專利名稱：結腸直腸癌和其它胃腸病理學的非侵入性檢測的制作方法
此申請是1999年4月15日提交的、未決的美國申請09/292,358的部分繼續。
背景技術：
發明領域本發明涉及分離的能夠早期非侵入性檢測結腸直腸癌和其它胃腸疾病的結腸細胞(colonocyte)。更為具體地，本發明涉及從少量糞便樣品中獲得的、生物學上基本純的、起源于淋巴系統的分離活免疫糞便細胞(immunocoprocytes)與非上皮細胞。本發明還涉及提供用于在正常環境溫度下從糞便樣品中分離存活的結腸細胞的運送介質和分散或懸浮介質，以及使用本發明的分離結腸細胞進行結腸直腸與其它胃腸病理學檢測的方法。所分離的結腸細胞還可用于其它異常的狀況、癥狀、紊亂或病理狀態的研究和測定。
現有技術人類常見的一種胃腸道惡性腫瘤是結腸直腸癌。據估計，在美國結腸直腸癌占所有與癌癥相關死亡男性和女性的14％，并且它的發病率仍就很高(Boring等人，加拿大臨床癌癥雜志(CA Cancer J.Clin.)1994；447-26)。如同其它惡性腫瘤的治療一樣，早期的檢測對于這種癌癥的成功治療是至關重要的。
目前，檢測結腸和結腸直腸腫瘤的篩選檢查方法基于使用(a)糞便潛血檢驗(FOBT)，(b)可彎曲的乙狀結腸鏡檢查，(c)雙對照鋇灌腸法，和(d)結腸鏡檢查。在這些篩選檢驗中，只有FOBT是非侵入性的、簡便且相對便宜，它的依據是相對高可能性的結腸直腸癌出血。然而，FOBT頻繁的假陽性與假陰性結果很大程度上限制了它的特異性和靈敏度。其它的操作都是昂貴的，并且是侵入性的。因此，確實需要提供一種簡便、非侵入性的、可信賴的并且不昂貴的方法來檢測結腸直腸癌、胃腸(GI)道疾病和其它病理狀態。
結腸細胞是信息標志分子的一個重要來源，可提供受實驗者胃腸道剛剛完成的代謝史景象。另外，這種細胞代表取自統計學大樣本框的細胞群體，以非侵入性方式反映全長結腸上的結腸粘膜的狀態，與使用涉及內窺鏡檢查的侵入性方法通過結腸活檢的有限取樣形成對照。
結腸細胞經歷某種變化或轉化，攜帶指示結腸病理學包括癌前和癌的狀況的某種生物或化學標志。因此，結腸細胞可以作為胃腸道中腫瘤過程發作和其它病理生理變化的有價值的早期指標。基因和表面蛋白的微妙變化是這種腫瘤標記的實例。特別是Ki67、腫瘤表面糖蛋白CD4和腫瘤相關抗原19-9以及外源凝集素結合都是胃腸道中腫瘤轉化的特異生物標志。因為快速分裂的細胞中含有較多的DNA，所以分離的結腸細胞中的DNA數量與腫瘤的存在也有著密切的相關性。眾所周知，結腸腺瘤息肉和癌的形成是一個涉及癌基因(ki-ras)激活、腫瘤抑制基因(p53和APC)失活、以及DNA錯配修復基因變更的多步驟過程。
迄今，在本發明所屬的領域中通常認為，一旦結腸細胞脫落到糞便中，它們就會受到損害，其原因是它們一暴露到大氣中細胞就開始破裂。糞便中的酶、粘液和細菌參與破壞結腸細胞的過程。例如，在美國專利#5,094,956、#5,380,647和#5,455,160中已經描述將新鮮收集的糞便樣品冷凍到-20℃以下的溫度，只是為保存化學成分，而沒有考慮到細胞組分。因此，這些操作不保持細胞的完整性，不適于分離完整存活的、無其它雜質的細胞。
