專利名稱：一種質粒及其構建方法和在艾滋病毒載量測定上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種質粒及其構建方法和在艾滋病毒載量測定上的應用，屬艾滋病防治領域。
艾滋病(AIDS)是由I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的破壞機體免疫系統的致死疾病。自1985年我國發現首例艾滋病人以來，該病在全國迅速蔓延，現已進入高速增長期，艾滋病的防治已成為關系到國計民生的大事。艾滋病的臨床治療，及抗艾滋病新藥和疫苗的發現與研究，需要一客觀、可靠的指標來評判HIV感染者的病程和預后。已有的血清p24抗原水平檢測、逆轉錄酶活性測定、病毒分離培養等方法也能在一定程度上反映患者體內病毒數量的變化，但以上方法干擾因素多，費時費力且靈敏度較低。大量研究表明，HIV-1病毒載量的變化是HIV-1感染者病程和預后判斷的最客觀依據，已商品化的定量檢測HIV-1的技術有聚合酶鏈反應(PCR)(Amplicor HIV-1Monitor test；Roche)、NASBA和b-DNA。Roche公司的Amplicor Monitor test(PCR)是FDA批準的唯一用于臨床檢測HIV-1的試劑盒。該檢測試劑盒價格十分昂貴(每個樣品的檢測費用在200至500美元之間)，技術要求高。現有的方法有的只能在極少數實驗室開展，因此難以廣泛應用于臨床和科學研究。
本發明的目的在于克服現有技術之不足，提供一種操作簡單，價格便宜，特異性好，靈敏度高，同時有較好的可重復性的質粒及其構建方法和在艾滋病毒載量測定上的應用。
本發明是這樣實現的質粒為pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486。
pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486的構建方法，是將8E5細胞含有的單拷貝HIV-1前病毒DNA進行Sal I/Sac I雙酶切，與被同樣雙酶切的購自Promega公司的pSP64Poly(A)質粒發生粘性末端連接，得到含有HIV-1gag基因片斷的pSPgag737重組質粒，轉化至JM109感受態細胞，經酶切/PCR鑒定，得到陽性克隆子。體外轉錄陽性克隆子，獲得病毒載量定量測定的RNA外參照。
pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486在艾滋病毒載量測定上的應用應用 1、2的外參照，將聚合酶鏈反應技術與柯達電泳圖譜分析系統相結合，建立測定HIV-1感染者和艾滋病人血漿的病毒載量定量測定的方法。
附
圖1為pSPgag737質粒的構建。
附圖2為帶酶切位點的GAG1/GAG2為引物的聚合酶鏈反應(PCR)擴增結果附圖2中1擴增產物(8E5細胞DNA為模板)；2DL2000分子量標準。
附圖3為重組質粒的酶切電泳分析圖譜。
附圖3中1λDNA/EcoRI+Hind III分子質量標準；2重組質粒；3重組質粒經EcoRI酶切；4重組質粒經BamHI酶切。
附圖4是重組質粒為模板的PCR擴增結果。
附圖4中1DL2000分子質量標準；2引物sk38/sk39的PCR擴增產物(115bp)；3引物sk145/sk431的PCR擴增產物(142bp)；4引物GAG1/GAG2的PCR擴增產物(721bp)。
附圖5為病毒載量測定PCR擴增結果。
附圖5中1pGEM-7zf/HeaIII分子質量標準；2陽性對照；3陰性對照；4～9十倍稀釋的外參照6個梯度(1-105)；10病人A的含HIV-1樣品；11病人B的含HIV-1 RNA樣品；12健康人血漿樣品。
附圖6為外參照工作曲線。
附圖6中其線性系數為0.96，其回歸方程為Y(Mass)＝25.46X(Log Inputcopies)+18.13以下結合附圖對本發明的技術方案作進一步詳述該質粒為pSPgag737 CGMCC NO.0486。該質粒鑒定為pSPgag737的理由是它的基因組內插入了HIV-1gag基因片斷。其分類性質為含有SP6 RNA聚合酶啟動子和(dAdT)30的質粒。作為判斷基準的有關文獻是GenBank/EMBL Accession NumberX65328。
1. pSPgag737質粒的構建用分別引入Sal I和Sac I酶切位點的引物GAG1(上游，5′GCAACCCTCTTATTGTGTG3′，1043-1060)/GAG2(下游，5′CCAACAAGGTTTCTGTCATC3′，1763-1744)擴增8E5細胞前病毒DNA，經Sal I和Sac I雙酶切后，酶切片段通過低熔點瓊脂糖回收純化，與經過同樣雙酶切的購自Promega公司的質粒pSP64Poly(A)發生粘端連接，從而構建成重組的新質粒pSMgag737(如圖1)。
2.制備宿主大腸桿菌JM109的感受態細胞，完成pSPgag737質粒對感受態細胞的轉化反應，利用氨卞抗性和藍白斑雙篩選獲得陽性重組子。提取質粒，因重組質粒保留了原EcoR I酶切位點，而消除了BamHI酶切位點，可酶切鑒定。GAG1/GAG2引物的擴增產物包含SK38(上游，5′ATTAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT3′，1551-1578)/SK39(下游，5′TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC3′，1665-1638)，SK145(上游，5′AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT3′，1366-1395)/SK431(上游，5′GCTATGTCAGTTCCCCTGGTTCTC3′，1507-1481)兩對通用引物的擴增靶序列，將酶切鑒定后的質粒DNA作為模板，分別用sk145/sk431和sk38/sk39進一步作PCR擴增鑒定。
