分離細胞質級分而不影響卵母細胞和胚胎細胞活力的方法

專利名稱：分離細胞質級分而不影響卵母細胞和胚胎細胞活力的方法
技術領域：
本發明涉及一種從卵母細胞中分離細胞質級分而不會影響卵母細胞受精能力的方法。本發明還涉及一種從胚胎細胞中分離細胞質級分而不會影響該細胞發育潛能的方法。
背景技術：
用于分析卵母細胞細胞質的方法需要破壞卵母細胞。因此，盡管在分析中提取的信息可能特別令人關注，但是研究者不能夠將卵母細胞作為完整的細胞單位根據從分析中提取的信息進行進一步研究。此外，隨后不能夠使卵母細胞受精并使之發育成胚胎、胎兒和嬰兒。
存在對研究卵母細胞中胞質機制而不影響卵母細胞受精能力的方法的需求。還存在對研究胚胎細胞中胞質機制而不影響該細胞發育潛能的方法的需求。可以將這些方法用于研究卵母細胞或胚胎細胞中的那些由線粒體介導并且是卵母細胞或胚胎細胞或來源于受精卵母細胞或胚胎細胞的子代中的功能異常或疾病的原因或懷疑可導致這些情況或與這些情況相關的機制。
本發明的描述本發明試圖滿足這些需求且在第一個方面中提供了一種從卵母細胞中分離細胞質級分而不會影響卵母細胞受精能力的方法，該方法包括包括從卵母細胞中釋放細胞質級分的步驟。從卵母細胞中釋放的細胞質級分的體積約占該卵母細胞體積的5％。優選該體積約占所述卵母細胞體積的2％。
在本發明第一個方面的一個實施方案中，所述的方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入卵母細胞；(b)將約占卵母細胞體積5％的細胞質級分抽入釋放裝置；和(c)從卵母細胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
抽入釋放裝置中的細胞質級分的體積一般小于10pL且優選8pL。優選釋放裝置包括至少一種ICSI移液管且優選將細胞質級分抽入移液管內約(100μm)。
從卵母細胞抽入釋放裝置中的細胞質級分一般在釋放裝置與卵母細胞之間形成細胞質內含物的擠出物。通過緩慢拉伸或剪切擠出物以分離擠出物而從卵母細胞中分離細胞質級分。優選通過拉伸擠出物而分離細胞質級分。
一般來說，細胞質級分含有胞質細胞器且包括卵母細胞線粒體和線粒體產物的樣品或由它們組成。
位于卵母細胞中的線粒體是一種模板，從受精卵母細胞中發展而來的子代內所有的線粒體來源于該模板。本發明者認為用于從卵母細胞中分離細胞質級分而不影響卵母細胞受精能力的方法能夠研究線粒體基因組的完整性與卵母細胞和由受精卵母細胞發展而來的子代的功能之間的相關性。
因此，在第二個方面，本發明涉及一種分析卵母細胞中線粒體基因組而不影響卵母細胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；b)分析級分中線粒體的線粒體基因組。
線粒體基因組突變可導致功能異常或疾病或至少與此相關。例如，可以理解來自線粒體基因組8470位-13,446位核苷酸的核苷酸序列缺失即所謂的“5kb共同缺失”與克-塞綜合征(KSS)和慢性進行性外眼肌癱瘓(CPEO)相關。可能或不可能因共同缺失而觀察到的導致疾病的其它缺失包括腦和心臟線粒體基因組中的7.4kb缺失和10.4kb缺失/插入以及各種點突變。在包括骨骼肌、心臟、腦、卵母細胞、白細胞、視網膜和卵巢在內的人體組織中也觀察到了這種缺失。
線粒體基因組中超過40個致病性點突變可能與涉及中樞神經系統、心臟、肌肉、內分泌系統、腎臟和肝臟的較廣范圍的退化性疾病相關。與點突變相關的疾病包括利氏綜合征、MELAS(線粒體性腦肌病、乳酸中毒和中風樣發作)、MERRF(伴有深紅(ragged-red)纖維的肌陣攣性癲癇)、NARP(神經病、運動失調和色素性視網膜炎)和LHON(利伯氏遺傳性視神經萎縮)。
一種從卵母細胞中分離細胞質級分而不影響卵母細胞受精能力的方法因卵母細胞與由受精卵母細胞發展而來的子代的功能完整性而用于檢測線粒體基因組中的核苷酸序列突變、能夠研究核苷酸序列、多態性或突變。
因此，在第三個方面中，本發明提供了一種檢測位于卵母細胞線粒體內的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變而不影響卵母細胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)對細胞質級分中線粒體的線粒體基因組核苷酸序列分析線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的存在。
如果導致疾病或功能異常或與之相關的線粒體基因組突變(包括點突變)大部分僅通過母系遺傳，那么一種分離細胞質級分而不影響卵母細胞受精能力的方法可用于預測來源于受精卵母細胞的子代是否會含有可導致疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與這些情況相關的線粒體基因組的核苷酸序列、多態性或突變。
因此，在第四個方面中，本發明提供了一種用于預測來源于受精卵母細胞的子代是否含有可導致疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與這些情況相關的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變的方法，其中該方法不會影響卵母細胞受精的能力，該方法包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的存在；其中核苷酸序列、多態性或突變的存在表明了來源于受精卵母細胞的子代含有核苷酸序列、多態性或突變的可能性。