Dutta和Nair(腸胃病學(Gastroenterology)，1141333-1335，1998)提及Albaugh等人(Int.J.Cancer，52347-350，1992)和Iyengar等人(FASEB J.52856-2859，1991)曾成功分離到存活的結腸細胞。Albaugh等人基于Iyengar等人的早期工作描述了一種運送介質和方法從糞便樣品中獲得結腸細胞。但是，現有技術的運送介質與本發明的運送介質不同，Albaugh等人的介質差不多是由鹽溶液組成的，其中除無脂肪酸的BSA之外，還添加了抗生素。換句話說，現有技術中的運送介質至少缺少一種標準，即不含有粘液分解劑，而依照本發明，對于運送介質的配制它是絕對必需的。
此外，在Albaugh等人的系統中，收集后的糞便樣品在運送到實驗室進行進一步研究時必須在冰中冷卻，并且在冰中只能保存大約1小時。相反，本發明的系統不要求在冰中冷卻，可在正常環境溫度下完成所希望的結果，這是本發明的一個重要特征。而且，Albaugh等人聲稱盡管他們的細胞存活率超過80％，但不能排除吞噬細胞和其它細胞的存在。確實，Iyengar等人的圖3和4中清楚地顯示所得到的細胞制備物是相當不純的。因此，Iyengar等人和Albaugh等人的方法可以提供存活的結腸細胞，但對于獲得基本純的結腸細胞這一目的，它們是不能勝任的。總之，到目前為止，還沒有可能從少量的糞便物中，在正常的環境溫度條件下，分離得到存活的、生物學上基本純的特定細胞類型的樣品。
發明概述因此，本發明的一個目的是提供在正常環境溫度下分離的存活的、生物學上基本純的、脫落的糞便結腸細胞。
本發明的另一個目的是提供存活的、分離的免疫糞便細胞。
本發明的另一個目的是提供存活的、分離的淋巴或非淋巴譜系的炎癥細胞。
本發明的另一個目的是提供用于在正常環境溫度下分離存活的脫落糞便結腸細胞的運送介質和分散或懸浮介質。
本發明的另一個目的是提供一種依照本發明的講授，利用在正常環境溫度下分離的脫落糞便結腸細胞來檢測胃腸道紊亂(包括結腸直腸癌)的非侵入性方法。
本發明的多種其它目的和優勢將從發明詳述或附圖簡述中得到明確。
附圖簡述參考附圖將能更好地理解前述的和其它的目的、方面和優勢，其中
圖1是在正常環境溫度下從少量糞便材料樣品分離存活的脫落結腸細胞的方法示意圖；圖2是依照本發明所分離結腸細胞經流式細胞儀分析的直方圖資料，顯示純度超過96％；圖3是根據免疫球蛋白特征確定的結腸細胞類別的示意圖。
發明詳述本發明的多種目的和優勢是通過在正常大氣條件和環境溫度下從糞便樣品中分離得到活的、均一的期望細胞類型的結腸細胞而得以實現的。
應當理解，除非另外定義，此處所使用的技術以及科學術語與本發明所屬領域中普通技術人員通常所理解的含義相同。盡管與此處所描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可用于本發明的實施和試驗，但優選此處所描述的方法與材料。除非另外提及，此處使用的或考慮到的技術都是本領域普通技術人員熟知的標準方法。材料、方法和舉例僅是示例性的并且沒有限制性。
此處使用的術語“基本上純的”意味著本產品是均質或均一的一種類型，經流式細胞術或此處所描述的程序測定，其純度大于96％，通常是98％-99％的純度，并且沒有物質干擾或其它類型細胞的污染。
迄今，糞便材料中脫落的結腸細胞所遇的問題是那些細胞一旦暴露到正常的大氣條件下，由于糞便材料中蛋白水解酶、微生物系統、粘液等的存在，就會遭到破壞。因此，必須設計一個系統來抑制所有那些阻礙在正常環境溫度下從糞便材料中分離完整、存活結腸細胞的因素或要素的作用。這將通過本發明配制的兩種不同介質得以實現(1)運送介質，和(2)分散或懸浮介質。運送介質是由生理鹽水溶液組成，其中含有致酶失活量的捕酶劑或蛋白酶螯合劑(protease sequesteringagent)、足量的抑制細菌活性的殺菌劑或制菌劑，以及溶解粘液量的破壞糞便材料中粘液的試劑。
