所用的所有技術的和科學的術語與本發明所屬領域的普通技術人員所理解的相同。本發明的陣列——總述本發明陣列具有大量的穩固地與固相載體表面結合的探針位點。本發明陣列的一個特征是陣列上至少有一部分探針位點、較佳基本上所有的探針位點是探針寡核苷酸位點，其中，各探針寡核苷酸位點含有由多種特性的、通常已知其序列的長寡核苷酸組成的寡核苷酸探針組合物，下文將給出更詳細的描述。本發明陣列的探針位點如上所述，本發明的特征是探針位點的性質，即陣列上至少有一部分、通常基本上所有的探針位點由長寡核苷酸的探測核酸組合物組成。基質表面上的各探針位點由長寡核苷酸探針組成，其中，根據位點上長寡核苷酸探針的性質，該位點可以是同種的或異種的，如美國專利申請09/417268中所述的，該申請的公開納入本文作為參考。該寡核苷酸探針組合物的一個特征是該探針組合物由長寡核苷酸組成。因此，探針組合物中寡核苷酸探針的長度約為50-150nt，通常約為50-120nt，更通常約為60-100nt，在許多較佳實施例中，該探針的長度約為65-85nt。換言之，在各探針位點或組合物中，組成該探針位點或組合物的各單獨探針的長度在上述范圍之內。
除了上述長度特征外，組成上述探針位點的長寡核苷酸探針通常具有本發明以下許多較佳實施例一個或多個特征。組成本發明陣列的長寡核苷酸探針的另一特征是通過選擇它們的序列，使它們在嚴格的條件下與它們的互補靶標的結合效率高。結合效率指陣列所處的雜交條件下探針結合到它的靶標的能力。換言之，結合效率指在進行雜交實驗后由給定探針和其靶標獲得的雙鏈產率(duplexyield)。在許多實施例中，陣列表面上具有高結合效率的探針與它們的靶標的結合效率為0.1％，通常至少為0.5％，更通常至少為2％。
此外，通過選擇長寡核苷酸探針的序列，以使該探針對嚴格條件下基本上不與之互補的靶核酸具有低的非特異性雜交或非特異性結合，即不希望的交叉雜交。使用BLAST程序及其默認設置進行測定，可認為靶標中與給定探針的同源性少于60％、更通常少于50％、最通常少于40％的靶標是基本上不與給定探針互補的靶標。在某些實施例中，具有低非特異性雜交特征并在本發明陣列中使用的寡核苷酸探針是那些與不互補的核酸，即其它基本上不互補的靶標的雜交能力是它們與與之互補的靶標的雜交能力的10％以下、通常5％以下、較佳1％以下的探針。例如，在并肩雜交實驗中，具有低非特異性雜交特征的探針是那些在與不含有該探針的互補靶標的靶標組合物接觸時，若產生，則所產生的信號是該相同探針與含有其互補靶標的靶標組合物接觸時所產生的信號的約10％以下、通常約3％以下、更通常約1％以下的探針。
此外，對給定位點的長寡核苷酸進行選擇，使陣列上每一條長寡核苷酸探針或至少其靶特異性序列與陣列上任何其它不同的獨特的長寡核苷酸，即陣列上具有不同堿基序列的任何其它寡核苷酸探針不同源。換言之，在嚴格的條件下(如下面所定義的)，對應于第一靶標的探針組合物的每一條不同的寡核苷酸不與任何對應于不同靶標的探針組合物的不同的獨特的寡核苷酸，即呈現在陣列上的任何其它寡核苷酸探針組合物的寡核苷酸交叉雜交，或者與其有相同的序列。因此，探針組合物的每一條獨特的寡核苷酸的有義或反義核苷酸序列與陣列中對應于不同靶標的探針組合物中的任何其它不同的寡核苷酸的同源性小于90％，通常小于70％，更通常小于50％，其中，使用FASTA程序及其默認設置進行序列分析比較確定同源性。探針組合物中獨特寡核苷酸的序列不是在大量不同的基因(至少2種)中發現的保守序列，其中，保守序列定義為至少有90％序列同一性的長約15-150個核苷酸的序列，如上面所述測定序列同一性。
如下面所述進一步表征各探針組合物的寡核苷酸或至少這些寡核苷酸中與它們的預定靶標互補的那一部分，即它們的靶特異性序列。首先，它們的GC含量約為35-80％，通常約為40-70％。其次，它們基本上缺乏(a)次級結構，如自身互補的區域(如發夾結構)、由分子內雜交事件形成的結構；(b)長的均聚物鏈，如多聚A鏈，即在任何給定的均聚物鏈中，鄰接的相同核苷酸堿基數不超過5；(c)富含重復基元的長鏈，如GAGAGAGA、GAAGAGAA等；(d)富含單嘌呤或單嘧啶基元的長鏈；等等。
本發明的長寡核苷酸探針可僅由如上所述的靶特異性序列組成，如所設計的或呈現的用來與其對應靶標雜交的序列，或者將本發明探針修改成含有一種或多種非靶標互補功能區或區域，如在該探針的一個或兩個末端存在這種功能區，它們具有許多作用，包括與基質表面的連接、將所需的構象結構導入探針序列等。一個可存在于本發明陣列的長寡核苷酸探針中的一個或兩個末端的可任選的功能區或區域是富含胸苷堿基的區域，如寡dT區域，其中，該區域中的核苷酸數可以較高，但一般不超過約25個，通常不超過約20個，該區域中的核苷酸如果不全部是則至少在相當大比例上含有胸苷堿基，其中，以數量比計，相當大比例指至少約占該寡dT區域中所有核苷酸的50％、一般至少約占70％、更一般至少約占90％。可使用下式描述本發明這個實施例的某些探針，即T富含區域是寡dT功能區的探針Tn-Nm-Tk；其中，T是dTMP；Nm是該探針的靶特異性序列，其中N是dTMP、dGMP、dCMP或dAMP中的任何一個，m為50-100；n和k獨立地表示0-15，當存在n和/或k時，它們較佳為5-10。
在本發明又一實施例中，通常除了上述T富含功能區外，本發明探針還可含有賦予該探針一所需的受限結構(constrained structure)的功能區，如賦予該探針一固定的或具有受限構象的結構。在許多實施例中，探針含有側接于靶特異性功能區的任一端并能賦予該探針一發夾環結構的功能區，從而將該靶特異性序列控制在受限或限定構象中，這使得使用時對對應靶標的結合特性提高。在這些實施例中，該探針可以由下式描述Tn-Np-Nm-No-Tk其中T是dTMP；N是dTMP、dGMP、dCMP或dAMP；m是50-100的整數；n和k分別為0-15，其中，當n和/或k存在時較佳是5-10，在許多實施例中，k＝n＝5-10，更佳為10；p和o獨立表示5-20，通常為5-15，更通常約為10，在許多實施例中，p＝o＝5-15，較佳為10；
Nm是靶特異性序列；No和Np是自身互補序列，如它們彼此互補，這樣在雜交條件下該探針形成發夾環結構，在該結構中，No和Np構成桿結構，靶特異性序列即Nm構成環結構。
由陣列上每個寡核苷酸探針位點組成的寡核苷酸探針組合物基本上、通常全部沒有非核酸物質，即該探針組合物不含有在細胞中發現的非核酸生物分子如蛋白質、脂質和多糖，或者不由這些物質組成。換言之，陣列的寡核苷酸位點如果不是全部則基本上沒有非核酸細胞構建物。
該寡核苷酸探針可以是核酸如RNA、DNA，或者是核酸類似物如以一些方式如通過修飾骨架、糖殘基、堿基等與天然產生的核酸不同的核酸，如含有非天然產生的雜環含氮堿基、肽核酸、密閉核酸(locked nucleic acid)〔見Singh&Wengel，Chem.Commun.(1998)1247-1248〕等。但是，在許多實施例中，核酸不被對連接到陣列的基質表面是必需的功能試劑如氨基功能試劑、生物素等修飾。