僅在卵母細胞內線粒體的線粒體基因組中存在的核苷酸序列、多態性或突變(公知它們與疾病或功能異常相關或可導致這些情況或懷疑可導致這些情況)可能不足以介導卵母細胞自身或來源于受精卵母細胞的子代中的疾病或功能異常。實際上，看起來在含有核苷酸序列、多態性或突變的卵母細胞或來源于受精卵母細胞的子代中存在產生疾病或功能異常的可能性和/或嚴重性的至少一種其它因素。即卵母細胞內線粒體基因組中含有特殊核苷酸序列、多態性或突變的線粒體的實際比例或“閾值水平”為卵母細胞或來源于受精卵母細胞的子代中的疾病或功能異常提供了可能性和/或嚴重性。特別地且與核基因組相反，在卵母細胞中存在至少約100,000個拷貝的線粒體基因組。當卵母細胞含有一種以上的線粒體基因組時，觀察到了“異質性”。卵母細胞、且實際上來源于受精卵母細胞的子代的組織在將核苷酸序列、多態性或突變引入細胞時成為“異質性的”，而在引入前所述細胞含有單一種類的線粒體基因組。鑒于線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與這些情況相關，所以一般認為當異質性超過特定水平時，遲早會觀察到疾病或功能異常的表現。
為了獲得人卵母細胞中能代表所有線粒體基因組的樣品，根據對小鼠卵母細胞中線粒體在減數分裂的特定階段遷移至卵母細胞細胞質的特定區域、特別是核周區的觀察結果，一般將一種用于測定人卵母細胞中異質性程度的方法應用于減數分裂的特定階段。一種分離細胞質級分而不影響卵母細胞受精能力的方法可用于測定卵母細胞中的異質性水平并用于預測來源于受精卵母細胞的子代組織中異質性的平均水平或可能的范圍。
因此，在第五個方面中，本發明提供了一種測定卵母細胞中線粒體基因組的異質性水平而不影響卵母細胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；b)將級分中含有核苷酸序列、多態性或突變的線粒體基因組的數量與級分中不含核苷酸序列、多態性或突變的基因組數量進行比較。
由于來源于受精卵母細胞的子代中異質性水平和可導致疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與這些情況相關的核苷酸序列、多態性或突變的存在為疾病或功能異常提供了可能性和/或嚴重性，故可將測定卵母細胞中線粒體基因組異質性水平的方法用于預測來源于受精卵母細胞的子代是否可能患有由特殊核苷酸序列、多態性或突變導致或與此相關的疾病或功能異常，和/或疾病或功能異常的嚴重性。
因此，在第六個方面中，本發明提供了一種測定來源于受精卵母細胞的子代是否患有，或可能患有由線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變導致或與此相關的疾病或功能異常，其中該方法不會影響卵母細胞受精能力且包括下列步驟
a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態性或突變的存在；和測定所述子代是否可能患有疾病或功能異常，其中對級分中線粒體的線粒體基因組的分析表明相應于卵母細胞中核苷酸序列、多態性或突變的線粒體基因組的異質性水平至少與公知和疾病或功能異常的表現相關的異質性水平相同。
如上所述，用于分析來自卵母細胞的細胞質級分的方法包括破壞卵母細胞的步驟。盡管這些方法揭示了有關由此破壞的卵母細胞的信息，但是該信息的價值僅限于對未評價的其它卵母細胞的推斷。如果來自相同個體的卵母細胞群體就卵質內含物而言一般是異質的，那么來源于受破壞的卵母細胞的信息可以準確或可靠地推廣至其它卵母細胞的程度還存在一些問題。也就是說，使用這些方法不可能因為發現卵母細胞不具有可導致或相關于卵母細胞或受精卵母細胞子代中的疾病或功能異常的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變，或與核苷酸序列、多態性或突變相關的異質性程度較低，而推斷來源于相同個體的其它卵母細胞具有相同的線粒體基因型。因此，用于分析卵母細胞的這些方法限于體外受精領域，其中預計來源于患者的某些卵母細胞可以含有導致或相關于來源于受精卵母細胞子代中的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態性或突變。
從卵母細胞中分離細胞質級分而不影響卵母細胞受精能力的方法特別可用于篩選受精前卵母細胞中核苷酸序列、多態性或突變的存在，這些核苷酸序列、多態性或突變可導致來源于受精卵母細胞子代中的疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與此相關。
因此，在第七個方面中，本發明提供了一種篩選卵母細胞內線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的存在的方法，所述核苷酸序列、多態性或突變可導致來源于受精卵母細胞子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與此相關，其中該方法不會影響卵母細胞的受精能力且包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；
b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態性或突變的存在。