本領域的普通技術人員可建議多種捕酶劑、制菌劑和粘液溶解劑，依照本發明的講授，任何不干擾本發明目的的適當試劑都可用于配制運送介質。
在捕酶劑中優選蛋白水解活性抑制劑以及動物蛋白。適當的蛋白水解活性抑制劑的實例包括PMSF、胃蛋白酶抑制劑A、苯丁抑制素、胰凝乳蛋白酶抑制劑。抑制或鈍化酶活性的試劑包括甲醛、金屬螯合劑、重金屬離子、某些氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸)以及高濃度的鋅或無機磷酸鹽。適當的動物蛋白是那些非免疫性的水溶性化合物，包括兔(RSA)、山羊(GSA)、綿羊(SHA)、馬(ESA)、牛(BSA)、以及人(HSA)來源的血清白蛋白。不干擾隨后實驗程序的某些多聚氨基酸也可用作酶的鈍化劑。這樣的多聚氨基酸的適當實例有多聚L-賴氨酸、多聚L-脯氨酸、多聚L-酪氨酸等。
制菌劑的適當實例有疊氮化鈉、苯甲酸鈉、抗生素(例如青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素、多粘菌素B等)、甘草酸、甘草次酸(α和β)、其適當的衍生物等。優選的殺菌劑是硫柳汞(Sigma化學公司)，優選的制菌劑是甘草酸。
粘液溶解劑的適當實例有愈創木酚甘油醚、愈創木酚、碘化鉀、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、辣椒堿、甘草酸等。優選的粘液溶解劑為愈創木酚甘油醚(Sigma化學公司)。
優選的生理鹽水溶液來源是Puck’s鹽水G。
優選的運送介質按照如下配制Puck’s鹽水G500毫升碳酸氫鈉350-500毫克BSA 2.5-15gms愈創木酚甘油醚 2.5-5gms甘草酸 2-4gms分散或懸浮介質與運送介質不同在于殺菌劑/制菌劑(如甘草酸)，在配制分散或懸浮介質時，不加入該殺菌劑/制菌劑。正常環境溫度下分離基本純的結腸細胞的程序現在參考圖1，將少量糞便樣10(大約0.5-1.0gm)放入含有運送介質和少量玻璃珠12的試管11中，接著用塞子將試管密封。然后將糞便樣品10在介質12中充分分散，例如，通過旋轉振蕩，接著將試管11中的內容物用網篩(大約300微米孔徑)過濾到一支新的試管13(50毫升聚丙烯或類似的圓錐形離心管)中，并用一種比重(density)大約為1.033到大約1.25的重介質14鋪底，在臺式離心機中，制動關閉的狀態下，200×g離心大約10分鐘。
結腸細胞積聚在重基質中，形成沉淀位于試管底部，取出重介質14與上面較輕的懸浮液18之間界面的一層較輕細胞(次要成分)17后，用塑料移液管15吸出回收結腸細胞。將從重介質和沉淀中回收的細胞放入一支新的50毫升離心管19中，用大約40毫升的懸浮介質20稀釋。然后將這樣得到的細胞懸浮液在大約900×g下離心約10分鐘，丟棄澄清的上清液，將離心管底部的細胞沉淀21重新懸浮在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水中。將那層較輕細胞(次要成分)17放入另一支新的50毫升離心管22中，如對從重基質和沉淀得到細胞所描述的那樣洗滌。回收含有基本生物學純的、分離的、脫落的存活結腸細胞的細胞沉淀21，在適當的鹽溶液(例如PBS)中分散，并通過45微米網篩過濾器過濾。
為測定所分離結腸細胞的生活力，將一部分沉淀21分散在PBS/BSA介質26(1ml/gm糞便樣品)中。然后，使用錐蟲藍，將1/10稀釋的懸浮液在血細胞計數器下記數。本領域技術人員眾所周知，不攝取錐蟲藍的細胞被認為是存活的并被記數來測定細胞產量。