由上述長寡核苷酸組成并呈現在陣列上的寡核苷酸探針位點可以是任何方便的形狀，但通常是環狀、橢圓狀、卵形或其它一些類似的彎曲形狀。在使用該陣列進行實驗期間，各位點存在的寡核苷酸的總量或總質量將足以產生足夠的雜交和進行靶核酸的檢測。通常，各位點中的寡核苷酸的總質量至少約為0.2ng，通常至少約為0.5ng，更通常至少約為1ng，其中，總質量可以是100ng以上，但通常不超過約20ng，更通常不超過約10ng。位點中所有的寡核苷酸的拷貝數將足以產生足夠的靶分子雜交位點，以產生可檢測的信號，該拷貝數一般約為0.01-10fmol，通常約為0.005-5fmol，更通常約為0.01-1fmol。對于由兩種以上具有不同序列的不同寡核苷酸組成的位點，各位點中不同寡核苷酸的摩爾比或拷貝數比可以大約相等或不等，其中，當各位點中獨特的寡核苷酸之比不相同時，該比值的大小一般至少為2-5，當通常不超過10。對于全部是環狀的位點，該位點的直徑一般約為10-5000μm，通常約為20-1000μm，更通常約為50-500μm。各位點的表面積至少約為100μm2，通常至少約為200μm2，更通常至少約為400μm2，該表面積可能在25mm2以上，總的來講不超過約5mm2，通常不超過約1mm2。陣列特征本發明陣列的特征是大量上述位點穩固地與固相載體的表面結合。陣列上探針位點的密度以及全部探針性和非探針性核酸位點的密度(下文將更詳細地描述后者)可以有很大的變化。本文所用術語核酸位點指陣列表面上由核酸組成的任何位點，因此這類位點包括探針性核酸位點和非探針性核酸位點。固相載體表面上的核酸位點至少約為5/cm2，通常至少約為10/cm2，可能在1000/cm2以上，但是在許多實施例中，該值不超過約1000/cm2，并且在這些實施例中通常不超過約400/cm2或400/cm2，而在某些實施例中不超過約300/cm2。這些位點可以以空間限制和物理上可尋址的方式排列，以任何方便的模式交叉或覆蓋于陣列表面上，如以形成格柵的行和列排列、以圓形模式等，通常，位點的模式是在固相載體表面上交叉形成格柵的形式。
在本發明陣列中，該模式的位點與固相載體的表面穩固地結合，其中，載體可以是柔性的或剛性的載體。“穩固地結合”指在雜交和洗滌條件下位點上的寡核苷酸維持與固相載體的相等位置。因而，可以在本領域熟練技術人員周知的技術基礎上使組成這些位點的寡核苷酸與載體表面以非共價或共價方式穩固地結合。非共價結合的例子包括非特異性吸附、基于電子靜電力的結合(如離子、離子對相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用、通過特異性結合配體共價連接到載體表面的特異性結合等。共價結合的例子包括位點寡核苷酸與剛性載體表面上的功能性基團如-OH之間形成的共價鍵，其中，該功能性基團可以是天然產生的基團，或者是以導入的連接基團呈現的基團。在許多較佳實施例中，陣列表面上組成這些位點的核酸或至少探針性位點的長寡核苷酸與載體表面共價連接，如通過探針上的部分(如胸苷堿基)和基質表面之間形成的共價連接等。
如上面所述，陣列存在于柔性或剛性基質上。柔性指載體能夠彎曲、折疊或進行類似的操作而不斷裂。本發明柔性固相載體的固體物質例子包括膜、柔性塑料膜等。剛性指載體是固體并且不容易彎曲，即載體是非柔性的。因此，本發明陣列的剛性基質在實驗條件下足以給存在于其上的聚合的靶標提供物理的支撐和結構，尤其是在高通量處理條件下。此外，當本發明的剛性載體彎曲時，它們易于斷裂。
其上存在本發明陣列中的本發明模式的位點的固相載體可采取許多構型，從單一的到復雜的，具體取決于該陣列的預期用途。因而，該基質可以是完全的片狀或盤狀構型，如長方體或圓盤形。在許多實施例中，該基質是長方體橫截面形，長約10-200mm、一般約40-150mm、更一般長約75-125mm，寬約10-200mm、一般約20-120mm、更一般寬約25-80mm，厚約0.01-5.0mm、一般約0.1-2mm、更一般約0.2-1mm。因而，在一個代表性實施例中，該載體是微滴定板形式，大小約為12×85mm。在另一代表性實施例中，該載體是標準顯微鏡載片，大小約為25×75mm。
可使用許多材料制作本發明陣列的基質。理想的是，用來制作基質的材料在雜交事件中具有低水平的非特異性結合。在許多情況中，使用對可見光和/或UV透明的材料也是較佳的。對于柔軟的基質，感興趣的材料包括修飾的和未修飾的尼龍、硝基纖維素、聚丙烯等，其中在此實施例中特別感興趣的是尼龍膜及其衍生物。對于剛性基質，感興趣的特殊材料包括玻璃，塑料如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和它們的化合物等，金屬如金、鉑等，等等。還感興趣的是復合材料，如包了膜的玻璃或塑料，如尼龍或硝基纖維素等。
本發明陣列的基質含有至少一個存在該模式的位點的表面，該表面可以是光滑的或基本上平坦，或者是不規則的，如凹下或凸起。可使用一種或多種不同的化合物層修飾存在該模式的位點的表面，以所需的方式修改該表面的特性。這種修飾層在存在時一般有單分子層厚度到約1mm厚，通常有單分子層厚度到約0.1mm厚，更通常有單分子層厚度到0.001mm厚。感興趣的修飾層包括無機層和有機層，如金屬、金屬氧化物、聚合物、小有機分子等。感興趣的聚合層包括肽層、蛋白質層、聚核酸層或它們的類似物，如肽核酸等，多糖、磷脂、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳撐硫化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯、聚丙烯酰胺等，其中，該聚合物可以是雜聚物或均聚物，可以具有或不具有分離的功能性部分連接在其上面，如共軛的。
基質上位點的總數可以改變，這將根據個人希望在其表面上含有不同寡核苷酸探針位點(寡核苷酸探針組合物)的數目、以及非探針位點如對照位點、定向位點、校準位點等的數目而變，同樣也可根據可能使用本發明陣列的具體應用而改變。通常，存在于該陣列表面上的模式將含有至少約10個不同的核酸位點，一般至少含有約20個核酸位點，更一般約含有50個核酸位點，其中，核酸位點的數目可以為10000以上，但通常不超過約5000個核酸位點，更通常不超過3000個，在許多例子中不超過2000個。在某些實施例中，較佳的是每個不同的探針位點或探針組合物以雙份存在，即這樣針對給定靶標陣列上將具有兩份探針位點。在某些實施例中，呈現于陣列表面上的各靶標僅僅由單一類型的寡核苷酸探針呈現。換言之，陣列上針對給定的呈現于其上的靶標的所有寡核苷酸探針具有相同的序列。在某些實施例中，位點的數目約為200-1200個。陣列中存在的探針位點的數目一般占該陣列上核酸位點的總數的相當大比例，以數量計，在許多實施例中，探針位點至少約占陣列中核酸位點總數的50％、一般至少約為80％、更一般至少約為90％。同樣，在許多實施例中，陣列上探針位點的總數約為50-20000，一般約為100-10000，更一般約為200-5000。