接受體外受精治療的患者通常可用于受精的卵母細胞很少，且這些有效卵母細胞中的某些可能在線粒體基因組中含有可導致或相關于受精卵母細胞子代中的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態性或突變。用于從卵母細胞中分離細胞質級分的其它方法特別不適于篩選受精用卵母細胞且可能導致破壞那些在其線粒體基因組中不含核苷酸序列、多態性或突變的卵母細胞或那些就所述突變而言具有低水平的異質性的卵母細胞，其中所述線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致疾病或功能異常或與之相關。
從卵母細胞中分離細胞質級分而不影響卵母細胞受精能力的方法特別可用于在受精前對不含導致或可能導致或相關于受精卵母細胞子代的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態性或突變的受精用卵母細胞進行篩選的方法。
因此，在第八個方面中，本發明涉及一種篩選受精用卵母細胞的方法，這種受精用卵母細胞(i)不含可導致受精卵母細胞子代的疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與此相關的卵母細胞內線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變；或(ii)就核苷酸序列、多態性或突變而言具有的線粒體基因組的異質性低于公知與疾病或功能異常的表現相關的異質性的水平；其中該方法不會影響卵母細胞受精能力且包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；b)分析級分中線粒體的線粒體基因組；和c)篩選受精用卵母細胞，條件是使卵母細胞線粒體基因組在核苷酸序列、多態性或突變方面異質性程度低于公知與疾病或功能異常的表現相關的異質性的程度。
可以使分別按照本發明第七或第八個方面篩選或選擇的卵母細胞通過胞質內精子注射(ICSI)或通過體外受精而受精。優選使卵母細胞通過ICSI受精。
就本發明的第八個方面特別適合于篩選受精用卵母細胞并可以在ICSI或IVF前使用而言，本發明者認為本發明第八個方面所包括的方法是新型體外受精過程的一個完整部分。
因此，在第九個方面中，本發明提供了一種使卵母細胞受精的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發明第一個方面的方法從卵母細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析可導致受精卵母細胞的子代中疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與此相關的核苷酸序列、多態性或突變的存在；和c)使卵母細胞受精，條件是使卵母細胞線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的異質性程度低于公知與疾病或功能異常的表現相關的異質性的程度。
按照標準技術可以分析按照本發明第一個方面的方法分離的屬于細胞質級分中的線粒體的線粒體基因組。這些技術已在后文中舉例說明，其包括聚合酶鏈反應(PCR)、限制性片段長度多態性(RFLP)分析、基因組雜交、核苷酸測序和基因功能檢測和/或測定。
既然測定了卵母細胞中線粒體基因組的異質性水平，那么在線粒體隨機分配入細胞質時可以獲得有代表性的基因組級分。優選當預計卵母細胞中線粒體的分布是隨機的，例如在初級卵母細胞的生發泡(GV)期和/或在次級卵母細胞的減數分裂中II期至融合生殖前的階段時，從卵母細胞中抽出細胞質級分。
當從卵母細胞中分離細胞質級分的方法不會明顯受卵母細胞代謝的干擾時，本發明者認為這種分離細胞質級分的方法可用于研究其它細胞、例如胚胎細胞的細胞質而不會影響這些細胞的發育潛能。
因此，在第十個方面中，本發明提供了一種從胚胎細胞中分離細胞質級分而不影響該細胞發育潛能的方法，該方法包括使細胞質級分從所述細胞中釋放出來的步驟。從細胞中釋放的細胞質級分的體積約占該細胞體積的5％。優選從細胞中釋放的細胞質級分的體積約占該細胞體積的2％。
在本發明第十個方面的一個實施方案中，所述方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入胚胎細胞；
(b)將約占胚胎細胞體積5％的細胞質級分抽入釋放裝置；和(c)從所述細胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
抽入釋放裝置中的細胞質級分的體積一般小于10pL且優選8pL。優選釋放裝置包括至少一種ICSI移液管且優選將細胞質級分抽入該移液管內約(100μm)。
將細胞質級分從胚胎細胞中抽入釋放裝置的過程一般在釋放裝置與胚胎細胞之間形成胞質內含物的擠出物。通過緩慢拉伸或剪切擠出物以分離該擠出物可以從胚胎細胞中分離細胞質級分。優選通過拉伸擠出物來分離細胞質級分。
一般來說，細胞質級分含有胞質細胞器且包括胚胎細胞線粒體和線粒體產物的樣品或由它們組成。
如上所述，已知線粒體基因組中的各種缺失和點突變可導致功能異常或疾病或至少與之相關。從胚胎細胞中分離細胞質級分而不影響該細胞發育潛能的方法可用于檢測線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變，它能研究核苷酸序列、多態性或突變在胚胎細胞和來源于胚胎細胞的子代中的功能完整性。
因此，在第十一個方面中，本發明提供了一種檢測胚胎細胞線粒體內的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變而不影響該細胞發育潛能的方法，該方法包括下列步驟a)按照本發明第十個方面的方法從胚胎細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)對細胞質級分中線粒體的線粒體基因組核苷酸序列分析線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的存在。