試管和小瓶可用任何適當的材料包括塑料、聚苯乙烯、聚丙烯等來制造。
指出本發明創造性的方面是配制運送介質和分散或懸浮介質十分重要，它們聯合使用可以于正常環境溫度下在分離過程中或分離后保持糞便樣品中脫落結腸細胞的存活狀態。換句話說，本發明可以在整個分離程序中，不經過冷藏或冷凍，在約22℃至約25℃的正常環境溫度下，從糞便材料的少量樣品(例如，0.5-1.0gm)中分離完整的、活的脫落結腸細胞。依照本發明的技術，從一克糞便樣品中可得到大約8,000,000至10,000,000個活的結腸細胞。
將分離的結腸細胞保存在本發明的懸浮介質中，在正常的環境溫度下，可保持延長時期的存活狀態。表1顯示了產量和存活力對保存時間與溫度條件的函數。
當然，在分離程序中可以替換為不同的技術。例如，糞便樣品在運送介質12中的懸浮液可以通過篩子(149微米、105微米和52微米)過濾。另外，分散介質中的沉淀可以輕輕地覆蓋在較高比重的Percoll梯度上，離心，這樣可從梯度頂層中回收細胞。這樣的修飾在本領域中十分普遍，屬于本發明的范圍。
當然可以理解，適當的任何時候都可使用來自無病受實驗者的結腸細胞建立一種參考或基線，以便用來自懷疑有疾病或病理狀態的受實驗者的結腸細胞進行比較、診斷或評估研究。
已經發現，本發明非侵入性獲得的結腸細胞的一個重要和有利特征是，這些分離的結腸細胞攜帶胃腸道病理學的標志或轉化特征，因此，它們可用作胃腸道病理學的診斷和預測指標。免疫糞便細胞(IMMUNOCOPROCYTES)因為發現從糞便中分離的結腸細胞真實地代表整個結腸解剖學和病理生理學狀況，這些細胞還可用于監測粘膜免疫等其它用途中。胃腸道的粘膜是免疫球蛋白介導的免疫學防御確立的主要位點。已經發現從通過本發明方法學得到的脫落細胞中，可鑒定與分離一種功能特殊的細胞群，此處稱為免疫糞便細胞。免疫糞便細胞獨特之處是表達一種特異的、此處稱為IgC的免疫球蛋白，認為它是一種能被IgG和IgA的抗體所識別的嵌合免疫球蛋白。此外，免疫糞便細胞是無性系的、抗原特異的，其特征在于存在Fc受體與免疫球蛋白A(IgA)。
由于免疫糞便細胞與IgG和IgA的抗體具有親和力，本領域的普通技術人員將可以提出多種分離免疫糞便細胞的方法。例如，使用抗IgG或特異的抗IgC的單克隆抗體可以成功地從來自糞便、結腸清洗物(purges)或沖出物的細胞混合物，或從外科的和尸體解剖樣品中選擇性分離免疫糞便細胞。間接的免疫粘著方法是利用淘洗技術，使得這些細胞粘著在抗IgG或特異的抗IgC抗體包被的培養皿上。抗IgG抗體用作免疫糞便細胞的捕獲劑是根據本發明的如下發現在正常條件下，不能檢測到純的表達單特異性IgG的(即沒有IgA的共表達)結腸細胞。期望類型的單克隆抗體的制備是本領域的技術人員所熟知的，可常規獲得。
另一種獲得基本純的免疫糞便細胞的方法是使用熒光染料結合的抗IgG或抗IgC，利用熒光激活細胞分揀術(FACS)。在一個實施方案中，將結腸細胞與FITC(異硫氰酸熒光素)標記的IgG孵育，沖掉過量的試劑，在熒光激活細胞分揀儀中分選熒光標記的免疫糞便細胞。