在本發明的陣列中(尤其是那些設計使用在高通量應用的陣列，如高通量分析應用)，該陣列可存在單一模式的寡核苷酸位點，或者該陣列可含有多種不同的寡核苷酸位點模式，各模式如上所定義。當存在多種不同寡核苷酸位點模式時，這些模式可以彼此相同，這樣該陣列表面上含有兩種或多種相同的寡核苷酸位點模式；或者該寡核苷酸位點模式可以不同，如在其表面上存在兩種或多種不同類型靶核酸的陣列，比如具有與人基因相對應的位點模式和與鼠基因相對應的位點模式的陣列。對于存在大量位點模式的陣列，不同位點模式的數目至少為2個，一般至少為6個，更一般至少為24個或96個，其中，不同模式的數目一般不超過384個。
對于在其表面上含有大量寡核苷酸位點模式的陣列，它較佳含有大量的反應室，其中，各個室具有與寡核苷酸位點模式結合的底部表面和至少一面壁，通常大量的壁圍繞著底部表面。例如參見美國專利5545531，該專利的公開納入本文作為參考。在許多實施例中特別感興趣的陣列是在其表面上有復制了24或96個不同反應室的相同模式的位點交叉的陣列。
在陣列上位點的任何給定模式中，可以存在對應于給定靶標的單一位點，或多種對應于相同靶標的不同位點，其中，當存在多種對應于相同靶標的不同位點時，各位點上對應于相同靶標的探針組合物可以相同或不同。換言之，大量不同的靶標呈現在該模式的位點中，各靶標可以對應于單一的位點或多種位點，其中，對應于相同靶標的多種位點中的寡核苷酸探針組合物可以相同或不同。當陣列中存在對應于相應靶標的多種(相同或不同組合物的)位點時，這些種類的位點的數量至少約為2，可以為10，但一般不超過5。但是，如上面所述，在許多較佳實施例中，任何給定的靶核酸僅由單一類型的探針位點呈現，它可能在陣列表面上僅呈現一次或多次，如呈現兩次、三次等。
呈現在陣列上的不同靶標的數目至少約為2，一般至少約為10，更一般至少約為20，其中，在許多實施例中，呈現在陣列上的不同靶標如基因的數量至少約為50，更一般至少約為100。呈現在陣列中的不同靶標的數目可以高達5000或更高，但在許多實施例中一般不超過3000，更一般不超過2500。一個靶標，如果它能與陣列上的一個或多個探針組合物雜交，則認為它被呈現在該陣列中。
本發明的另一特征是每條不同的長寡核苷酸探針對它們各自的靶標的相對結合效率基本上相同，這樣陣列上任何兩種不同的長寡核苷酸探針對它們各自的靶標的結合效率之間的差異不會超過約20倍，一般不超過約15倍，更一般不超過約10倍，其中，在許多實施例中，結合效率之間的差異不超過約5倍，較佳不超過約3倍。
在本發明某些較佳實施例中，陣列中含有長寡核苷酸探針組合物的各個探針位點對應于相同的基因，即都具有一些共同特征的基因，或基于一些共同的特征如器官、組織的種類或細胞來源、功能性角色、疾病關系等而劃分在一起的基因。在這個實施例中，對應于陣列上不同探針位點的各不同靶核酸是相同的類型，即是相同類型的基因的編碼序列。因此，本發明此實施例的陣列是個特殊的陣列類型。本發明提供了許多特殊的陣列類型。感興趣的特殊的陣列類型包括人、癌癥、凋亡、心血管、細胞周期、血液、小鼠、人應激、小鼠應激、致癌基因和腫瘤抑制劑、細胞-細胞相互作用、細胞分裂素和其受體、大鼠、大鼠應激、血液、小鼠應激、神經生物學等。
對于對應于基因的特殊類型或種類的寡核苷酸探針，類型或種類可指多種不同的特征性特征，這些特征包括種類特異性基因，其中，感興趣的特殊種類包括真核生物(如小鼠、大鼠、兔、豬、靈長類動物、人等)、功能特異性基因(這些基因包括致癌基因、凋亡基因、細胞分裂素、受體、蛋白質激酶等)、對具體生物過程特異的或涉及這些過程的基因(如凋亡、分化、應激反應、老化、增殖等)、細胞機制基因(如細胞周期、信號傳導、毒性化合物的代謝等)、與疾病相關的基因(如涉及癌癥、精神分裂癥、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、病毒-宿主相互作用和傳染病等的基因)、位點特異性基因(其中，位點包括器官，如心臟、肝、前列腺、肺等)、組織(如神經、肌肉、結締組織等)、細胞(如軸突、淋巴細胞等)或亞細胞位置(如細胞核、內質網、高爾基復合體、內涵體、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、細胞質、細胞骨架、質膜、細胞外空間、染色體特異性基因)、隨著時間而改變表達水平的特殊基因(如在疾病的發展過程中以不同水平表達的基因，包括在前列腺癌的發展期誘導或表達的前列腺基因)。
除了含有該寡核苷酸探針組合物的寡核苷酸位點(即寡核苷酸探針位點)外，本發明陣列可以含有一種或多種額外的多核苷酸或核酸位點，這種位點不與上述靶核酸對應，例如呈現在陣列是特殊類型的那些實施例的陣列上的基因類型或種類的靶核酸。換言之，陣列可含有一種或多種非探針核酸位點，這些位點由非“獨特”寡核苷酸或多核苷酸，即普通的寡核苷酸或多核苷酸組成。例如，陣列中可提供含有基因組DNA的位點，這些位點可用作取向標記。可以存在含有質粒和噬菌體基因、從相同或另一物種得到的不表達也不與cDNA靶交叉雜交的基因等的位點，并將其用作陰性對照。此外，可以存在含有與得自相同或另一物種的管家基因或其它對照基因互補的大量寡核苷酸的位點，在使用陣列檢測樣品中雜交信號強度的mRNA豐度和標準的歸一化中使用該位點。陣列中還可存在取向位點，這些位點被用來簡化雜交模式的影像分析。其它類型的位點包括用于校準或定量標準的位點、用于RNA模板(靶)完整性的對照、用于靶的制備效率措施(如標記、純化和雜交的效率)的對照等。后一類型的這些位點與寡核苷酸探針位點有區別，即它們不是探針位點。陣列制備可采用任何方便的方法制備本發明陣列。制備本發明陣列的一個方法是，首先合成各位點的寡核苷酸，接著將該寡核苷酸沉積到載體表面上作為位點。可采用任何方便的方法制備該寡核苷酸，其中特別感興趣的是使用亞磷酰胺的化學合成方法或類似的方法，這些方法不使用聚合酶，將單個堿基依次加入，如固相自動合成方法等，本領域熟練技術人員周知這些方法。
在確定探針組合物中的特殊寡核苷酸時，應選擇能與靶核酸區域或基因的獨特序列雜交的寡核苷酸。可使用不同的方法選擇與寡核苷酸探針雜交的基因的獨特區域。因而，人們可使用基于感興趣基因的可獲得性的任意方法。但是，也可采用合理的設計方法替代基于感興趣基因的可獲得性的任意方法來選擇用于雜交陣列的最佳的序列。較佳的是，在下述標準的基礎上選擇制備寡核苷酸探針中所選擇的基因的區域。首先，選擇作為靶特異性的序列應產生不與存在在陣列上、不與該靶基因對應的其它位點的任何其它寡核苷酸探針發生交叉雜交或相同源的寡核苷酸探針。第二，應選擇與其它任何基因中的核苷酸序列的同源性低的寡核苷酸探針的序列，而不論該基因是否存在于得自相同來源物種的陣列上。這樣，被避免的基因包括高表達的基因產物、結構性RNA、用陣列進行檢測的RNA樣品中發現的重復序列和載體中發現的序列。另一考慮是選擇具有最少或沒有次級結構、具有進行最佳雜交但非特異性結合低的結構、具有相同或類似的熱穩定性和最佳雜交特征的序列。最后一個考慮是選擇產生與其對應靶標有效地雜交并且不發生大量的非特異性雜交事件的探針的探針序列。最后，陣列上所有的探針序列較佳為與它們的對應探針的雜交效率基本上相同的序列，其中，任何兩個探針與它們的對應靶標之間的雜交效率的差異較佳不超過約10倍，更佳不超過約5倍，最佳不超過約3倍。
