專利名稱：藥用植物制品的品質管制及標準化方法
技術領域：
本發明是關于藥用植物物料的標準化及品質管制中NMR譜及生物學定性結合以電腦為基礎的統計方法的用途。
世界上許多社會多個世紀以來已發展成傳統醫藥系統，此系統主要依賴使用植物和草藥作為治療物質。此處所謂“植物”一詞包括各種植物，包括了草藥及真菌。
近幾年來，人們對直接使用植物及植物萃取物作為健康改良劑的興趣有明顯的增加，例如使用人參(Panax ginseng)，大蒜(Alliumsativum)，白果(Ginkgo biloba)，金絲桃(Hypericum perforatum)，球菊(Echinacea angustifolia)及蘆薈(Aloe vera)。這些都可從市場上當作草藥制品及食物補品購得，全世界此等制品的年銷售量已達幾百億美元。盡管市場潛力如此之大，醫藥工業的主流到目前為止仍未將其注意力轉向衍生自植物的醫藥制品的開發上。這部分是因為植物材料的復雜性質及其先天的非劃一性，包括尚未建立起一套系統，以此系統保證此類制品得到藥物規范的批準。
用于以草藥及植物為基礎的藥物上的物料一般都是全植物、植物的一部分或植物或真菌的萃取物。由于植物及真菌物料含多種不同的化學成分，從定義上說，此等物料是復合混合物。所以此等物料在標準化及品質管制上有相當的困難。上述的傳統中藥及印度藥所用的許多藥方都是二種或更多種以植物為基礎的成分的混合物。所以此類藥物都是混合物的混合物，較單一植物物料為基礎的草藥更難分析。而且，此類藥物的制造方法又常是尚未揭示的。此諸多因素使取自表面一樣而本質不同來源的同一給定藥物的二個樣品都難以確保是含相同的成分的混合物。此一導致難以就此類藥物作品質管制的問題，一直限制了西方草藥師接受東方草藥。
草藥中所用的植物常不能從當地取得，所以需由距使用者很遠的地方取得。而此類植物由遠地供應又可能是不穩定的或不準確的。尤以此等植物缺少詳細的論述時為然，如缺少認證及品質標準。藥用植物內的各成分的復合混合物，可能因多種因素而在型式及濃度上有很大的出入，這包括植物來源、產地；收獲時此植物已長了多少年、物料儲存及加工條件、所用萃取方法等。當此等植物又與其他植物混合時，例如根據傳統中國草藥處方混合，所生成的制品的變化就更大了。
事實上，現在遠無法確保，由不同來源的給定植物物料會有相同的均一性及生物活性。本發明通過提供一種標準化藥用植物物料的方法而得以解決此問題。此法注意植物物料內各成分的總量，而不管其內在性質及其在植物內的生化作用。此法包括對植物物料在化學含量及生物學作用上的一致性的探究。
是以，本發明方法提供一種以已知的具有特定所需性質的物料的樣品作為標準而定義給定的植物物料的標準的方法。標準的規格是將已知樣品送至(a)NMR譜與以電腦為基礎的花樣認知技術結合，及(b)一或多種生物學定性技術而確定的，以如此所得結果作為標準規格。然后將該植物料的“待用”樣品做試驗，看是否與標準相符。視其分析結果是在已確定的規格范圍內還是部分或完全在規格范圍之外而決定是否采用。
因之，本發明提供一種確立藥用植物物料的標準規格的方法，此法包括(i)制備藥用植物物料樣品的試驗溶液或試驗萃取物，此物料所具有的每一性質都需標準化；(ii)將該溶液或萃取物送至二個或更多的分析方法中，此等方法包括(a)結合NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術的方法，及(b)一或多種生物學定性技術；(iii)由步驟(ii)所用的方法取得結果；及(iv)以步驟(iii)所取得結果為基礎建立該植物物料的標準規格。
是以，由步驟(iv)所得標準規格是建立于NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知及一或多種生物特性技術所得結果之上的。然而，當試驗待用藥用植物物料樣品是否與標準相符時，并不須將樣品都作NMR譜分析及生物學特性定性。而是，將所有待用樣品都作NMR譜及花樣認知，只有選出的待用樣品，例如從批量藥用植物物料定期抽出的樣品，作是否與標準規格相符的生物學特性試驗。此目的在原則上有賴于分析方法，此法最適用于大量生產時的方便而快速操作。此即NMR譜及花樣認知分析。此生物技術一般以NMR譜及花樣認知結果為基礎在隨機的基礎上用于使采用或不采用待用樣品的決定更加合理和有力。
根據本發明，還提供一種供應藥用植物物料樣品的方法，此樣品是與前面所定義的該植物物料標準規格相符的，此法包括(i′)制備藥用植物物料待用樣品的試驗溶液或試驗萃取物；(ii′)將該溶液或萃取物作NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術的分析；(iii′)從步驟(ii′)的分析取得結果；及(iv′)如果步驟(iii′)所取得結果符合該植物物料于上步驟(iv)所作的標準規格，則選用此待用樣品。
此法可使用于大批量。由不同批的相同植物物料取得的待用樣品作步驟(i′)至(iv′)分析。當選取待用樣品除NMR譜及花樣認知試驗外還作生物學特性試驗時，步驟(iv′)可用下述步驟代替(iv′a)將步驟(i′)所制備的溶液或萃取物送至一或多種生物特性試驗技術；(iv′b)從用于(iv ′a)每一技術得到結果，及(iv′c)如果由步驟(iii′)及(iv′b)所得結果與該物料于上述步驟(iv)所確立的標準規格相符，則選用該待用樣品。
有關生物特性定性技術后面會有詳細說明。
本發明說明中所謂“所需的標準性質”可以是藥用植物物料所具有的任何性質或品質，或屬于藥用植物物料的任何性質或品質。此性質的例子包括已臨床證明了的治療效果，醫藥級的品質，給定植物屬的特定多樣性，已證明的來源(以生長處所或商業批量)及特定病理狀況。所涉及的病理狀況可以是給定的成熟程度，此成熟程度是以，例如，收獲時間所決定的，或是對寄生蟲、除草劑、殺蟲劑或其他對所涉及植物可能構成損害的藥劑的確定的耐受性。