在另一個實施方案中，IgG和IgC的單克隆抗體共價或非共價連接到固體基質上，例如，技術人員所熟知的瓊脂糖珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、中空纖維、磁珠、塑料組織培養皿等。通過機械的、磁性的或其它任何適當的方法，簡便地將基質和懸浮液分開，使結合到抗體包被的支持物上的細胞從細胞懸液中得到分離。正如本領域任何技術人員所熟知的，免疫糞便細胞還可結合到通過接頭包括了抗IgG或抗IgC的組織培養瓶表面上，將結腸細胞懸液在培養瓶中孵育后，輕輕地倒出沒結合的非免疫糞便細胞。然后通過刮取或適當酶學斷裂接頭，回收結合的免疫糞便細胞。連接到珠基質(如Sepharose)上的接頭在商業上可獲得(如Pharmacia)。
使用雙色免疫熒光流式細胞術測定免疫糞便細胞的數量或種群。將結腸細胞與抗IgG FITC(綠色熒光)和抗IgA PE(藻紅蛋白，紅色熒光)一同孵育。用緩沖液沖洗細胞除去過量的抗體后，將細胞在流式細胞儀中分析，來記數具有單種熒光(綠色或紅色)的細胞和那些具有雙重熒光(綠色和紅色)的細胞。具有雙重熒光的細胞是嵌合IgC免疫糞便細胞，而具有紅色熒光的細胞是分泌IgA的結腸上皮細胞。在大多數來自正常受實驗者的結腸制備物中，沒有可測量數目的僅僅識別抗IgG FITC的細胞。換句話說，只具有IgG的結腸細胞是罕見的，它們的存在可能與異常的粘膜或系統免疫機能障礙有關。
通過流式細胞術對免疫熒光標記細胞的分析揭示，至少存在三種結腸細胞。為了區別免疫糞便細胞的Fc受體與其它的Fc受體，此處將免疫糞便細胞Fc受體命名為CFc受體。表2顯示這些細胞中IgC、CFc和IgA的一些具有代表性的正常分布。與正常值的偏離將顯示涉及免疫系統的疾病過程。圖3是通常檢測到的至少三種結腸細胞的示意圖“A”表示具有多個獨特的嵌合免疫球蛋白IgC(用在每個分子2上有兩個抗體結合位點來代表)及多個CFc受體3的免疫糞便細胞。“B”表示與“A”類似的結腸細胞，但是具有多個IgA免疫球蛋白分子5及多個CFc受體3。“C”表示與“A”和“B”類似的結腸細胞，但沒有免疫球蛋白而只有CFc受體。
以上所描述的免疫糞便細胞、攜帶IgA的結腸細胞與攜帶CFc受體的結腸細胞在胃腸道的免疫監視和維持整個生物體的系統體液免疫中起著不同的作用。這些細胞執行重要的功能(i)維持結腸微生物區系建群的平衡；(ii)它們是無性系的并包含一群多潛能細胞，每一種都可識別飲食或生物學來源的可溶的或微粒的單一抗原；(iii)它們可以作為與腸有關的淋巴組織的抗原呈遞細胞；(iv)它們可以是檢測病原體(例如，輪狀病毒、志賀菌、脊髓灰質炎、腸道寄生蟲、分支桿菌等)侵入的標記；以及(v)缺乏它們則可能預示醫源性免疫無反應性或先天的免疫球蛋白缺乏的狀態。因為這些結腸細胞(包括免疫糞便細胞)是抗原特異的，它們可以通過用致癌物、癌基因DNA、EBV、SV-40等轉化而永生化，并且通過本領域技術人員所熟知的雜交瘤技術產生對所選抗原特異的抗體分泌細胞系。
以下的實施例將闡明本發明所鑒別或分離的結腸細胞的具體用途。這些實施例僅僅是例證性的并且不以任何方式限制本發明。
實施例-1通過本發明所描述的程序從正常受實驗者分離的結腸細胞基本上無任何炎癥細胞。在炎癥性腸道疾病(IBD)，例如潰瘍性結腸炎和局限性回腸炎中，大量的炎癥細胞都調動到結腸粘膜的表面并隨上皮細胞一同脫落。
將來自IBD患者糞便的1至2克等分試樣懸浮在運送介質中，與大約150毫升的懸浮介質在細菌分離器中攪勻。將等分試樣(30毫升)懸浮液用10毫升Histopaque 1077(比重為1.077)鋪底，在制動關閉的狀態下，200×g室溫下離心30分鐘。回收水性懸浮液與Histopaque 1077之間的界面，重復離心洗滌3次。經此過程，除正常全部結腸細胞以外還回收了炎癥細胞。