可采用任何方便的方法設計或鑒別出符合上述標準的探針。一個代表性的方法包括下述算法或步驟，這些規則或步驟是本發明的一部分。在選擇本代表性算法或步驟的探針時，首先在序列同源性研究算法(在未授權申請09/053375中有詳細描述，該申請的公開本文納入作為參考)的基礎上鑒別獨特的基因特異性或靶特異性序列(每個基因的一個或多個區域)。在這個步驟中，為了選擇對即將呈現在陣列上的各mRNA或靶標獨特的mRNA片段，在GenBank中尋找所有在即將制備的陣列上呈現的基因的序列和所有沉積的序列。獨特的序列定義為至少不與陣列上任何其它序列具有顯著同源性的序列。例如，對鑒別合適的長80個堿基的獨特序列感興趣的，可以選擇與陣列上任何其它探針的任何連續40個堿基不具有超過80％同源性的序列。這個步驟一般得到相對于鑒別用于各特異性靶標的可能序列的原始種類減少了的候選探針序列。
在這些種類減少的候選序列中，使用篩選標準進行篩選，以排除不是最佳的序列，在該步驟中被排除的序列包括(a)具有強的次級結構或自身互補(例如長發夾)的序列；(b)GC含量非常高(超過70％)或非常低(少于40％)的序列；(c)具有長的(超過6個)相同連續堿基或長的富含一些基元、嘌呤或嘧啶或特殊堿基如GAGAGAGA…、GAAGAGAA等的序列。這個步驟得到種類進一步減少的候選探針序列。
下一步，選擇具有類似的熔化溫度或熱力穩定性的序列，這種序列在與靶核酸的雜交實驗中具有類似的性能。感興趣的是能參與形成雙鏈、熔化溫度超過65℃、一般至少約為75℃、更一般至少約為80℃的探針的鑒別。
本代表性設計步驟中的最后一步是，從余下的序列中選出具有低水平非特異性雜交和與互補的靶分子具有類似的高效率雜交的序列。實施下列步驟實現這個最后的選擇1.使用上述步驟鑒別的針對各靶標的余下探針，可采用下述方法從實驗上表征其雜交效率和參與非特異性雜交事件的傾向性，這些余下的探針一般包括至少1個可能的探針、通常至少有2個可能的探針，更通常有至少3個可能的探針。
2.首先，制備在最終的陣列上至少呈現一部分針對各靶標的候選探針的陣列。例如，將已鑒別出的針對特殊的靶序列的3個候選探針連接到固相載體的表面上，連同針對其它靶標的候選探針一起產生實驗探針陣列。
3.接著，制備標準對照靶標組，其中，該組中各靶標與陣列中的一個探針序列互補，并且該組中不同靶標構建物以類似或相同的量混合。對照靶標組中靶標的數目一般少于陣列中探針的數目。通常，對照組中靶標的數目是陣列表面上實驗探針的50-90％，但可以是10-100％。因此，實驗陣列上不是所有的探針序列在靶標對照組中都有對應的或互補的的靶標。例如，對于已鑒別出針對10種不同mRMNA靶標中每一種的3種候選探針，可制備具有30種不同寡核苷酸探針的實驗探針陣列。接著，生產包括對應于呈現在陣列上10種不同mRNA靶標中的5種的對照組靶標核酸，其中，對照組包括與呈現在該對照組中5個不同mRNA中的1個對應的各不同探針互補的靶標，即對照組包括15個不同的靶標——陣列上對應于呈現在對照組中的5個不同mRNA的15個探針中的每一個有1個針對它的靶標。(雖然使用對應于少于陣列上所有探針的靶標種類描述上述方法，這樣可以檢測非特異性雜交，但是也可使用其它方法。例如，可使用一類對應于陣列上所有的探針的靶標，其中，至少有一部分靶標與余下的部分不同，如在標記、質量等方面不同。雜交后，可檢測到雜交到各探針上的靶標，可測定針對其真正靶標的探針的效率及其進行非特異性雜交的傾向性)。
4.在產生對照組的靶標后，在嚴格的條件下使該對照組與實驗探針陣列雜交，并檢測雜交信號。使用在雜交溶液中具有對應的標記互補靶標的這些探針的信號強度作為測定該探針的雜交效率的方法，以及針對不同靶標的不同候選探針的雜交效率的差異。對于陣列上那些在對照組中沒有互補的標記靶標序列的探針，使用由這些探針中的每一條產生的雜交信號強度來確定表征這些探針的非特異性雜交。
5.為了獲得關于雜交效率以及針對陣列上候選探針的各個候選物的非特異性雜交的水平的全面信息，使用一種或多種額外的靶核酸對照組重復進行上述步驟。在此步驟中使用的不同的對照靶標組的數量一般至少為2個，更一般至少為4個，最一般至少為10個。
6.從上述的步驟中，鑒別出滿足下述標準的探針序列，將其用作本發明陣列的長寡核苷酸探針。首先，鑒別出對它們的對應靶標的雜交效率高的候選探針。在許多實施例中，鑒別出對它們各自靶標具有基本上相應的雜交效率的候選探針。其中，如果任何兩個探針對它們各自靶標的雜交效率的差異不超過10倍，則認為這兩個探針具有基本上相同的雜交效率，該差異小于約5倍并且常小于約3倍較佳。在這些已鑒別的探針中，排除了具有顯著的交叉雜交或非特異性雜交的探針，其中，具有小于該探針和它的對應靶標之間的基因特異性雜交的水平的至少5倍、更通常20倍、最通常50倍的非特異性雜交的探針在此步驟中被排除。換言之，在上述雜交實驗中，那些信號少于由探針和它們的互補靶標產生的信號的5倍、一般至少少于20倍、更一般少于50倍的探針被排除，因為它們具有不可接受的參與非特異性雜交事件的高傾向性。
使用上述算法或步驟設計存在于本發明陣列上的長寡核苷酸探針。如果在第一輪選擇用于特殊靶標的探針時沒有鑒別出陣列候選探針，那么可重復進行步驟1-6。一旦鑒別出該探針的設計或序列，可采用任何方便的方法合成長寡核苷酸探針，如上面所述的用亞磷酰胺方法。
在合成本發明長寡核苷酸探針之后，使該探針穩固地連接在固相載體上。這一部分的制備過程一般涉及探針如探針的溶液在基質的表面上的沉積，其中，沉積過程可以與共價連接步驟一起進行，或者分開進行，這取決于探針怎樣穩固地連接到基質的表面上，如經由電子靜電相互作用、共價鍵等。可采用任何方便的方法將所制備的寡核苷酸存放到載體上，這些方法包括人工技術(如使用微型移液管、噴墨、針頭等)和自動方法。特別感興趣的是自動定點設備的使用，如BioGridArrayer(Biorobotics)。
在需要時，可使用多種方法將該長寡核苷酸共價連接到基質的表面上。例如，可將功能活性基團如氨基等導入寡核苷酸的5′或3′端，然后使這些導入的官能團與基質上的活躍的表面基團反應，產生共價連接。在某些較佳的實施例中，使用下述方法將該長寡核苷酸探針共價連接到基質的表面上。在此方法中，探針在變性條件下共價連接到基質表面上。一般而言，制備各探針的變性組合物，然后將其沉積基質的表面上。變性組合物指存在在組合物中的探針分子不具有次級結構，如通過自身雜交或與組合物中的其它分子雜交。變性組合物一般是液態組合物，可以是抑制互補的核苷酸堿基之間的形成氫鍵的任何組合物。因而，感興趣的組合物是那些包括變性劑如脲、甲酰胺、硫氰化鈉等的組合物，以及高pH值(如12-13.5、一般為12.5-13)或低(如1-4，一般為1-3)的溶液等。在許多較佳實施例中，該組合物是長寡核苷酸的強堿性溶液，該組合物含有堿，如氫氧化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化四甲銨、氫氧化銨等，這些組合物的量足以使該組合物具有高pH值，如12.5-13.0。組合物中長寡核苷酸的濃度一般約為0.1-10μM，通常約為0.5-5μM。將變性組合物中的長寡核苷酸沉積到基質表面上后，將該存放的探針暴露在足夠波長(如250-350nm)的UV輻照中，以使該沉積的探針與基質的表面交聯。本方法使用的輻照波長一般約為50-1000摩焦耳，通常約為100-500摩焦耳，暴露持續時間一般約為20-600秒，通常約為30-120秒。