在本發明較佳方面，“已知具有標準所需的性質或每一性質”的藥用植物物料樣品是產地已知的經證實的及查證的樣品。其標準規格是以樣品經上述NMR譜/花樣認知和生物學特性定性的分析確立的。相同植物物料的以后的樣品，其來源或品質是未知的或有疑問的，可以所確立的標準規格試驗其是否相符以作為此物料的證實及查證。
核磁共振譜(NMR)本身是已知的，可作為研究植物物料的分析工具。其應用之一例是驗證源于水果的飲料。其用法之一是以位置特異天然同位素分離技術(SNIF-NMR)使用氫-2NMR譜作為確定證實水果汁的手段。例如，于Martin等的JAOAC Int.1996 Jul-Aug.79(4)917-928中即說明了使用氫-2NMR譜(SNIF-NMR法)測定曾摻了甜菜糖的水果汁。此技術有賴于這樣的事實，當水果汁或水果濃縮物發酵時，甲基位置上的單氘化的乙醇分子的含量會因甜菜糖的加進而降低。是以，任何加了甜菜糖的水果汁樣品，較對應的證實的樣品會有明顯低的(D/H)同位素比。此一技術也用氫-2NMR譜使用于檢測酒是否加了糖，如Martin等于J.Chim.Phys.Chim Biol.1983，vol80，293-297頁所報告。
氫-1NMR不宜用于植物物料，因為其所生成的譜太難以用眼睛分析。此問題的解決，如Kowalski and Bender于J.Am.Chem.Soc.1972，94.5632-5639所報告，是以適宜的多變數統計分析分析所得數據，例如主成分分析(PCA)。此為一種花樣認知技術，其中數據的維數被合并的相關變數(譜中的峰)所降低，形成新的較小的獨立正交變數集合(set)，稱作主成分(PCs)。此等PCs依據其能力排序以解釋原始數據中所含的變數。將樣品投入由第一PCs跨越的空間即可發現與樣品在生物化學組成上的相似性或不相似性。也可將未知的或試驗樣品投于此空間，以觀察與對照樣品的比較(Vogels et al，J.Agric.Food Chem.44，175-180，1996)。
氫-1NMR譜與花樣認知技術的結合曾于桔汁的證實上用作篩檢工具(Vogels et al，1996 loc.cit)。可以此法測定懷疑摻有別的東西的樣品。然后以PCA結果與原始NMR譜中特定共振的相關性測定所涉及的污染物。
結合氫-1NMR譜及碳-13NMR譜與PCA也曾用于辨別各種酒的來源(Vogels et al，Chemometrics and Intelligent LaboratorySystemsLaboratory Information Management，21(1993)249-258)。來自德國不同酒產區的不同的酒以統計分析法觀察時，顯示不同區的酒的樣品有不同的叢集。然后再由PCA數據重新構成的譜以顯示出特定酒成分(例如，單糖，如葡萄糖、甘露糖、鼠李糖及半乳糖)的NMR譜峰。類似的研究在別處也有報道，例如Vogels et al.于Trends inFlavour Research，Maarse & Van de Heij(Eds)，Elsevier，Amsterdam(1994)99-106頁所述。
氫-1NMR譜及主成分的分析的另一種應用由Trerisan et al.于“Characterisation of cell suspension cultures of hop，Humulus lupulusL.”第8章報告過，此文獻見于University of Leiden，the Netherlands，95-122頁，1997年出版。作者將氫-1NMR譜及PCA用于處理細胞萃取物，其目的在證實細胞經處理后特定代謝物的積蓄。他們的興趣在于追蹤NMR譜的峰，此等峰是因個別細胞成分而不同。
與前述報告方法目反，本發明所用NMR譜及花樣認知方法不需研究要分析的植物的生物化學，也不是要找出植物物料的花樣認知結果與特定NMR譜共振的相互關系。而是依賴NMR數據所產生的叢集固有的花樣所供給的資料，而此等數據又反映出植物物料內對所用的NMR譜技術有反應的化合物的總體。
本發明所用的以電腦為基礎的花樣認知與NMR譜的結合(后稱NMR譜/花樣認知)一般包括(a)將試驗溶液或試驗萃取物作NMR譜分析并記錄一個或多個NMR譜；及(b)將NMR譜分析取得的數據作多變時分析，在圖表(scoreplot)上產生一或多個點。
當用NMR譜/花樣認知分析確定藥用植物物料的標準規格時，上述步驟(ii)所得的圖表上的一個或數個點的周圍可界定出可接受的范圍。此范圍構成規格的一部分。然后根據待用樣品所作的上述NMR譜/花樣認知分析，依其步驟(ii)中所得的點是在范圍內或外決定其可接受或不能接受。
NMR譜/花樣認知分析本身可用作標準化藥用植物物料的方法。因之，本發明一方面提供供應與已確定的物料標準規格相符的此藥用植物物料樣品的方法，此法包括(i″)制備該植物物料待用樣品的試驗溶液或試驗萃取物；(ii″)將試驗溶液或萃取物作NMR譜分析并記錄一個或多個NMR譜；(iii″)將每一NMR譜所得數據送至多變數分析，在圖表上產生一或多個點；及(iv″)只在于步驟(iii)圖表上所產生的點落于標準規格所定義的可接受范圍時才選出待用樣品作為符合該標準規格的樣品。
本發明此方面的標準規格可以下法提供，此法包括(i)制備已知具有標準所需性質的該植物物料的試驗溶液或試驗萃取物；(ii)將試驗溶液或萃取物作NMR譜分析并記錄一個或多個NMR譜；(iii)將每一個NMR譜所得數據送至以電腦為基礎的多變數分析，于圖表上產生一或多個點；及(iv)定義出步驟(iii)所產生的點的周圍作為可接受范圍，此范圍即該植物物料的標準規格。