本發明者認為分離細胞質級分而不影響胚胎細胞發育潛能的方法可用于預測來源于胚胎細胞的子代是否會在線粒體基因組中含有可導致疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與之相關的核苷酸序列、多態性或突變。
因此，在第十二個方面中，本發明提供了一種用于預測來源于胚胎細胞的子代是否在線粒體基因組中含有可導致疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與這些情況相關的核苷酸序列、多態性或突變的方法，其中該方法不會影響所述細胞的發育潛能，該方法包括下列步驟a)按照本發明第十個方面的方法從胚胎細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態性或突變的存在。
其中核苷酸序列、多態性或突變的存在表明了來源于胚胎的子代含有核苷酸序列、多態性或突變的可能性。
正如本文上述所討論的，在觀察到由線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變導致或與之相關的疾病或功能異常的表現之前必須超過異質性的特定水平是可能的。
因此，在第十三個方面中，本發明提供了一種測定胚胎細胞中線粒體基因組異質性水平而不影響該細胞發育潛能的方法，且該方法包括下列步驟a)按照本發明第十個方面的方法從胚胎細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)將級分中含有核苷酸序列、多態性或突變的線粒體基因組的數量與級分中不含核苷酸序列、多態性或突變的基因組數量進行比較。
因此，在第十四個方面中，本發明提供了一種測定來源于胚胎細胞的子代是否可能患有由線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變導致或懷疑由這些因素導致或與此相關的疾病或功能異常的方法，其中該方法不會影響所述細胞的發育潛能且包括下列步驟a)按照本發明第十個方面的方法從胚胎細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)對級分中線粒體的線粒體基因組分析核苷酸序列、多態性或突變的存在；測定所述子代是否可能患有疾病或功能異常，其中對級分中線粒體的線粒體基因組的分析表明胚胎細胞的線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的異質性水平至少與公知與疾病或功能異常的表現相關的異質性水平相同。
在胚胎轉移過程開始前，重要的是選擇(i)一種胚胎，其線粒體基因組不含可導致或懷疑可導致或相關于疾病或功能異常的核苷酸序列、多態性或突變；和/或(ii)一種胚胎，其核苷酸序列、多態性或突變具有低水平異質性。
從胚胎細胞中分離細胞質級分而不影響該細胞發育潛能的方法特別可用于，在胚胎轉移前，篩選不含可導致或懷疑可導致或相關于來自胚胎細胞的子代的疾病或功能異常的核苷酸序列、多態性或突變的、用于胚胎轉移的胚胎。
因此，在第十五個方面中，本發明提供了一種篩選胚胎轉移所用胚胎的方法，這種胚胎(i)不含來自該胚胎之胚胎細胞線粒體的線粒體基因組的核苷酸序列、多態性或突變，所述核苷酸序列、多態性或突變可導致或懷疑可導致或相關于該胚胎細胞或胚胎的子代的疾病或功能異常；或(ii)線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的異質性水平低于公知與疾病或功能異常的表現相關的異質性水平；其中該方法不會影響胚胎發育潛能且包括下列步驟a)按照本發明第十個方面的方法從胚胎細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和b)分析級分中線粒體的線粒體基因組；和c)篩選用于胚胎轉移的胚胎，條件是使胚胎細胞線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的異質性程度至少低于公知與疾病或功能異常的表現相關的異質性程度。
在第十七個方面中，本發明涉及一種在從卵母細胞中或從胚胎細胞中分離細胞質級分的方法中應用的試劑盒。該試劑盒包括至少一種對卵母細胞或胚胎細胞內線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變具有特異性的核苷酸探針，其中所述線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致來源于受精卵母細胞或胚胎細胞的子代中的疾病或功能異常或懷疑可導致這些情況或與此相關。在一個實施方案中，至少一種核苷酸探針對線粒體基因組中表1中所示的任意一種核苷酸序列突變具有特異性。