采用上述共價連接方法產生長寡核苷酸探針與基質表面在探針的一個或多個連接位點上的隨機共價連接，如上面所述，通過在該寡核苷酸的一個或多個末端加入寡dT區域可任選地增強這種連接。上述方法一個重要的特征是在本發明方法中不使用天然產生的寡核苷酸上不存在的活性部分如氨基。因此，本發明方法適合使用不含有天然產生的核酸上不存在的部分的寡核苷酸。
上述共價連接方法可使用多種不同類型的基質。因而，上述方法可使用固相載體，如玻璃、塑料、膜如尼龍等。可修飾該表面，或不修飾。例如，尼龍表面可以帶中性電荷或正電荷，這些表面可從大量的商業來源獲得。在許多實施例中的玻璃表面被修飾，如被修飾成帶有活性官能團如氨基、異硫氰酸苯酯等。使用本發明陣列的方法本發明陣列可使用在多種不同用途中，在這些用途中，感興趣的是檢測靶核酸和陣列上的探針之間的一件或多件連接事件的發生，以及之后描述連接事件的發生與樣品中靶標的存在之間的聯系。通常，在其量足夠樣品中的所有靶標與陣列上存在的互補寡核苷酸結合的條件下，該設備將與懷疑含有靶標的樣品接觸。通常樣品是液體樣品，通過將適當體積的該液體樣品倒到陣列表面上而實現接觸，其中，可通過輸送通道、直接接觸、沉積等類似方法將樣品倒入。標記的靶標的產生可采用本領域已知的方法產生靶標，可將mRNA標記并且直接用作靶標，或將其轉化成標記的cDNA靶標。或者，過量地與陣列上的探針互補的合成的標記寡核苷酸靶標可與mRNA雜交，接著從雜交部分中分離出任何未結合的靶標或分離出雜交的部分。然后將雜交的部分雜交到陣列上，以揭示獲得該mRNA的細胞來源的表達模式。一般地，直接使用化學的、光化學的或酶的活性標記化合物如光生物素(Clontech，Palo Alto，CA)、Dig-Chem-Link(Boehringer)等非特異性地(隨機地)標記mRNA。在另一種方法中，可將mRNA的與探針互補的序列特異性地標記。可使用額外的標記寡核苷酸(或類似物)與側接探針互補序列或互補的探針序列的靶序列的共價或非共價連接實現這種特異性的標記。可從非雜交部分中純化或分離出標記的寡核苷酸與mRNA的雜交部分，然后使其雜交到陣列上。通常，產生標記的cDNA探針的方法包括寡核苷酸引物的使用。可以使用的引物包括如PCT/US98/10561所述的寡dT、隨機引物如隨機六聚體和基因特異性引物，本文納入該申請的公開作為參考。
當使用基因特異性引物時，該基因特異性引物較佳是那些對應于陣列上不同寡核苷酸位點的引物。因而，較佳使用針對存在于陣列上的各不同寡核苷酸的基因特異性引物，這樣如果該基因在所分析的特殊的細胞或組織中表達，那么標記的靶標將從該基因的樣品中產生。通過這種方法，如果陣列上特殊的基因在特殊的樣品中表達，則將產生適當的靶標并且接著可將其鑒別。對于陣列上的各靶標，可使用單一的基因特異性引物或多種不同的基因特異性引物，當使用多種引物來產生靶標時，其數目一般不超過約3。通常，在從模板核酸如mRNA中制備靶標時，基因特異性靶標將雜交到該模板的下游區域，探針與該區域是同源的，如探針是互補的或具有相同的序列。寡核苷酸探針序列到引物結合位點的距離一般不超過約500nt，通常不超過約300nt，更通常不超過約200nt。但是，在某些實施例中，該基因特異性引物可與寡核苷酸探針部分或全部互補。可通過PCR使用噬菌體編碼的RNA聚合酶轉錄dsDNA，將cDNA探針進一步擴增或者轉化(線性擴增)。參見PCT/US98/1056，本文納入該申請的揭示作為參考。
在許多實施例中，在此步驟中產生的靶標是缺乏如由定向分子內相互作用如氫鍵制備得到任何次級結構的線性靶標。但是，在某些實施例中，可能需要產生受到構象限制的受限靶標，如在使用該靶標的雜交條件下形成發夾環結構的靶標。產生發夾環結構的一個方法是使用含有除了酶促靶標產生步驟中的引導序列外還有錨定序列的引物。引物的錨定功能區是該引導功能區的5′端，它是與遠離靶標合成期間產生的5′端的cDNA第一鏈的區域互補的功能區，其中，與錨互補的5′遠端區域與cDNA的5′端足夠遠，這樣cDNA形成了發夾環結構，在該結構中，錨定序列與之互補的5′遠端區域的錨定序列形成了其結構。一般選擇引物的錨定功能區的序列以提供一環結構，該環一般約為20-200nt，通常約為30-100nt，更通常約為40-80nt。下式描述了用來產生這些引物的發夾環靶標5′-NxNp-3′其中N是dGMP、dCMP、dAMP和dTMP；p是12-35的整數，一般為15-30，更一般為18-25，這樣Np是引物的引導功能區，并且可以是如上述的基因特異性功能區，或者是寡dT功能區；x是3-30的整數，一般為5-20，更一般為5-15，其中，Nx是錨定功能區，與和作為靶標呈現的感興趣mRNA互補的cDNA第一鏈的5′遠端區域互補。
可采用大量不同的方法產生標記的靶核酸，如采用本領域所周知的方法，這些方法一般依賴于使用該原始引物的標記靶標的酶促發生。可使用標記的引物產生標記的靶標。或者，為了獲得標記的靶標，可在第一鏈合成期間或酶促標記步驟中摻入標記物。PCT/US98/10561中描述了產生標記靶標的的代表性方法，本文納入該申請的全文作為參考。雜交和檢測如上面所述，在從感興趣的組織或細胞中制備靶核酸之后，在雜交條件下使該靶核酸與陣列接觸，其中，可根據需要調整這些條件，以提供從所進行的具體實驗的角度看最佳的特異性水平。本領域熟練的技術人員周知合適的雜交條件，在Maniatis等人(同上)和WO 95/21944中有綜述。在許多實施例中特別感興趣的是雜交期間嚴格條件的采用，即從特異性探針-靶標雜交的速率、產率和穩定性以及產生最少非特異性探針/靶標相互作用的角度看最優的條件的使用。本領域熟練技術人員熟知嚴格條件。在本發明中，嚴格條件的一般特征為溫度小于特征靶標二聚體的熔化溫度15-35℃、一般小于20-30℃，其中，熔化溫度取決于多種參數，如溫度、緩沖組合物、探針和靶標的大小、探針和靶標的濃度等。因而，雜交的溫度一般約為55-70℃、通常約為60-68℃。在變性劑的存在下，該溫度可以液為35-45℃、一般約為37-42℃。嚴格條件可進一步表征為雜交緩沖液的存在，其中，該緩沖液具有以下一種或多種特征(a)具有高鹽濃度，如3-6×SSC(或具有類似濃度的其它鹽類)；(b)存在去污劑，如SDS(0.1-20％)、triton X100(0.01-1％)、monidetNP40(0.1-5％)等；(c)其它添加劑，如EDTA(一般為0.1-1μM)、氯化四甲銨；(d)促進劑，如PEG、硫酸葡聚糖(5-10％)、CTAB、SDS等；(e)變性劑，如甲酰胺、脲等；等等。