將混合細胞中的炎癥細胞用抗-CD45/FITC(綠色熒光)標記，陽性細胞在流式細胞儀中記數。又稱為白細胞共同抗原的CD45(分化簇)是淋巴樣細胞譜系特異的標志，存在于炎癥細胞上。另外還有一個炎癥標志，抗-COX-2/PE(紅色熒光)，也可用來檢測炎癥細胞。因為結腸上皮細胞對CD45呈陰性，分離物中CD45陽性細胞的數目是IBD中炎癥過程嚴重性的直接估量。監測CD45和COX-2均呈陽性的細胞對跟蹤治療過程中疾病的發展是一種極其有用的非侵入性方法。
實施例-2粘膜免疫狀況的評定如上所述，從懷疑有無免疫應答消化道的受實驗者獲得細胞。將細胞的等分試樣(大約110K)懸浮在PBS緩沖液中，與下面一種熒光標記抗體組合于37℃孵育45分鐘抗-IgG FITC(綠色)、抗-IgA PE(紅色)、和抗-IgC FITC+抗IgA PE。還提供一個含有攜帶同型對照抗體的細胞的平行管來測定非特異的抗體結合。進行直接的免疫熒光測定來測量抗體與不同組結腸細胞的結合。免疫糞便細胞(表達IgC)或攜帶IgA的細胞數目的顯著減少對免疫缺陷具有診斷意義。表2列出了來自正常受實驗者的數值。任何偏離正常數值都將指示著免疫機能障礙。應當指出，可類似地進行直接和間接免疫熒光測定評定例如細胞因子、信號轉導中間體、生長因子等高分子的所有組成成分(repertoire)。
實施例-3結腸癌相關生物標志的表達
如上所述從懷疑有結腸癌或結腸癌前體(息肉)的患者獲得細胞。在這種技術的一個實施方案中，經過間接免疫熒光實驗測定CD44或它的分子變體例如CD44V3、CD44V6和CD44V10的表達；CD44或它的分子變體的存在將被診斷為結腸癌。
實施例-4作為可非侵入性得到的體細胞的來源，本發明結腸細胞的表型和基因型都是典型的。因此，它們在DNA分型和檢測生物高分子(例如DNA、RNA、蛋白質等)對例如藥理學因素及環境因素的反應以及多重耐藥性的評定是有用的。這些分離的細胞也可用于本領域技術人員容易提出的其它多種方法中。
顯而易見，鑒于此處所提供的指導、圖表和實施例，本領域技術人員將會建議多種本發明的修改實施方案、修飾或操作，這些將包括在此申請的精神和范圍以及附加的權利要求的范圍之內。
表1貯存對細胞產量的影響貯存時間 條件 細胞產量％ 存活力％1-6小時 室溫 10085+3天 室溫 13585+3天 4℃ 70.2 85+8天 室溫 97.5 80+8天 4℃ 14275+
表2攜帶IgC、IgA和CFc的結腸細胞的分布受實驗者編碼 IgC CFc受體IgA308-S1 18.5 90.3 46.5308-S2 20.8 87.8 42.0318-S1 12.2 86.9 47.7318-S2 26.5 91.2 37.7319-S1 27.5 88.9 44.0319-S2 32.9 90.9 30.0325-S1 20.2 88.9 40.0325-S2 16.8 82.2 4.0注釋數字表示攜帶相應分子的細胞占總細胞的百分數(％)。這些結果是采用流式細胞術分析通過本申請中所描述的技術分離的、免疫熒光標記的結腸細胞而得到的。
權利要求
1.在正常環境溫度下分離的、生物學上基本純的、存活的、脫落糞便結腸細胞。
2.權利要求1的結腸細胞，其攜帶指示特定胃腸狀況的標志。
3.權利要求2的結腸細胞，其攜帶指示腫瘤轉化的標志。
4.權利要求2的結腸細胞，其攜帶指示免疫機能障礙的標志。
5.權利要求2的結腸細胞，其呈現指示非腫瘤性胃腸病理狀態的異常。
6.權利要求1的結腸細胞，其是淋巴來源的上皮或非上皮細胞。