表1位置 RNA 基因 疾病721 r12SADPD阿爾茨海默病/帕金森病1555 r12SDEAF，弱1606 tVal腦肌病(Encephalomyopathy)1642 tVal MELAS1644 tVal 利伯氏病(Leighs)3010 r16s 長壽3196 r16s ADPD3243 tLeu(UUR) MELAS3250 tLeu(UUR) MM線粒體肌病3251 tLeu(UUR) MM3254 tLeu(UUR) 糖尿病3256 tLeu(UUR)3260 tLeu(UUR) HCM肥大性心肌病3271 tLeu(UUR) MELAS晚期發作而非32433288 tLeu(UUR) MM3302 tLeu(UUR) MM3303 tLeu(UUR) HCM/MM3394 mND1 LHON還涉及ECG中的長U間隔3397 mND1 ADPD3460 mND1 LHON嚴重型4160 mND1 LHON+4216 mND1 LHON4269 tIle FICP嬰兒致死性心肌病+4274 tIle CPEO4317 tIle FICP4336 tGln ADPD(弱)4917 mND2 LHON5178 mND2 長壽5244 mND2 LHON5521 tTrp 肌病，晚期發作6480 mCOI6930 COI G6930A(終止密碼子)多系統7444 mCOI LHON7445 mCOI PPK掌跖角皮病和聽覺喪失7472 tSer肌陣攣性癲癇，w/o RRF7497 tSerMERRF肌陣攣性癲癇等7512 tSer肌陣攣性癲癇，w/o RRF8342 tLys外眼肌麻痹，肌病，w.o RRF8344 tLysMERRF肌陣攣性癲癇，深紅纖維；脂肪過多癥8356 tLysMERRF8414 mATP8 長壽8851 ATP6 雙側紋狀體壞死8860 ATP6 正常A-＞G8993 mATP6 NARP/Leighs神經原性衰弱，運動失調，視網膜炎9176 mATP6 雙側紋狀體壞死9438 mCOILHON9804 mCOILHON9997 tGlyHCM10004 tGly兒童期猝死？10010 t 腦肌病10410 tArgAlpers綜合征11778 mND4LHON嚴重型18832 mND4肌病12258 tLeu2(CUN) 色素性視網膜炎，感覺神經性聽覺喪失12300 tLeu2(CUN) 針對UUR讀碼的反密碼子突變12320 tLeu2(CUN) 肌病患者老化加劇13708 mND5LHON13730 mND5LHON14459 mND6LHON或利伯氏病14569 mND6LHON或利伯氏病14484 mND6LHON嚴重型14709 tGlu可變的嬰兒肌病至NIDDM14826 cytb 運動不耐受性15084 mcytb 運動不耐受性15168 mcytb 運動不耐受性15257 m cytbLHON15498 第24位核 cytb運動不耐受性苷酸缺失15723 m cytb運動不耐受性15762 m cytb肌病，晚期發作15812 m cytbLHON15923 t Thr LIMM嬰兒致死性線粒體肌病15990 t Pro MM16189 D NIDDM 非胰島素依賴型糖尿病N＝任意的核苷酸R＝兩種嘌呤(A，G)之一Y＝兩種嘧啶(U，C)之一可以按照標準技術分析按照本發明第十個方面的方法分離的屬于細胞質級分中的線粒體的線粒體基因組。這些技術已在后文中舉例說明，包括聚合酶鏈反應(PCR)、限制性片段長度多態性(RFLP)分析、基因組雜交、核苷酸測序和基因功能檢測和/或測定。
在另一個方面中，本發明提供了包括下列序列的核苷酸ATP6FTCACCACCCAACAATGACATP6RTAAGGCGACAGCGATTTC定義在本說明書和權利要求中，“卵母細胞”指的是包括初級卵母細胞和次級卵母細胞在內的雌性生殖系細胞并且包括人卵母細胞。初級卵母細胞包括減數分裂GV(生發泡)期的生殖細胞。次級卵母細胞包括減數分裂中II期的生殖細胞。
在本說明書和權利要求中，“來源于受精卵母細胞的子代”指的是由雌性生殖細胞與雄性生殖細胞受精而產生的個體。“個體”指的是從胚胎生命最早期(例如，2細胞階段)到成體生命的多細胞生物體。
在本說明書和權利要求中，“不影響卵母細胞受精能力”指的是帶有所分離的細胞質級分的卵母細胞可以受精；或者換句話說，它們可以經歷與受精過程中任意一個或多個階段相關的任意一種或多種生化或細胞過程，從精子的進入而激活卵母細胞開始到產生受精卵并形成受精卵的分裂產物。一般在分離細胞質的級分后，可以通過例如包括ICSI和IVF在內的標準技術在體外使卵母細胞受精。
在本說明書和權利要求中，“胚胎細胞”包括雌性與雄性生殖細胞的有性生殖后的融合產物受精卵和從2細胞階段到植入階段的任意發育階段的受精卵分裂產物。
在本說明書和權利要求中，“來源于胚胎細胞的子代”或“來源于胚胎的子代”指的是由雌性與雄性生殖細胞的有性生殖后的融合產物產生的個體。“個體”指的是從胚胎生命最早期(例如，2細胞階段)到成體生命的多細胞生物體。
在本說明書和權利要求中，“不影響細胞發育潛能”或“不影響胚胎發育潛能”指的是帶有所分離的細胞質級分的胚胎細胞和產生胚胎細胞的胚胎可以經受與細胞分化和/或成熟相關的任意一種或多種生化或細胞過程。
附圖簡述附

圖1表示使用寡核苷酸引物L29和H04從來源于卵母細胞A1-A7的細胞質活檢樣品的線粒體基因組D-環區擴增的400bp(by)片段。
附圖2表示使用相應于mtDNA 8201和8472位的引物擴增分離自胚胎細胞的線粒體基因組的271bp片段。
實施本發明的最佳方法1.卵母細胞的活檢材料和方法卵母細胞的來源將人卵母細胞A1-A5用于研究。這些卵母細胞是生發泡(GV)細胞或處于減數分裂的MI期的細胞，已恢復6小時。
將人卵母細胞B1-B8用于研究。這些卵母細胞處于減數分裂的MII期并且是提取(retrieval)后24小時的細胞。
以要求參與研究的患者命名人卵母細胞C1。該卵母細胞處于減數分裂的MII期并且是提取后24小時的細胞。
卵母細胞細胞質級分的分離使用ICSI移液管(Sydney IVF，Sydney)對來自人卵母細胞的少量卵質物質進行活檢。簡單地說，所述的移液管是一種拉出具有約7μm直徑的末端并帶有斜尖端的玻璃毛細管。