于一般多變數分析理論中，總數據為分數乘以負載(loading)所得積。此負載圖可用以定義出每一變數(光譜描述符)的貢獻。“分數圖”(score plot)為圖形代表，其中樣品作投于以二或多個主成分軸所跨越的空間。主成分分析(PCA)是用以分析多變數分析中數據的特別方法。于PCA中，樣品的位置可以二向量畫于分數圖上，其中類似的樣品會形成叢集，而不相似的樣品會以大距離擴散(Kowalski&Bender，1972，loc.cit.and Trevisan，1997，loc.cit.)。
在確立標準規格時，本發明方法中的分數圖上所產生的點的前后關系，必須與分析待用樣品是否符合標準時是相同的。在處理待用試驗樣品的NMR譜的數據時，對用來確定標準的已知試樣的分數圖上的一個或數個點，用來確定這些點的位置的方法的組成部分必須都存在。操作時，將用作標準的樣品的NMR譜所得數據以多變數統計法作適當操作，例如與標準一起作主成分分析或典型變化。以分數圖上的限制定義出可接受的范圍，此分數圖是以一或多個已知樣品的點的分數圖內的位置為基礎確立了的。于本發明較佳一方面，是使用未經監測的方法完成多變數分析的。
本發明所用NMR譜分析技術可包括結合多變數分析于高磁場進行氫-1NMR譜分析。在此特定方面，NMR一般是在400至700MHz測定。然后將所得數據以多變數分析軟件分析，例如用市場上可購得的“Pirouette”package。
高解析氫-1NMR譜分析及花樣認知分析的例子已由M.L.Anthony et al于Biomarkers 1996，1，35-43及MolecularPharmacology 46，199-211，1994及J.O.T.Gibb et al于Comp.Biochem.Physiol.vol.118B No.3，587-598頁，1997所討論。
除1-二維高磁場氫-1NMR譜分析外，本發明也可用其他NMR活性核如碳-13或氫-2作1-二維NMR譜分析。也可用氫-1或其他如上述NMR-活性核作2-二維脈沖順序譜分析研究。此同樣的原理可用于任何情況，結果都是以適宜的多變數分析法進行分析。
NMR譜在作以電腦為基礎的花樣認知前可進行正規化或非正規化。正規化有除去峰強度(peak intensity)的效果，此純為作為判別因子的譜的定量參數。所以正規化一般是當操作的主要目的是強調得自不同樣品的譜的定性區別時使用。然而有些情形下，在需絕對定量值，例如強度，時可用峰強度作為區別因子。在此情形下譜是非正規化的。
NMR譜/花樣認知的重要優點是不受選擇性投送或檢出系統(detection system)的限制。試驗溶液或試驗萃取物在純化前即可記錄譜，是以，允許所具有質子的樣品的成分都呈現在總NMR譜上。以上述多變數分析技術分析譜即可顯現譜的有潛在價值的判別因子，此譜可用于高度準確地說明植物物料內所含的各成分的復合混合物。
但有時在分數圖上不易區別植物物料樣品時，會發現來自相同給定植物物料樣品的點是散開的而非成叢集的。此一相似性損失在植物物料各成份的NMR譜移植有變化時即會發生。此種變化可能由于，例如，植物物料中某一特定化合物濃度太高所致，或是由于導致移動值改變的pH或金屬離子所致。如有此問題發生，作NMR譜分析的植物物料的試驗溶液或試驗萃取物可先行處理以除去錯誤源而在分數圖上產生較佳的叢集。所以本發明方法一方面包括在作NMR譜分析前先純化待用植物物料樣品的又一起始步驟。
此原理可用茶說明。咖啡因所產生的信號主導茶的氫-1NMR譜，是以在用多變數分析法分析由茶所得的NMR譜的結果時，相同茶樣品的分數圖的點不形成叢集。如果在作NMR譜分析前除去茶內的咖啡因，例如作反相色層分析，即可出現樣品適宜的叢集，相似樣品即于分數圖上產生清楚的相似性。此可由實例2及附圖4A及4B說明。圖4A為未處理的茶樣品的分數圖，其叢集不明顯。相反，圖4B為處理過的茶樣品的分數圖，其叢集明顯，可清楚判別。
此NMR譜/花樣認知分析是高度敏感的，足以區別以其他方法分析看起來相似的植物物料樣品。此也可能茶為例說明。比較實例1說明以高效液體色層分析(HPLC)分析的二種不同型的茶葉提取物。所得色層分析圖見附圖2及3。一實驗使用未處理過的樣品(圖2及3的色層分析圖A)，另一實驗用處理過的樣品(各圖的色層分析圖B)。
此等圖首先顯示HPLC并不能區別處理過的和未處理過的茶樣品，因為色層分析圖2A和2B事實上是相同的，正如色層分析圖3A和3B相同一樣。第二，此等圖顯示HPLC并沒有判別不同型茶的能力，因為圖2的色層分析圖與圖3的一樣。在這方面，HPLC與本發明所用NMR譜/花樣認知技術相反，此可由實例2及附圖4A及4B說明。
本發明方法的重要應用在于植物物料混合物的標準化中。此等混合物的例子包括上述傳統中藥所用的藥物。此等藥物為典型的數種不同的植物與真菌的混合物，是依據幾百年以前的處方所制備。到現在為止，尚無一種分析技術可供此類物料的生產者有效地及可靠地區別其自己的產品和競爭者以相同名字出售的表面上相同的產品。現已令人驚奇地發現，本發明所用NMR譜/花樣認知技術在假定是相同的，但是來自不同來源的給定的植物物料混合物的不同試樣之間提供了清晰的區分。此可由實例5及附圖7說明。所以本發明方法可區別并標準化植物物料混合物。
結合NMR譜/花樣認知技術及生物學定性是經常需要的，因為藥用植物物料內的化合物復合混合物可顯示出總體上的臨床效果，而此效果可能主要來自一特定成分，此效果又可因其他成分的存在而改變或增強。是以生物學定性能對植物及植物萃取物的生物學效果作可以定量測定，從而補足及/或確認由NMR譜分析及花樣認知所得的信息。