在使用上述陣列分析得自兩種或多種生理來源的標記靶核酸的種類差異時，在某些實施例中，在雜交的條件下、較佳在嚴格雜交的條件下使各類標記的靶核酸分別與相同的特征陣列接觸或一起與相同的陣列接觸，這樣標記的靶核酸雜交到基質表面上的互補探針上。在另外一些實施例中，如申請號為09/298361(本文納入該申請的公開作為參考)所述，使標記的靶核酸與可區分的標記的標準或對照靶核酸混合，接著將此混合物雜交到陣列表面上。
對于所有靶序列都含有相同的標記物的情況，將使用針對各種生理來源的不同陣列(其中，不同包括在不同時間使用相同陣列)。或者，當針對被檢測的各不同生理來源的靶標的標記不同和可區別時，出現在相同時間使用針對各不同靶標種類的相同陣列的機會。本領域周知的可區別的標記物的例子包括兩種或多種不同發射波長的熒光染料(如Cy3和Cy5)、兩種或多種具有不同發射能量的同位素(如32P和33P)、具有不同散射光譜的金或銀顆粒、在不同處理條件下(如溫度、pH、另外的化學制劑的處理等)產生信號的標記物或者在處理后不同時間點產生信號的標記物。使用用于信號產生的一種或多種酶考慮到在酶(堿性磷酸酶/過氧化物酶)的不同基質特異性的基礎上更大范圍的可區別的標記物的使用。
在雜交后，通常通過洗滌從載體表面除去未雜交的標記核酸，獲得雜交核酸在基質表面上的模式。本領域熟練技術人員周知并且可使用多種洗滌液。
所得的標記核酸的雜交模式可能是可視的，或者采用多種方法可以檢測到，對靶核酸的特殊標記物選擇特殊的檢測方法，其中，代表性的檢測方法包括閃爍計數法、放射自顯影、熒光測量、比色分析、光發射測量、光散射等。
在檢測或目測后，可將雜交模式相互比較，以鑒別各模式之間的差異。對于使用其各不同探針對應于已知基因的陣列的情況，任何差異可能與所比較的生理來源中的特殊基因的差異表達有關。
陣列上適當對照的提供使得可進行更詳細的分析，其中，對照針對雜交條件的變化、交叉雜交、非特異性結合等。因而，如在較佳實施例中，如上面所述給雜交陣列提供了標準對照。這些標準對照是以已知濃度加到樣品中的與對照靶序列互補的探針。當完全雜交條件差時，該標準對照將顯示出反映雜交減少的較小的信號。相反，當雜交條件好時，該制備對照將提供反映雜交增加的較強的信號。從而，得自陣列中其它探針的信號對標準對照的信號的歸一化提供了針對雜交條件的變化的對照。還可使用標準對照來調整(如校正)產生于陣列質量、mRNA樣品質量、第一鏈合成的效率等的差異。通常，用從其它探針測量得到的信號除以由標準對照產生的平均信號而獲得歸一化。歸一化還可包括針對由于樣品制備和放大產生的變化而進行的校正。可通過用測得的信號除以從樣品制備/放大對照探針獲得的平均信號而獲得這種歸一化。可將所得的值乘以一個常量值，以衡量該結果。
在某些實施例中，標準對照對于雜交信號的有用的量化常常是不需要的。因而，在已鑒別出最佳的探針的情況中，由所選擇的最佳探針產生的平均雜交信號提供了一個好的雜交核酸的濃度的定量測量。但是，出于其它目的如考慮到陣列的質量、mRNA樣品的質量等，在這些方法中仍可以使用標準對照。有用性在其它應用中，本發明方法可使用于差異基因表達分析。因而，人們可在(a)患病或正常的組織，如腫瘤或正常組織；(b)不同組織或組織類型；(c)發育階段；(d)對外部或內部刺激的應答；(e)對治療的應答等的差異表達分析中使用本發明方法。因此，本發明陣列可應用于用于藥物發現、診斷和研究的大規模表達篩選中，以及應用于研究特殊的活性劑對特殊細胞中基因的表達模式的影響，其中，可使用這種信息來揭示藥物毒性、致癌性等、環境監控、疾病研究等。試劑盒還提供了用于使用本發明設備進行分析結合實驗的試劑盒，其中，用于進行差別基因表達分析實驗的試劑盒是較佳的。本發明這種試劑盒至少含有本發明陣列。該試劑盒還可含有一種或多種額外的用于各種方法中的制劑，如可以是預先混合或者是分開的用于產生靶核酸的引物、dNTP和/或rNTP；一種或多種獨特標記的dNTP和/或rNTP，如生物素化的或Cy3或Cy5標記的dNTP；具有不同散射光譜的金或銀顆粒；或者其它合成后標記的制劑，如化學上活躍的熒光染料衍生物；酶，如反轉錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等；各種不同的緩沖介質，如雜交和洗滌緩沖液；預制的探針陣列；標記的探針純化制劑和組分，如旋轉柱等；信號產生和檢測制劑，如鏈霉親和素-堿性磷酸酶偶聯、化學發光物質或化學發光基質等。
以闡述性而非限制性的方式給出下述實施例。
實施例在下述實施例中，除非令有說明，否則所有的百分比都是重量百分比，所有的溶劑混合物比都是體積比。實施例1——32P-標記的雜交靶標的產生步驟A. cDNA合成/標記方法下述10μl反應物將1μg合成的對照RNA轉化成32P-標記的cDNA第一鏈。
對于各標記反應1.制備足夠用于標記反應和1個額外反應的主要混合物，以確保足夠的體積。對于各10μl標記反應，混合下述試劑2μl 5×第一鏈緩沖液(250μM Tris-HCl，pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl2)1μl 10×dNTP混合物(500μM dGTP，500μM dCTP，500μM dTTP，5μM dATP)4μl [α-33P]dATP(Amersham，2500Ci/mmol，10mCi/ml)1μl MMLV反轉錄酶(Amersham，200單位/μl)8μl 最終體積2.在0.5ml PCR試管中混合下述物質1μl(1μl) 對照s64 RNAGGCCA GGATACCAAA GCCTTACAGG ACTTCCTCCTCAGTGTGCAG ATGTGCCCAG GTAATCGAGA CACTTACTTTCACCTGCTTC AGACTCTGAA GAGGCTAGAT CGGAGGGATGAGGCCACTGC ACTCTGGTGG AGGCTGGAGG CCCAAACTAA
GGGGTCACAT GAAGATGCTC TGTGGTCTCT CCCCCTGTACCTAGAAAGCT ATTTGAGCTG GATCCGTCCC TCTGATCGTGACGCCTTCCT TGAAGAATTT CGGACATCTC TGCCAAAGTCTTGTGACCTG TAGCTGCC(SEQ ID NO01)1μl 基因特異性引物(0.2μM)CGGCCAGGATACCAAAGCCTTACAG(SEQ ID NO02)通過從對應于人DNA修補蛋白XRCC9(GB登記號U70310)的cDNA片段進行T7轉錄合成上面所提供的對照s64 RNA，這在專利申請09/298361中有更詳細的描述，本文納入該申請的公開作為參考。
3.加入ddH2O，使得最終體積為3μl。
4.混合該內容物，在微量離心機中稍微地旋轉該試管。
5.將該試管培育在70℃預熱的PCR熱循環控制器中2分鐘。
6.將熱循環控制器溫度降至50℃，培育2分鐘。
7.在各反應試管中加入8μl主要混合物。
8.使用移液管輕微抽吸使試管中的內容物混合。
9.使試管在50℃PCR熱循環控制器中培育20分鐘。