如下實施活檢技術將卵質抽入所述移液管內約100μm(約8pl)。然后從卵母細胞中抽出移液管而形成薄卵質橋，隨后通過拉伸將其打斷。直接將各卵質活檢物排入含有20μl的PCR緩沖液、蛋白酶K和20mM DTT的PCR管中。在37℃下將管培養過夜或在50℃下培養30分鐘，然后冷凍。兩種方案均隨后在95℃下將蛋白酶K加熱10分鐘使之失活。
卵母細胞細胞質級分中線粒體基因組的分析通過聚合酶鏈反應(PCR)來分析卵母細胞細胞質級分中的線粒體基因組。
(i)D-環片段建立20μl反應物；將10μl反應混合物加入到10μl卵質活檢制劑中。101反應混合物含有引物各2.5pmol、dNTP各200μM、PCR緩沖液、milli-Q水和0.5個單位的Taq。所有反應均在加蓋的0.2ml長管(tube strips)中進行。在下列條件下在FTS熱測序儀(Corbett Research，Sydney，NSW)中進行PCR循環在93℃下起始變性5分鐘；隨后進行93℃變性45秒、60℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘的24-40個循環；通過72℃下7分鐘的補齊步驟結束；冷卻至15℃并保持在4℃下。所有PCR反應均以缺乏模板DNA的全反應混合物作為陰性對照。
使用特異性針對線粒體D-環區中400bp序列的引物L29(5’-GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3’)和H04(5’-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3’)。
(ii)共同缺失片段使用與上述相同的方案，不過應用下列條件在95℃起始變性3分鐘；隨后進行92℃變性1分鐘、60℃退火10秒和68℃延伸45秒的20-35個循環；通過75℃下7分鐘的補齊步驟結束；冷卻至15℃并保持在4℃下。從第11個循環開始，每個循環加入15秒的延伸時間。所有PCR反應均以缺乏模板DNA的全反應混合物作為陰性對照。
通過共同缺失區對4977具有特異性的引物L820(5’-TTCATGCCCATCGTCCTAGA-3’)和H1363(5’-GGGGAAGGGAGGTTGACCTG-3’)要求應用改良型酶ExpandTM高保真(High Fidelity)，這是因為需擴增較大片段PCR程序特別“長”所導致的。
在丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺37∶1的5％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳來分析來自D-環區或所述共同缺失區的擴增的DNA片段。
已活檢的卵母細胞的受精按標準方案(1、2)通過ICSI或IVF使B1-B8卵母細胞和C1卵母細胞受精。在對卵母細胞進行胞質活檢后立即進行受精。
結果胞質活檢后卵母細胞的結局卵母細胞A1-A5顯然不受胞質活檢過程的影響且在活檢后48小時時沒有表現出退化的征兆。卵母細胞B1-B3和B5-B8在活檢后的48小時時沒有表現出退化的征兆。卵母細胞C1在活檢后的48小時時沒有表現出退化的征兆。僅有卵母細胞B4在活檢后的17小時時退化(表2)。
表2卵母細胞胞質活檢活檢后17小時活檢后48小時A1 有 不退化A2 有 不退化A3 有 不退化A4 有 不退化A5 有 不退化B1 有 不退化B2 有 不退化B3 有 不退化B4 有 退化B5 有 不退化B6 有 不退化B7 有 不退化B8 有 不退化C1 有 不退化從胞質活檢物經PCR擴增線粒體DNA
考慮從取自卵母細胞的胞質活檢物擴增線粒體DNA。有必要計算可能在這類活檢物中獲得的線粒體的近似量以便確定是否存在足以用于PCR的模板DNA。
如上所述通過使用ICSI移液管獲取胞質活檢物。據估計這種胞質活檢物的體積約為8pl。由于卵母細胞的體積約為500pl，據估計取出的胞質活檢物包括約2％的細胞質。據一種保守的估計，每個卵母細胞中存在約100,000個線粒體基因組(3)。根據這一估計，活檢取出了約1000個線粒體。這一線粒體的量在聚合酶鏈反應擴增能力的范圍內。
從D-環區進行PCR擴增通過35個循環的擴增從卵母細胞A1-A5的胞質活檢物擴增400bp的D-環片段(附圖1)。
從其同缺失區進行PCR擴增從卵母細胞B1-B3和B5-B8的胞質活檢物擴增5.5kb的片段(數據未顯示)。
已活檢的卵母細胞的受精已活檢的卵母細胞B1-B8和C1的受精結果如表3中所示。
表3卵母細胞 IVF/ICSI 活檢后17小時活檢后48小時B1ICSI2PN2細胞B2ICSI2PN未分裂B3ICSI3PN2細胞B4ICSI退化B5IVF未受精B6IVF未受精B7IVF未受精B8IVF未受精C1ICSI2PN2細胞PN＝觀察到的原核使進行ICSI方案的所有卵母細胞(除B4外)受精。在受精后17小時在B1、B3和C1中觀察到兩個原核，在B3中觀察到3個原核。卵母細胞B1、B3和C1發生分裂并在受精后48小時進化成2細胞期。在48小時時的B2中沒有觀察到細胞分裂。
盡管B5-B8卵母細胞在活檢后48小時時沒有退化，但是這些卵母細胞中無一通過經IVF方案的受精而受精。
討論僅在實施胞質活檢技術的14種卵母細胞中的一種中觀察到了退化現象。由于某些卵母細胞在提取后約24小時傾向于退化(4、5)，故可能B4卵母細胞不依賴于胞質活檢技術而退化。應注意卵母細胞A1-A5在特別為受精而不是為使卵母細胞成熟而配制的培養基中成熟。