本發明方法所用生物學定性技術對植物物料樣品的生物活性所需的品質管制及標準化方法是一貢獻。現已知以植物為基礎的藥物的總體效果并非來自單一活性成分，而也由于植物內各種物質的復合混合物內有輔助化合物(auxiliary compounds)的關系。本發明方法所用生物學定性技術容許對此等輔助化合物的協同效果作研究，而無須證實此等化合物本身。可觀察到的協同效果包括，例如，主成分活性的增強，治療物質的選擇性或生物利用性的增強，以及副作用的抑制。這方面的生物學定性在用以說明使用全植物或植物萃取物優于使用由植物分離出的單一成分上是特別有用的。
較佳的生物學定性技術是蛋白質分析，特別是蛋白質組學(proteomics)。這是因為蛋白質表達的改變，不論特定作用的機制如酶抑制、受體結合抑制、或信號傳遞調節如何，都代表最終的生物學效果。蛋白質組(proteome)一詞描述了完全的蛋白質集合，它按照在細胞生命中整個基因組來表達和修改。蛋白質組學是使用大規模蛋白質分離及證實技術研究蛋白質組(Nature，vol 402，1999，715頁)。蛋白質組學分析于下實例6說明。
是以，本發明較佳方面的生物學定性技術包括(i)提供根據藥用植物物料有活性的臨床癥狀選擇的靶細胞，以該物料的待用樣品培養靶細胞；及(ii)將培養過的細胞于2-D凝膠上作凝膠電泳，觀察細胞曝露于試驗樣品后蛋白質表達的改變結果。
于本發明方法中，上述步驟(i)及(ii)是以植物物料樣品進行，此樣品具有所需標準的每一性質。于步驟(ii)中觀察到的蛋白質表達改變的大體形式定義為該植物物料的標準規格的一部分。然后根據其在上述步驟(i)及(ii)中所作的分析是否給出相同的形式，決定相同植物物料的樣品是否可以接受。
于第一步驟中，根據模型的臨床適應癥，或疾病所需，選適宜的靶細胞。以試驗樣品將細胞培養后，以二種二維電泳將靶細胞內的蛋白質分離成個別的蛋白質。所得蛋白質花樣以電腦化的型像分析技術取得，使用微排序及質譜證實各蛋白質。如有必要，所得結果可作以電腦為基礎的花樣認知，如主成分分析等，此已于上述。然后，在用試驗樣品進行靶細胞培養后所檢測出的蛋白質表達的變化與用已經對有關臨床癥狀顯示出活性的已知樣品進行靶細胞培養后檢測出的相應變化進行比較。
試驗樣品的潛在效果可能與醫藥級的標準相關，此相關關系是以對標準反應反響所必需的試驗樣品的濃度進行比較而得到的。
另一生物學定性技術是受體結合或酶抑制鑒定。此鑒定可求出植物物料的生物活性定量測量。此種鑒定可根據習用的鑒定方案進行。適宜的鑒定的例子是篩選作為治療或預防癌或發炎待用植物物料的方法，此法包括測定此物質是否是抑制基因啟動區(gene promoter)的刺激，而此基因啟動區是與癌或發炎有關的。
在本發明方法中，植物物料一般是源于全植物、植物的一部分、植物萃取物或植物組分(plant fraction)或由其所構成。較佳是此物料是由植物的一或多種根、葉、芽、花、果、汁及種子構成，或來自此等物料。
植物物料天生的多樣性給藥物管理局帶來特殊的問題，醫藥管理當局須要確知申請醫藥證書的待用產物是均一性的，其品質是可證明的。其理由是其劑量及治療方案都須是能確保的。然而現在尚無一種可靠的系統能測定一種以植物為基礎的產物是否符合作為可接受的普遍使用的標準的需求。所以，一方面如上所述的本發明提出了對該問題的解決方案，并提供一種確定治療物質的醫藥級標準的方法，此等治療物質是衍生物自或包括了植物物料的。這方面，此方法包括(i)制備一種已知是醫藥級治療物質樣品的溶液或萃取；(ii)將此試驗溶液或萃取物作二種或多種分析，包括(a)NMR譜分析與以電腦為基礎的花樣認知技術，及(b)一或多種生物定性技術；(iii)取得步驟(ii)所得的分析結果；及(iv)以步驟(iii)所得結果為基礎確定出醫藥級標準規格。
本發明還提供一種制造衍生自或包括植物物料的醫藥級治療物質的方法，此法包括(i′)制備治療物質待用樣品的試驗溶液或萃取物；(ii′)將該溶液或萃取物作NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術的分析；(iii′)取得步驟(ii′)的分析結果；及(iv′)如果步驟(iii′)所得結果與步驟(iv)所確立的醫藥級標準相符，選擇此治療物質為藥物。
在所選待用樣品除了作NMR譜分析及花樣認知分析外還作生物定性時，上述步驟(iv′)以下述步驟代替(iv′a)將步驟(i′)所制備的溶液或萃取物作一個或多個生物定性技術分析；(iv′b)從步驟(iv′a)中每一技術得到結果；及(iv′c)如果步驟(iii′)及(iv′b)所得結果與上一方法步驟(iv)所建立的醫藥級標準規格相符，選此治療物質為醫藥級。
在這些具體實施例中，NMR譜，花樣認知及生物學定性也都可作，如上所述。
下述實例及附圖進一步說明本發明，其中
圖1為由實例l所述得自不同供應者的六種人參樣品，以因子3(y軸)與因子2(x軸)對比所制成的主成分分析(PCA)分數圖。圖中所用記號如下*＝供應者1；●＝供應者2；+＝供應者3；＝供應者4；□＝供應者5；及＝供應者6。
圖2顯示給克門茶(Kemmun tea)所作的二種HPLC色層分析，使用如比較實例1所述的適于分離兒荼素的系統，其中A代表未處理的茶樣品，B代表先用固相萃取柱處理過的茶樣品。
圖3顯示給拉嗓搔重茶(Lapsang Souchong tea)所作的二種HPLC色層分析，使用如比較實例1所述的適于分離兒茶素的系統，其中A代表未處理的茶樣品，B代表先用固相萃取柱處理過的茶樣品。
圖4A及4B為六種不同型的茶所作的以因子2(y軸)與因子1(x軸)相比制成的PCA分圖，此六種不同的茶是來自下述實例2。每一型茶的圖所用符號如下□＝烏龍(Oolong)；+＝克門(Kemmun)；＝拉嗓搔重茶(LapsangSouchong)；●＝大吉嶺(Darjeeling)；*＝關普(Gunpowder)；◆＝阿三(Assam)。