10.加入1μl的10×終止混合物(0.1M EDTA，1mg/ml糖原)停止反應。步驟B. 柱層析為了純化從未摻入32P標記的核苷酸和小cDNA片段得到的32P標記的cDNA，對各試管進行下列操作1.從冰箱中取出CHROMA SPIN-200柱(CLONTECH)，使其在室溫下溫熱約1小時。上下翻轉該柱幾次，以使凝膠基質完全再懸浮。
注意檢查柱介質中的氣泡。如果發現有氣泡，則再翻轉該柱，使柱緩沖液(ddH2O)中的基質再懸浮。
2.去除該柱的底部帽，然后慢慢去除其頂部帽。
3.將柱放到1.5ml微離心管中。
4.通過自流作用使水流過柱，直到可看到柱基質中的凝膠珠。柱基質的頂部應在該柱的0.75ml標記處。如果柱含有的介質不夠，可使用其它柱中的介質將該柱的基質體積調整到0.75ml標記處。
5.棄去收集的水，進行純化。
6.仔細且慢慢地將樣品放到凝膠床的平整表面的中心，在進行下一步驟前，使樣品完全被吸收到樹脂床中。不要讓任何樣品沿著柱內壁流下。
7.加入25μl ddH2O，并使該溶液完全過柱。
8.加入200μl ddH2O，并使該緩沖液完全過柱，直到樹脂床上沒有液體。
9.將柱轉移到干凈的1.5ml微離心管中。
10.為了收集第一批組分，將100μl ddH2O加到柱中，并使該水完全過柱。
11.為了收集第二、三和四批組分，重復步驟9和10。
12.將含有組分1-4的試管放到閃光計數器用的空瓶子中(不要將閃光混合物加到試管或瓶子中)，獲得各片段的Cerenkov計數。在氚信道讀取整個樣品。
13.集中具有最高Cerekov計數的片段(一般為組分2和3)。減小柱和顯示少于峰值片段10％計數的組分(一般為片段1和4)。摻到峰值片段中的總摻入應為2-5×106cpm。實施例2——Amynopropyl玻璃的制備1.制備洗滌溶液將200g NaOH溶解在600ml水中，將其體積補足1升(20％w/w)。在此溶液中加入1升乙醇，總體積為2升。由此制得10％NaOH在50％EtOH之后偶感的溶液。在回轉振動器中用此溶液過夜洗滌玻璃(載片放在格柵中)。
2.將帶有載片的格柵轉移到裝有MillliQ水的池中，在振動器中洗滌15-20分鐘，再重復此步驟一次。
3.將載片轉移到裝有丙酮的池中，在振動器中洗滌15-20分鐘。再重復此步驟一次。除去第一此洗滌用的丙酮，留下第二和第三次洗滌用的丙酮。(當再次進行此步驟時，用原先第二次洗滌用的丙酮進行第一次洗滌、第三次洗滌用的丙酮進行第二次洗滌，新的第三次洗滌用新的丙酮進行)。
4.提前制備5％的水在丙酮中的溶液(5％水-95％丙酮)。
5.在最后一次洗滌期間，制備0.5％的氨基丙基三乙氧基硅烷(Sigma，商品號為A3648)在步驟4的丙酮-水混合物中的溶液。
6.將載片從最后丙酮洗液中轉移出來，放到硅烷化溶液中，并在室溫下在環形振動器中培育2小時。
7.將載片轉移到MilliQ水中，洗滌20分鐘。
8.將載片轉移到丙酮中，洗滌20分鐘，重復此步驟2次。棄去這些丙酮洗液。
9.使烘箱預熱在110℃。
10.從最后的丙酮洗液中取出帶有載片的格柵，并將其轉移到預熱的烘箱中。由于在載片和格柵的表面上仍留有一些丙酮，所以氣味相當強烈。在將載片放到烘箱后應打開排氣管，并在烘烤的第一個30分鐘后可將其關閉。
11.使烘箱在110℃烘烤載片3小時，然后關閉或冷卻至室溫。過夜進行這一步驟很方便。
12.烘烤后，使用“硫氰酸酯方法”可容易地印染載片。如果不立即進行該印染，可將載片放置在干櫥柜的干凈盒子中。
下述步驟用于制備PDITC載片1.制備吡啶和二甲基甲酰胺的混合物(10％吡啶和90％DMF)。制備所需的量即可。這種混合物不能保存。
2.在攪拌器中以0.1％的濃度(1g每升)將1，4-苯二異硫氰酸酯溶解在吡啶-DMF混合物中。按需制備此溶液，并且僅當進行下一步驟時才制備。這種溶液不能保存。這種溶液的顏色是淺黃色-綠色。
3.將該溶液倒入槽中，并將帶有氨基修飾的載片的格柵轉移到該槽的溶液中。用蓋子蓋住該槽，以低速度在環形振動器中振動2小時。
4.將帶有載片的格柵轉移到裝有丙酮的槽中，在振動器中洗滌10-15分鐘。重復此步驟2次以上，每進行一次就將格柵轉移到裝有新的丙酮的槽中。
5.在最后一次洗滌后，立即將帶有載片的格柵轉移到真空環形中，在室溫下在真空中干燥20-30分鐘。真空處理應盡可能地快。
6.將吡啶-DMF混合物以及丙酮洗液棄到可燃性廢棄物容器中。
7.將用于儲存的載片轉移到干櫥柜中。確信干櫥柜中的干燥劑是好的(呈藍色)。實施例3——寡核苷酸的打印以100ng每微升的濃度將用于此實驗的寡核苷酸溶解在0.1M NaOH中，并將其印染在PDITC修飾的玻璃表面上。每個位點存放的DNA的量約為5ng。印染后，在80℃烘烤載片2小時，然后進行UV交聯(254nm UV燈)1分鐘。實施例4——陣列的制備采用上述方法，制備具有表1上述特征的陣列。使用核酸自動合成器制備各探針寡核苷酸。


實施例5——33P標記的cDNA靶標與寡玻璃陣列的雜交1.制備含有0.1％SDS的6×SSC緩沖液。
2.將印染有寡DNA的玻璃載片放到雜交室中，并加入2ml步驟1制備的溶液。
3. 60℃預雜交30分鐘。
4.使標記的cDNA探針(實施例1，約200μl，總計約2-5×106cpm)與10×變性溶液(1M NaOH，10mM EDTA)的總體積(約22μl)的1/10混合，并在65℃培育20分鐘。然后加入5μl(1μg/μl)的人Cot-1 DNA和等體積(約225μl)的2×中性溶液(1M NaHPO4，pH7.0)，繼續在65℃培育10分鐘。
5.將步驟4制備的混合物加到2ml步驟1制備的溶液中。確信兩種溶液完全混合。
6.倒掉預雜交溶液。用步驟5制備的溶液替換。
7. 60℃過夜雜交。
8.小心去除雜交溶液，將該溶液放到適當的容器中。將該玻璃載片放到裝有20ml洗滌液1(2×SSC，0.1％SDS)的洗滌室中。室溫下連續攪拌的同時洗滌該陣列10分鐘。重復此操作4次。
9.室溫下在連續攪拌的同時在20ml的洗滌液2(0.1×SSC，0.1％SDS)中另外洗滌10分鐘。
10.用鑷子從容器中取出cDNA陣列，并振動該洗液。用蒸餾水清洗該陣列，使其在空氣中干燥。
11.在-70℃將該玻璃載片陣列暴露在帶有強化屏的X射線膜中。或者使用磷光計(Molecular Dynamics)。實施例6——雜交效率實驗使用該陣列和上述方法，使用與各探針互補的32P標記的靶標檢測實施例4所述的陣列上不同長度的各探針的雜交效率。這個實驗的結果表示在圖1中。該結果證明長度超過50nt的寡核苷酸探針的雜交效率有顯著的提高。
從上述的討論可明顯地看出，本發明陣列在本領域中是個顯著的進步。本發明提供了探針陣列，在該陣列中，所有的探針對它們各自的靶標具有基本上相同水平的高雜交效率，并且具有最低水平的非特異性雜交。因此，本發明陣列排除了使用針對感興趣的每一個靶標的多探針或使用針對每一個靶標的不配對對照探針的需要，如果不需要其它的陣列形式，這些使用至少是需要的。此外，采用不是以PCR為基礎的方法也可容易地制備此陣列，該制備方法適合用于高通量的生產。因此，本發明陣列組合了短寡核苷酸陣列的通量生產的益處和在cDNA陣列中觀察到的高特異性的益處。因此，本發明對本領域作出了顯著的貢獻。