7.權利要求1的結腸細胞，其表達一種嵌合的免疫球蛋白IgC。
8.權利要求1的結腸細胞，其只表達IgA和CFc。
9.權利要求1的結腸細胞，其只表達CFc。
10.用于收集糞便樣品的運送介質，其包含(a)足量的螯合糞便材料中蛋白酶的試劑；(b)足量的破壞糞便材料中粘液的粘液溶解劑；(c)足量的抑制糞便材料中細菌活性的殺菌劑。
11.權利要求10的運送介質，其中所述的蛋白酶螯合劑選自血漿蛋白質、凝膠形成聚合物以及合成樹脂。
12.權利要求11的運送介質，其中所述的血漿蛋白質是牛血清白蛋白、卵白蛋白或人血清白蛋白。
13.權利要求12的運送介質，其中所述的粘液溶解劑選自N-乙酰半胱氨酸、β-巰基乙醇、辣椒堿、二硫蘇糖醇、愈創木酚和愈創木酚甘油醚。
14.權利要求13的運送介質，其中所述的殺菌劑選自硫柳汞、抗生素、疊氮化鈉、甘草酸及甘草次酸(α和β)。
15.權利要求14的運送介質，其是一種溶液，該溶液包含碳酸氫鈉 350-500毫克；牛血清白蛋白 2.5-15gm；愈創木酚甘油醚 2.5-5.0gms；甘草酸 2.0-4.0gms；和Puck’s鹽水G 500毫升。
16.權利要求15的運送介質，其沒有甘草酸，籍此將所述運送介質改造成分散或懸浮介質。
17.在正常環境溫度下分離生物學上基本純的、脫落的糞便結腸細胞的方法，包括步驟(a)將糞便樣品收集在維持正常環境溫度的運送介質中；(b)將糞便樣品分散在懸浮介質稀釋的所述運送介質中；(c)通過將細胞懸液在更大比重介質上層疊，沉降步驟(b)的稀釋運送介質中的細胞，以使該細胞與雜質分離；(d)使步驟(c)中的細胞經過一種作用，導致在與所述較重介質的界面上形成細胞區帶，并在較重介質和沉淀中形成細胞組分；和(e)從所述的細胞區帶中及較重介質和沉淀中回收生物學上基本純的結腸細胞。
18.權利要求17的方法，其中所述較重介質的比重是從大約1.033至大約1.25。
19.權利要求18的方法，其中所述較重介質的比重是1.25。
20.檢測結腸直腸癌的方法，包括步驟(a)獲得生物學上基本純的結腸細胞；然后(b)將所述結腸細胞與一種試劑反應來檢測確定癌癥的標志的存在，所述結腸細胞與所述試劑發生陽性反應指示癌的存在。
21.權利要求20的方法，其中所述試劑是產生顯色產物的熒光標記抗體或植物凝集素。
22.檢測胃腸道粘膜免疫的方法，包括將從待測胃腸道粘膜免疫的受實驗者回收的免疫糞便細胞的數目與從正常受實驗者回收的免疫糞便細胞的數目進行比較，與正常值的統計學顯著的偏離指示免疫機能障礙的水平。
23.診斷胃腸道病理狀態的方法，包括在懷疑有胃腸道病理狀態的受實驗者糞便樣品中測定炎癥細胞的存在，炎癥細胞的存在指示胃腸道病理狀態。
24.權利要求23的方法，其中通過將細胞與CD45或COX-2的抗體反應測定炎癥細胞的存在，與所述抗體結合的細胞是炎癥細胞。
25.產生抗原特異的單克隆抗體的方法，包括在標準雜交瘤技術中使用抗原特異的免疫糞便細胞作為克隆，并回收抗原特異的單克隆抗體。
全文摘要
本發明描述了一種在正常環境溫度下分離存活的、生物學上基本純的、脫落的糞便結腸細胞的方法。闡述了指示某種胃腸道狀況的免疫糞便細胞和炎癥細胞以及檢測結腸直腸癌的一種非侵入性方法。詳述了用于分離結腸細胞的運送和懸浮介質的組成。
文檔編號G01N33/68GK1349559SQ00807024
公開日2002年5月15日 申請日期2000年4月4日 優先權日1999年4月15日
發明者帕德馬納班·P·奈爾 申請人:帕德馬納班·P·奈爾