圖5為實例3所制的五種不同短舌匹菊(Tanacetum parthenium)(退燒草)的以因子3(y軸)與因子1(x軸)相比制成的PCA分數圖。每一樣品所用符號如下=實例1，*=實例2，□=實例3，●=實例4，=實例5。
圖6為在種植后不同時間收獲的七種短舌匹菊(Tanacetumparthenium)樣品的以因子2(y軸)與因子1(x軸)相比制成的PCA分數圖，此七種樣品是如實例4所述。所用符號如下●=樣品T0；V=樣品T1；=樣品T2；*=樣品T3；+=樣品T4；□=樣品T5； =樣品T6。
圖7為實例5所分析的傳統中藥的以因子2(y軸)與因子1(x軸)相比制成的PCA分數圖。每一樣品所用符號如下●=供應者1；*=供應者2；+=供應者3。
圖8為下述實例6所制IBR 3人皮成纖維細胞的2+D凝膠蛋白質特性圖(銀染色)，其中A是未處理的對照樣品，B是球花醉魚草(Buddleja globosa)萃取物10微克/毫升處理72小時后的樣品。
圖9為下述實例6所制IBR 3人皮成纖維細胞的2-D凝膠蛋白質特性圖(銀染色)，其中A是未處理的對照樣品，B是球花醉魚草(BuddIeja g1obosa)萃取物10微克/毫升處理72小時后的樣品。
實例1使用NMR譜及多變數分析區別人參的來源萃取物的制備由六個不同的商業供應者購得白人參樣品。白人參是來自人參C.A.Meyer的根。將此根短皙泡于沸水內，然后腌于蔗糖汁中。再作曝露于太陽下曬干。白人參也稱作糖人參。
此干過的植物根物料用。Illico。攪拌器研磨五分鐘成細粉。將一克此細粉于20毫升冷水混合，在室溫(22℃)下在150轉/分鐘的振動器上繼續攪拌2小時。用Whatman 1號過濾紙過濾萃取物，收集過濾物并凍干過夜。將10毫克樣品溶于1毫升氘化的水內供NMR譜分析。以800微升用于NMR譜分析，以樣品與TSP以0.00 ppm作為內部參考。NMR譜分析方案將Bruker DRX 600光譜僅上以600.13 MHz質子頻率，裝有BEST流探針，記錄氫-1NMR譜。以64個20ppm掃描寬度掃描所得結果制成譜，并收集于49152數據點內。每次掃描所用時間為2.0秒。在轉換前，用寬度為0.3Hz的線，再將譜作傅里葉(Fourier)轉換。以0.00ppm作TSP參考。使用AMIX軟件分析NMR將譜線還原為“直方圖”，內含0.4ppm寬的地址散列表元(buckets)。主成分分析將所得文件在Excel中打開，在此處用整譜的和完成正規化。然后將所得數據用Pirouette軟件套件作多變數分析。用平均中心(meancentring)(及自動掃描)作未監視PCA。結果將此數據轉化成PCA分散圖上的點。此即為附圖1。此圖清楚顯示每種人參樣品有6個不同的叢集點，從而可說明此技術提供區別相同給定植物物料樣品的方法。比較實例1茶萃取物的HPLC分析所用的茶為克門(Kemmun)及拉嗓搔重(Lapsang Souchong)茶。每一萃取物的HPLC分析是如下制備。未處理的樣品用Moulinex“Illico”混合器將商業茶樣品(50克)磨成細粉約1分鐘制成均質樣品。取出5克粉在室溫(22℃)放在100毫升的玻璃錐形燒瓶內。將50毫升沸蒸餾水倒在茶樣品上，用塑料棒攪拌，在室溫放置30分鐘。用Whatman濾紙過濾出萃取物，收集過濾物并凍干過夜。將10毫克樣品溶于1毫升蒸餾水內。HPLC裝置Hewlett Packard系列II1090液相色譜儀HPLC柱C18RP Hypersil 5μ，150×4.6毫米HPLC移動相甲醇∶水∶正磷酸20∶79.9∶0.1容積/容積，流速0.9毫升/分鐘，吸收波長210毫米。
所得的色層分析圖列于表2A中(Kemmun)及表3A中(LapsangSouchong)。處理的樣品用Moulinex“Illico”混合器將商業茶樣品(50克)磨成細粉約1分鐘制成均質樣品，將50毫升沸蒸餾水倒在茶樣品上，用塑料棒攪拌，在室溫放置30分鐘。用Whatman濾紙過濾出萃取物，收集過濾物并凍干過夜。將10毫克樣品溶于1毫升蒸餾水內，使在真空下流經反相(RP)C18 Isolute柱。用20毫升作HPLC分析，其法如上述未處理樣品HPLC分析的作法。
所得色層分析圖為附圖2B(克門)及3B(拉嗓搔重)。此等圖顯示HPLC并不能清楚區別處理的和未處理的茶樣品，因為色層分析圖2A和2B實際上是相同的，3A和3B也相同。此等圖也顯示，HPLC沒有區別不同型的茶，因為圖2和圖3的色層分析圖相同。實例2利用NMR譜與多變數分析區別茶型所用茶為關普(Gunpowder)，大吉嶺(Darjeeling)，克門(Kemmun)，阿三(Assam)，拉嗓搔重茶(Lapsang Souchong)及烏龍(Oolong)。。此等茶的未處理的及處理的樣品如前述比較實例1制備。NMR譜分析及主成分分析方案將10毫克茶樣品溶于1毫升氘化的水(D2O)內。用800微升作NMR譜分析，各樣品于0.00ppm作內部參考至TSP。每一茶萃取物作實例1所述方法試驗。結果將數據轉化成兩個分數圖上的點。此即為附圖4A及4B。圖4B顯示處理過的茶萃取物的六種不同的點叢集，而圖4A顯示處理前的茶的不良叢集。
此NMR譜/PCA技術的區別能力遠強于比較實例1所用的HPLC的區別能力。實例3利用NMR譜與多變數分析區別商業草藥樣品萃取物的制備由三個不同的制造廠購得市場上可購得的退燒草膠囊[短舌匹菊(Tanacetum parthenium)]。此等制品表面上相同，為硬明膠膠囊，含“標準化的”退燒粉。