在此說明書中所引用的所有的出版物和專利申請都被納入本文作為參考，就像特殊地或單獨地指出各單獨的出版物或專利申請被納入作為參考一樣。任何出版物的引用都是其在申請日前的公開部分，而不應認為本發明承認由于現有的發明而使得本發明不能在這些出版物之前被授權。雖然出于清楚理解的目的，本發明的前面部分已以闡述和實施例的方式進行了一定程度的描述，但是對于本領域熟練的技術人員來說，在不偏離所附的權利要求的精神和范圍的情況下可對本發明作出某些改動和修改，這是顯而易見的。
序列表序列表<110>A.舍納契克(Chenchik，Alex)A.穆尼什金(Munishkin，Alexander)P.西蒙年科(Simonenko，Peter)<120>長寡核苷酸陣列<130>CLON-015WO<150>09/440829<151>1999-11-15<160>38<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>293<212>DNA<213>人工序列<220><223>對照寡核苷酸<400>1ggccaggata ccaaagcctt acaggacttc ctcctcagtg tgcagatgtg cccaggtaat 60cgagacactt actttcacct gcttcagact ctgaagaggc tagatcggag ggatgaggcc 120actgcactct ggtggaggct ggaggcccaa actaaggggt cacatgaaga tgctctgtgg 180tctctccccc tgtacctaga aagctatttg agctggatcc gtccctctga tcgtgacgcc 240ttccttgaag aatttcggac atctctgcca aagtcttgtg acctgtagct gcc 293<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cggccaggat accaaagcct tacag 25<210>3<211>101<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>3acctagaaag ctatttgagc tggatccgtc cctctgatcg tgacgccttc cttgaagaat 60ttcggacatc tctgccaaag tcttgtgacc tgtagctgcc a 101<210>4<211>90<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>4agaaagctat ttgagctgga tccgtccctc tgatcgtgac gccttccttg aagaatttcg 60gacatctctg ccaaagtctt gtgacctgta 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權利要求
1.一種陣列，它含有至少一種與固相載體表面穩固地連接的探針寡核苷酸位點的模式，其中，所述模式的各個探針寡核苷酸位點對應于靶核酸，并且含有由長約50-120nt的寡核苷酸探針構成的寡核苷酸探針組合物。
2.如權利要求1所述的陣列，其特征在于，有兩種以上不同的靶核酸被呈現在所述模式中。
3.如權利要求1或2所述的陣列，其特征在于，所述模式中的各探針寡核苷酸位點對應于不同的靶核酸。
4.如權利要求1、2或3所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的各長寡核苷酸探針對各自的靶標的雜交效率高。
5.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的各長寡核苷酸非特異性雜交的傾向低。
6.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的各個長寡核苷酸探針與它們各自的靶標的高雜交效率基本上相同。
7.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，所述長寡核苷酸探針與所述基質的表面共價連接。
8.如權利要求7所述的陣列，其特征在于，所述各長寡核苷酸探針與所述載體表面上的至少一個位點交聯。
9.如權利要求7所述的陣列，其特征在于，所述各長寡核苷酸探針與所述載體表面上的至少兩個位點交聯。
10.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的位點密度不超過約1000個/cm2。
11.如權利要求10所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的位點密度不超過約400個/cm2。
12.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的位點數量約為50-50000個。
13.如權利要求12所述的陣列，其特征在于，所述陣列上的位點數量約為50-10000個。
14.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，各長寡核苷酸的長度約為60-100nt。
15.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，有10種以上不同的靶標被呈現在所術模式中。
16.如前面權利要求中任一項所述的陣列，其特征在于，所述獨特的寡核苷酸的長度約為65-90個核苷酸。
17.一種制備權利要求1-16中任一項所述的陣列的方法，它包括制備所述長寡核苷酸探針；以足以產生所述陣列的量將所述長寡核苷酸探針穩固地連接到所述固相載體表面上。
18.一種雜交方法，它包括在足以產生雜交模式的條件下，使至少一種標記的靶核酸樣品與權利要求1-16中任一項所述的陣列接觸；檢測該雜交模式。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法還包括制備另一種雜交模式；比較兩種雜交模式。
20.一種用于雜交實驗的試劑盒，該試劑盒含有權利要求1-16中任一項所述的陣列。
全文摘要
提供了長寡核苷酸陣列、制備它們的方法以及它們在雜交實驗中的應用。本發明陣列的特征是該陣列的探針至少有一部分、一般全部是長寡核苷酸,如長約20－150nt的寡核苷酸。較佳地選擇陣列上的各長寡核苷酸探針,使其在使用該陣列的條件下具有基本上相同的高靶標結合效率和低非特異性結合。本發明陣列可應用于大量不同的用途中,如差別基因表達的分析。
文檔編號G01N33/53GK1390264SQ00815631
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月15日 優先權日1999年11月15日
發明者A·舍納契克, A·穆尼什金, P·西蒙年科 申請人:克隆技術實驗室股份有限公司