結果表明一般可以將胞質活檢技術應用至提取卵母細胞后24小時。由此能夠將這種活檢技術與公知的受精技術一起應用，所述的公知受精技術例如包括ICSI和IVF，一般將它們在提取卵母細胞的約4-6小時后使用。盡管在本研究中在活檢后立即進行受精，但是希望可以在受精后進行活檢。
我們發現ICSI過程(即注射精子而不除去細胞質)后形態上完整的卵母細胞百分比為95.2％(以注射的2649個卵母細胞為基準)(未公布結果)。
通過與未記錄的其它種類中為核移植而除去極體和下面的細胞質后的退化率比較，仍然難以建立用于其它類型顯微操作的標準(6、7)。在人卵母細胞中進行胞質注射，據報導外源線粒體注射的存活率為30.8％(67/217)，裂解率為6％。
盡管除去細胞質比單獨使用ICSI更具有侵害性，但是在本研究中卵母細胞的總體存活率令人意外地高于我們上述討論的標準ICSI后的存活率。因此，可認為胞質活檢技術在臨床上是可接受的。
對胞質活檢中線粒體基因組D環區和共同缺失區片段的擴增表明，活檢樣品中存在足夠進行PCR分析的模板DNA，可從該樣品中擴增0.5kb以下至5kb以上的片段。對線粒體基因組的2個獨立基因座片段的擴增提示，使用PCR和特異性寡核苷酸可以從胞質活檢樣品中擴增線粒體基因組的其它基因座上的突變、特別是表1中所述的突變。
鑒于在這些實驗組中指定的卵母細胞在進行胞質活檢時已經存活了24小時以上且嘗試對其進行受精，所以有助于提高受精率和隨后的分裂率。預先的研究已經表明，在受精前培養20小時以上可以兼顧卵母細胞的受精和發育(4、5)。此外，在體外成熟的卵母細胞缺乏體內成熟的卵母細胞維持高分裂率的能力(8)。由于這一原因，所以B5-B8卵母細胞在通過IVF方案受精后不再受精這一事實并不令人意外。
2.胚胎細胞材料和方法胚胎細胞的來源使冷凍的研究用胚胎(3個二原核的胚胎、1個二細胞的胚胎和1個四細胞的胚胎)解凍并在生長培養基中平衡。
胚胎細胞胞質級分的分離使用標準ICSI對3個單細胞胚胎和來自每種多細胞胚胎的1個細胞進行活檢。在每種情況中將移液管導入胞質區域并抽出相當于細胞體積約5％的細胞質等分部分。將這一等分部分轉入蔗糖溶液。使胚胎返回培養箱以使其連續生長。
對胚胎細胞胞質級分中線粒體基因組的分析用氫氧化鉀使細胞質制備物呈堿性并加熱至90℃持續5分鐘。在用TrisHCl中和后，將一等分部分加至含有線粒體DNA特異性引物的反應混合物中，以擴增相應于mtDNA 8201和8472位的271個堿基對的片段。線粒體基因組中的該區包括氧化酶和ATP酶的編碼區部分。使用能夠實時監測與雙鏈DNA擴增相關的熒光增加的熱循環僅對該混合物進行PCR擴增。試劑和培養基空白對任何熒光改變來說是陰性的。通過與對照組人DNA的外部稀釋液進行比較來分析DNA的拷貝數。
結果對來自胞質活檢的線粒體DNA進行PCR擴增全部5個樣品顯示出存在線粒體靶DNA。表4表示活檢樣品中估計的mtDNA拷貝。
表4

活檢后胚胎的結局活檢過程后約24小時使用顯微鏡檢驗胚胎以確定它們的個體持續活力。2PN胚胎中僅有一個沒有分裂，不過，在原始的2細胞和4細胞胚胎中觀察到了某些退化的細胞物質。3天后，進一步的觀察結果表明兩個胚胎已經進化而形成胚泡。
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權利要求
1.一種從卵母細胞中分離細胞質級分而不會影響卵母細胞受精能力的方法，該方法包括從卵母細胞中釋放約占該卵母細胞5％體積的細胞質級分的步驟。
2.一種根據權利要求2所述的方法，其中所述的級分約占所述卵母細胞體積的2％。
3.一種根據權利要求1所述的方法，該方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入卵母細胞；(b)將約占卵母細胞體積5％的細胞質級分抽入釋放裝置；和(c)從卵母細胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
4.一種根據權利要求3所述的方法，其中所述級分的體積小于10pL。
5.一種根據權利要求4所述的方法，其中所述級分的體積等于卵母細胞細胞質可以抽取至胞質內精子注射(ICSI)移液管內約100μm的體積。
6.一種根據權利要求1所述的方法，其中所述的細胞質級分包括線粒體。
7.一種根據權利要求3所述的方法，其中所述的釋放裝置包括一種注射移液管。
8.一種根據權利要求7所述的方法，其中所述的注射移液管是一種ICSI移液管。
9.一種檢測卵母細胞內線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變而不影響該卵母細胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權利要求1所述的方法從卵母細胞中分離包含線粒體的細胞質級分；和(b)對細胞質級分中線粒體基因組的核苷酸序列進行分析以明確線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的存在。
10.一種根據權利要求9所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態性或突變可導致卵母細胞或來源于受精卵母細胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與這些情況相關。
11.一種根據權利要求10所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態性或突變如表1中所示。