取五個樣品，每個樣品含10粒膠囊。一個樣品取自制造者A。二個樣品，各批號相同，取自制造者B。二個樣品，各批號不同，取自制造者C。
將每一樣品的膠囊內容物置于Moulinex“Illico”混合器內，將物料磨成細粉二分鐘，成為均質樣品。將500毫克粉溶于50毫升冷水內制成作NMR譜分析用的萃取物，將此萃取物在室溫(22℃)在搖動器內以150轉/分鐘攪拌四小時。此混合物用Whatman一號濾紙過濾，收集過濾物，凍干過夜。NMR譜分析及主成分分析方案每一萃取物用實例1所述方法分析。結果將各數據轉變成分數圖上的點(平均值)。此即為圖5，其中每一點對應于一粒膠囊。此圖顯示樣品1，4及5具有良好叢集，反映此等批量的產品的個別膠囊有一致性。樣品2及3的叢集不佳，反映此產品各膠囊間有較大差異。此圖也清楚顯示同一制造廠的不同批號的同一產品有明顯不同(樣品4及5)，雖則聲稱此等產品是相同的。實例4NMR譜分析及主成分分析在區別不同成熟度的短舌匹菊(Tanacetum parthenium)樣品上的用途植物樣品的培養及收獲此藥用植物短舌匹藺(Tanacetum parthenium)是用購自C.N.Seeds，Ely，UK有保證的種子在英國種植。于4月18日種上，并在玻璃下培養。4月25日發芽，在5月24日插于劃成方格的地上以便隨機取樣。
由地里采取五分樣品，每份包括4株植物，采取時間各不相同，以供分析。最后收獲時多采取二份樣品，冰凍儲存，于收獲后一及二個月分析。收獲樣品的日期如下
萃取物的制備收集干燥植物物料，立即置于-20℃的冰凍器內。冰凍后，將物料置于冷凍干燥器內12小時，然后檢查樣品確保是干燥的。將物料置于Moulinex“Illico”混合器內，磨成細粉二分鐘，成為均質樣品。將500毫克植物物料溶于50毫升冷水內制成作NMR譜分析用的萃取物，將此萃取物于室溫(22℃)于搖動器內以150轉/分鐘攪拌四小時。此混合物用Whatman一號濾紙過濾，收集過濾物，凍干過夜。NMR譜分析及主成分分析方案將10毫克上述樣品溶于1毫升氘化的水內供NMR譜分析。用800微升作NMR譜分析，以0.00ppm以樣品作內部參考。此法如實例1所述。結果將此數據轉化成PCA分數圖上的點(平均值)。此即為附圖6。此清楚顯示不同樣品有清楚的叢集點。此結果顯示，植物內的代謝變化，例如隨成熟度而起的變化，可用PCA圖代表。是以本發明方法提供區別不同生理狀態的植物物料樣品的方法，以此例言即區別其不同的成熟度。實例5NMR譜分析及多變數分析在區別植物物料混合物上的用途由三個不同的供應商取得稱作六味黃丸(Liu Wei Huang Wan)的傳統中藥(注明為1，2及3)。萃取物的制備將每一供應商的錠各100粒分成10組，稱其重量。將各組以杵及臼搗碎，再將1克形成的粉移入玻璃燒瓶內。然后加水(100毫升)于粉上，將此混合物回流30分鐘。將此溶液冷卻，過濾，凍干。NMR譜分析及主成分分析取10毫克上述制備的樣品溶于1毫升氘化的水內。以實例1所述方法進行。結果將此數據轉化成PCA分數圖上的點(平均值)。此即為附圖7。有清楚的點叢集對應于三供應商的樣品。此結果顯示，本發明方法能成功地區別看起來相同的多成分植物物料樣品。參考實例1醉魚草(Buddleja spp)試驗萃取物的制備及球花醉魚草(Buddleja globosa)對人皮成纖維細胞影響的測定據報告，球花醉魚草(Buddleja globosa)是具有傷口愈合性質的植物，因此是臨床上常用的草藥。為要確證此植物具有與此有關的生物學活性，決定選此植物作為實例6所用蛋白質組學分析的待用者，此分析可測定其是否于活體外刺激細胞生長，此法如Hughes andCherry(1997)于Wound Repair and Regeneration 5159-167所述。為比較起見，也使用了同屬的其他不同種的植物(大葉醉魚草[Buddlejadavidii])，此等植物對傷口愈合有較少影響。使用草作為對照。萃取物的制備將球花醉魚草(Buddleja globosa)，大葉醉魚草(Buddleja davidii)及草的新鮮葉(50克)分別于一公升蒸餾水內在回流下加熱一小時。將萃取物冷卻，用Whatman一號濾紙過濾，收集過濾物，凍干12小時。將干萃取物(10毫克)溶于水(1毫升)內，用0.2微米過濾器過濾。此萃取物以1∶1000稀釋入Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)內使成為終濃度為10微克/毫升的溶液。此溶液以DMEM稀釋至1∶1，制成5毫克/毫升的溶液。人皮成纖維細胞鑒定將得自后耳手術的人皮成纖維細胞(HDfs)于37℃于5％CO2下在加有10％胎牛血清(FCS)，0.02％兩性霉素B及1％青霉素及2％鏈霉素的Dulbeccos Modified Eagle Medium(DMEM)內培養。任HDfs生長至會合1-5天，以磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)洗后，用0.025％胰蛋白/EDTA由培養瓶取出。將HDfs傾入50毫升滅菌普通液內，再懸浮于50毫升DMEM內，然后以2700轉/分鐘離心5分鐘。再將HDfs懸浮于10毫升DMEM內，用血球計數器計數。作鑒定前24小時將HDfs種于含10％FBS的DMEM的碟內。鑒定使用4×103細胞/微滴定穴的接種密度。
24小時后吸出介質。先將球花醉魚草(Buddleja globosa)萃取物以10毫克/毫升的濃度溶于水內，再稀釋入含0.5％FCS(0.5％FCS為HF生長的維持量，10％為刺激量)的DMEM內，使其終濃度為5，10及100微克/毫升(n＝8作為對照及處理)。
以0.2微米的滅菌過濾器過濾后，將萃取物加在含200微升介質的碟內。加醉魚草(Buddleja)萃取物后使細胞與萃取物保持接觸24及72小時。在此二時間點收集上述三種不同濃度的細胞。用下述方法以中性紅鑒定細胞。中性紅鑒定將1.2毫升中性紅染料加在78.8毫升Hanks′平衡鹽溶液(HBSS)內。在37℃培養10分鐘，然后以2600轉/分鐘離心5分鐘，將100微升加在每一穴內，將此碟培養2.5小時，然后傾出介質，先用100微升1％的甲酸洗此細胞，再用100微升1％的醋酸洗。將微滴定碟置于AnthosHill讀碟機上，搖動15秒，于550毫微米讀剩余細胞的吸光度。通過比較細胞加萃取物的吸光值(吸光值可轉換成生長百分比)及對照(0.5％)的吸光值測定出生長百分比。結果表植物萃取物對IBR 3人皮成纖維細胞(HDf)生長的影響
此等結果顯示，球花醉魚草(Buddleja globosa)于5微克/毫升及10微克/毫升的中等濃度時，對人皮成纖維細胞的生長有刺激效果，而于100微克/毫升時其效果較小。并可看出此效果維持超過72小時。在較低濃度時的效果是可以再現的，因為同一植物物種的二種不同的萃取物產生類似的結果。反之，大葉醉魚草(Buddleja davidii)的效果則較低。是以，其活性是因物種而異的，此證實在開發植物萃取物上選擇類似待用物時人與植物的關系信息的價值。對照物草的效果則很低。
由于球花醉魚草(Buddleja globosa)在促進人成纖維細胞的生長上可用作下實例6所述的蛋白質分析技術的適宜的待用植物萃取物。此一活體外鑒定的結果也有助于于蛋白質分析所用的IBR 3 HDf作為靶細胞系的選用。實例6球花醉魚草(Buddleia globosa)于人皮成纖維細胞蛋白質表達效果的蛋白質組分析材料及方法細胞培養物用T&5燒瓶(TPP塑料)于DMEM+10％FCS(Sigma)內培養IBR3人皮成纖維細胞。將約50毫克干球花醉魚草(Buddlejaglobosa)萃取物溶在5毫升二次蒸餾水內，制成10毫克/毫升的基礎液。此基礎液用0.2微米的過濾器過濾，將5毫升在5毫升DMEM+10％FCS(即1∶1000稀釋液)稀釋成10微克/毫升的溶液。此再在DMEM+10％FCS內作1∶1稀釋，成為5微克/毫升的溶液。
用下列各萃取物試驗濃度0微克/毫升，5微克/毫升，10微克/毫升各以一個T75燒瓶培養細胞24小時或3天(總燒瓶數＝6)。
用六穴的碟(Costar)給放射標記的培養物，每一萃取物濃度(0微克/毫升，5微克/毫升，10微克/毫升)用2個穴。將[35S]-標記的甲硫胺酸每穴250微居里于無甲硫胺酸的介質內，培養細胞24小時。所有的培養都于37℃在CO2培養器內進行。2-D電泳培養完后，T75燒瓶內的細胞用2×5毫升PBS及1×5毫升0.35的蔗糖洗滌，收信200微升細胞溶解緩沖液(9.5M尿素，1％DTT，2％CHAPS，0.8％Pharmalyte pH3-10[Pharmacial])內。6-穴碟內每一穴內的細胞用2×2毫升PBS，1×2毫升0.35M的蔗糖洗滌，收入35微升細胞溶解緩沖液內。所有樣品都儲在-20℃待用。
使用修正的Bradford鑒定測定蛋白質濃度，以螢光計數測定放射活性。由于蛋白質量太少，須以未標記的細胞作丙酮沉淀。完成此步驟后，蛋白質濃度即在鑒定參數范圍內，可獲準確樣品負載。等電點聚焦將50微克未標記的蛋白質及1×106CPM標記的蛋白質加在再賣溶液(8M脲，0.5％CHAPS，0.2％pharmalyte pH 3-10[Pharmacia])內，使其最終容積為450微升，用以再膨脹固定pH梯度(IPG)條(即凝膠內脫水)。對于每一萃取條件都用覆蓋pH3-10NL(非線性)及pH4-7L(線性)范圍的IPG條。再膨脹過夜后，將IPGs以0.05mA/條20℃下作60千伏小時聚焦。2-D電泳在已聚焦的IPGs作第二維電泳前，先于含1％二硫蘇糖醇(DTT)的緩沖液(1.5m Ttis[pH8.8]，6M脲，30％甘油，2％SDS，0.01％溴酚藍)平衡15分鐘制成條，再以含4.8％碘乙酰胺(IAA)的緩沖液平衡15分鐘。
用12％T/2.6％C分離凝膠于Hoefer DALT系統內過夜完成SDS-PAGE(20毫安培/凝膠，10℃)。觀察第二維完成后，將各凝膠置于蛋白質固定液(50％，甲醇，10％醋酸)內過夜，第二天用銀染色套件(Daiichi)染色。放射性的凝膠也作類似的固定，但不作銀染色且是置于“凝膠干燥”液(3％甘油，30％甲醇)內過夜。然后用Savant凝膠干燥器將凝膠于3MM紙(Whatman)上干燥，并曝露于BioMax底片(Kodak)總共10天。將底片于AGFA加工機內顯影。
作銀染色或底片顯影后，將凝膠或底片用Molecular DynamicsPersonal Densitometer SI于100微米掃描解析，使用ImageQuant(Molecular Dynamics)觀察影相。用PDQuest(Bio-Rad)作電腦分析，此種電腦宜于使影相作排列，標記，配合及定量分析。24小時時間點(1)以250微居里[35S]-甲硫胺酸給細胞作放射標記(2)未標記的細胞作銀染色(每一樣品用2×75公分2燒瓶)72小時時間點(1)未標記的細胞作銀染色(每一樣品用2×75公分2燒瓶)2-DE第一維使用含蓋二種不同pH的IPG條(1)pH3-10NL條(2)pH4-7條第二維12％SDS-PAGE樣品負載50微克蛋白質作銀染色106每分鐘周數作自動放射線照相結果球花醉魚草(Buddleja globosa)萃取物對人皮成纖維細胞的蛋白質表達的影響見下表