12.一種測定卵母細胞中線粒體基因組的異質性水平而不影響卵母細胞受精能力的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權利要求1所述的方法從卵母細胞中分離包含線粒體的細胞質級分；和(b)將級分中含有核苷酸序列、多態性或突變的線粒體基因組的數量與級分中不含核苷酸序列、多態性或突變的基因組數量進行比較。
13.一種根據權利要求12所述的方法，其中分離出細胞質級分的卵母細胞是處于卵母細胞發育之生發泡期的初級卵母細胞或處于從減數分裂的中II期至融合生殖之前的卵母細胞發育期的次級卵母細胞。
14.一種根據權利要求13所述的方法，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致卵母細胞或來源于受精卵母細胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況的原因，或與這些情況相關。
15.一種根據權利要求14所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態性或突變如表1中所示。
16.一種從胚胎細胞中分離細胞質級分而不會影響該細胞發育潛能的方法，該方法包括從所述細胞中釋放約占該細胞體積的5％的細胞質級分的步驟。
17.一種根據權利要求16所述的方法，其中所述的級分約占所述細胞體積的2％。
18.一種根據權利要求16所述的方法，該方法包括下列步驟(a)將釋放裝置插入胚胎細胞；(b)將約占所述細胞體積5％的細胞質級分抽入釋放裝置；和(c)從所述細胞中抽出釋放裝置而使所述級分從釋放裝置中分離出來。
19.一種根據權利要求18所述的方法，其中所述級分的體積小于10pL。
20.一種根據權利要求19所述的方法，其中所述級分的體積等于胚胎細胞細胞質可以抽入ICSI移液管內100μm的體積。
21.一種根據權利要求16所述的方法，其中所述的細胞質級分包括線粒體。
22.一種根據權利要求18所述的方法，其中所述的釋放裝置包括一種注射移液管。
23.一種根據權利要求22所述的方法，其中所述的注射移液管是一種ICSI移液管。
24.一種檢測胚胎細胞內線粒體的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變而不影響該細胞發育潛能的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權利要求16所述的方法從胚胎細胞中分離包括線粒體的細胞質級分；和(b)對細胞質級分中線粒體基因組的核苷酸序列進行分析以明確線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的存在。
25.一種根據權利要求24所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態性或突變可導致胚胎細胞或來源于胚胎細胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與這些情況相關。
26.一種根據權利要求25所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態性或突變如表1中所示。
27.一種測定胚胎細胞中線粒體基因組的異質性水平而不影響該細胞發育潛能的方法，該方法包括下列步驟(a)按照權利要求16所述的方法從胚胎細胞中分離包含線粒體的細胞質級分；和(b)將級分中含有核苷酸序列、多態性或突變的線粒體基因組的數量與級分中不含核苷酸序列、多態性或突變的基因組數量進行比較。
28.一種根據權利要求27所述的方法，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致胚胎細胞或來源于該細胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與這些情況相關。
29.一種根據權利要求28所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多態性或突變如表1中所示。
30.一種在權利要求9或權利要求12所述方法中使用的試劑盒，該試劑盒包括能夠檢測線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的寡核苷酸，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致卵母細胞或來源于受精卵母細胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與這些情況相關。
31.一種在權利要求24或權利要求27所述方法中使用的試劑盒，該試劑盒包括能夠檢測線粒體基因組中核苷酸序列、多態性或突變的寡核苷酸，其中所述的線粒體基因組中的核苷酸序列、多態性或突變可導致胚胎細胞或來源于胚胎細胞的子代中的疾病或功能異常，或懷疑可導致這些情況，或與這些情況相關。
32.一種根據權利要求30或權利要求31所述的試劑盒，其中所述的寡核苷酸能夠檢測表1中所示的核苷酸序列、多態性或突變。
全文摘要
本發明公開了一種從卵母細胞中分離細胞質級分而不會影響卵母細胞受精能力的方法,該方法包括包括從卵母細胞中釋放約占該卵母細胞體積的5%的細胞質級分的步驟。本發明還公開了一種從胚胎細胞中分離細胞質級分而不會影響該細胞發育潛能的方法,該方法包括從所述細胞中釋放約占該細胞體積5%的細胞質級分的步驟。
文檔編號G01N33/50GK1341212SQ00804183
公開日2002年3月20日 申請日期2000年2月23日 優先權日1999年2月23日
發明者羅伯特·詹森, 凱利·德博爾 申請人:悉尼Ivf有限公司