配合的總蛋白質點數850附圖8及9顯示蛋白質點的例子，此等點表示對球花醉魚草(Buddleja globosa)萃取物的反應所致的表達型的改變。圖8說明以10微克/毫升萃取物處理72小時后蛋白質減少的區，而圖9說明以10微克/毫升萃取物處理72小時后蛋白質減少的區。在此二圖中A都代表未處理器的對照組，而B代表處理的樣品。
此等結果顯示蛋白質分析技術可用于證實相關的生物活性是以依濃度而定的方式存在。本文說明球花醉魚草(Buddleja globosa)在改變人皮成纖維細胞內蛋白質表達上是有效的。
權利要求
1.一種確立藥用植物物料標準規格的方法，此方法包括(i)制備藥用植物物料樣品的試驗溶液或試驗萃取物，此物料所具有的每一性質都需標準化；(ii)將該溶液或萃取物送至二個或更多的分析方法，此等方法包括(a)結合NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術的方法，及(b)一或多種生物學定性技術；(iii)由步驟(ii)所用的分析方法取得結果；及(iv)以步驟(iii)所取得結果為基礎建立該植物物料的標準規格。
2.一種提供藥用植物物料樣品的方法，此樣品是與前面所定義的該植物物料標準規格相符的，此法包括(i′)制備藥用植物物料樣品的試驗溶液或試驗萃取物，此物料所具有的每一性質都需標準化；(ii′)將該溶液或萃取物作NMR譜及以電腦為基礎的認知技術的分析；(iii′)取得步驟(ii′)的分析結果；及(iv′)如果步驟(iii′)所取得結果符合該植物物料與權利要求1步驟(iv)所作的標準規格，則選擇此待用樣品。
3.根據權利要求2的方法，其中步驟(iv′)是以(iv′a)將步驟(i′)所制備的溶液或萃取物作一或多個生物定性技術分析；(iv′b)取得步驟(iv′a)中每一技術所作的結果；及(iv′c)如權利要求2的方法中步驟(iii′)及上一步驟(iv′b)所得結果與權利要求1的方法中步驟(iv)所建立的該物料的標準規格相符，選此待用樣品。
4.根據上述權利要求任一項的方法，其中NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術接合包括(a)將試驗溶液或試驗萃取物作NMR譜分析并記錄一或多個NMR譜；及(b)將每一NMR譜所得數據作多變數分析，在分數圖上形成一或多個點。
5.根據上述權利要求任一項的方法，其中多變數分析是主成分分析(PCA)。
6.根據上述權利要求任一項的方法，其中生物定性技術是選自受體結合或酶抑制鑒定及蛋白質組分析。
7.根據權利要求6的方法，其中蛋白質組分析包括(i)由藥用植物對其具活性的臨床適應癥選取靶細胞，并以試驗溶液或試驗萃取物培養此靶細胞；及(ii)將培養過的細胞于2-D凝膠上作凝膠電泳，觀察細胞內蛋白質表達的改變作為曝露于該溶液或萃取物的結果。
8.根據上述權利要求任一項的方法，其尚包括在進行NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術結合前進行待用樣品試驗溶液或試驗萃取物的純化。
9.根據上述權利要求任一項的方法，其中藥用植物物料包括，或衍生自全植物，植物的一部分，植物萃取物或植物段。
10.一種提供藥用植物物料標準規格化的方法，此法包括(i)制備該植物物料的試驗溶液或試驗萃取物，該植物已知是具有標準所需的每一性質的；(ii)將試驗溶液或試驗萃取物作NMR譜分析并記錄一或多個NMR譜；(iii)將每一NMR譜所得數據作多變數分析，在分數圖上產生一或多個點；及(iv)定義出步驟(iii)所產生的點的周圍作為可接受范圍，此范圍即該植物物料的標準規格或標準規格的一部分。
11.根據權利要求10的方法，其中步驟(iii)中的多變數分析是用非監督方法進行。
12.一種提供藥用植物物料樣品的方法，此樣品與前述已確立的該物料的標準規格相符，此法包括(i″)制備該植物物料待用樣品的試驗溶液或試驗萃取物；(ii″)將試驗溶液或試驗萃取物作NMR譜分析并記錄一或多個NMR譜；(iii″)將每一NMR譜所得數據作多變數分析，在分數圖上產生一或多個點；及(iv″)只在于步驟(iii)圖表上所產生的點落于權利要求10的方法中的步驟(iv)中所定義的標準規格所定義的可接受范圍時才選出待用樣品作為符合該標準規格的樣品。
13.根據上述權利要求任一項的方法，其中植物物料是衍生自，或包括，二或多種不同植物的混合物。
14.根據權利要求13的方法，其中該混合物是傳統醫藥系統的處方，此處方使用植物或植物萃取物的混合物。
15.根據權利要求14的方法，其中該傳統醫藥系統是傳統中藥或印度藥。
16.根據上述權利要求任一項的方法，其中具有該所需標準性質或每一性質的藥用植物物料樣品是已公認的樣品或已檢查過的產地已知的植物物料的樣品。
全文摘要
一種建立藥用植物物料標準規格的方法包括:(i)制備藥用植物物料樣品的試驗溶液或試驗萃取物,此物料所具有的每一性質都需標準化;(ii)將該溶液或萃取物送至二個或更多的分析方法,此等方法包括(a)結合NMR譜及以電腦為基礎的花樣認知技術的方法,及(b)一或多種生物學定性技術;(iii)由步驟(ii)所用的方法取得結果;及(iv)以步驟(iii)所取得結果為基礎建立該植物物料的標準規格。藥用植物物料的待用藥品可再試驗其是否符合標準。此等物料視其分析結果是否符合步驟(iv)所建立的任一規格而接受或拒絕。此一標準化及品質管制的進行特別適用于藥用植物物料混合物。
文檔編號G01R33/46GK1357106SQ0080363
公開日2002年7月3日 申請日期2000年2月10日 優先權日1999年2月10日
發明者P·J·海蘭茲, J·K·尼科爾森, E·C·霍爾梅斯, M·J·敦 申請人:牛津天然產品有限公司