(1)GAG1/GAG2擴增獲得的克隆片斷的PCR電泳結果表明用GAG1/GAG2擴增HIV-1 gag保守序列產生特異條帶(圖2)，條帶大小與預期結果一致(2)pSPgag737質粒酶切鑒定及PCR擴增鑒定分別用EcoRI和BamHI酶切質粒DNA后，EcoRI能將質粒酶切成線狀，而BamHI因重組后酶切位點消失而無法切割，線性質粒大小也在4268bp和3530bp條帶之間，與預期的設計完全一致(圖3)。以克隆質粒為模板，分別以sk38/sk39、sk145/sk431及GAG1/GAG2為引物進行PCR擴增，均產生特異擴增產物(圖4)。進一步說明質粒克隆成功，并含特異克隆片斷。
3.制備HIV-1病毒載量定量測定的外參照pSPgag737質粒用EcoRI在克隆片斷的下游將質粒酶切成線性，用線性質粒作為模板進行體外轉錄，具體方法參照寶生物公司SP6 RNA聚合酶轉錄試劑盒說明書進行，RNA轉錄產物用紫外分光光度計定量，十倍系列稀釋至1拷貝/ml，獲得HIV-1病毒載量定量測定的外參照。
4. HIV-1病毒RNA的提取血清學檢測為陽性的艾滋病人靜脈采血，EDTA抗凝，離心后獲血漿。取血漿200μl，以異硫氰酸胍一部法提取HIV-1RNA，異丁醇/醋酸鈉沉淀后，以50μl RNase free水溶解。
5. HIV-1病毒載量(Viral load)的測定分別取十倍系列稀釋的外參照RNA(1～105拷貝/μl)和樣品RNA作為模板，用sk145/sk431為引物，依購自寶生物公司的BcaBESTTMRNA PCR Kit說明書進行擴增，擴增產物在12％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，以pGEM-7zf/HaeIII為Marker，EB染色后用Kodak凝膠圖譜分析系統進行定量測定。根據不同拷貝數的外參照，其擴增產物電泳條帶的光強度(Intensity)或含量(Mass)不同，在Excell中作出Mass-Input copies工作曲線。據樣品擴增產物電泳條帶含量(Mass)，在工作曲線中查出被測樣品核酸的初始拷貝數，進而計算出單位體積血漿中的病毒載量。
如上述PCR擴增結果(圖5)所顯示外參照Mass隨Log(Input copies)的增大而遞增。利用Excel作出的的工作曲線有好的線性關系(r＝0.96)，其回歸方程為Y(Mass)＝25.46X(Log(Input copies))+18.13，據此回歸方程計算出病人的病毒載量分別為4.55×105Copies/ml血漿和7.55×104Copies/ml血漿，健康人未測出HIV-1病毒。
本發明的結果表明，當以重組pSPgag737轉錄的RNA作為測定病毒載量的外參照時，RNA參照包含有sk38/sk39和sk145/sk431引物擴增的靶序列。它的檢測靈敏度高，一個反應管內初始拷貝數低至10拷貝/μl甚至1拷貝/μl的RNA時都能很好地擴增，擴增效果和特異性都好。
在建立定量PCR方法的過程中，比較了兩對引物的擴增結果，證明用sk145/sk431引物擴增效果比sk38/sk39好，工作范圍更大，擴增特異性更好(數據為列出)。目前商品化的試劑Amplicor Monitor test和Nucisens的檢測范圍分別是50-50,000拷貝/ml、40-105拷貝/ml，QUANTIPLEX的檢測下限為500拷貝/ml。本研究建立的定量PCR方法檢測范圍是10-109拷貝/ml(DNA樣品)；5-106拷貝/ml(RNA樣品)。如果采用高速離心濃縮樣品內的病毒核酸，檢測下限將能進一步提高。經對10個未知樣品的三次重復測定，方法本身造成的變異系數低于35％。
采用本發明的技術方案，檢測一個樣品的試劑成本約50元人民幣，除PCR儀之外，一套Kodak電泳圖譜分析系統和電腦約需3～4萬元左右，一般臨床和研究機構都可以購買得起，操作比較簡易。
本發明與現有技術相比，具有操作簡單，價格便宜，特異性好，靈敏度高，同時有較好的可重復性，將為艾滋病的防治和科學研究提供有力工具。
權利要求
1.一種質粒，其特征在于該質粒為pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486。
2. pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486的構建方法，其特征在于將8E5細胞含有的單拷貝HIV-1前病毒DNA進行Sal I/Sac I雙酶切，與被同樣雙酶切的pSP64Poly(A)質粒發生粘性末端連接，得到含有HIV-1gag基因片斷的pSPgag737重組質粒，轉化至JM109感受態細胞。經酶切/PCR鑒定，得到陽性克隆子。體外轉錄陽性克隆子，獲得病毒載量定量測定的RNA外參照。
3. pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486在艾滋病毒載量測定上的應用，其特征在于應用權利要求1、2的外參照，將聚合酶鏈反應技術與柯達電泳圖譜分析系統相結合，建立了測定HIV-1感染者和艾滋病人血漿的病毒載量定量測定的方法。
全文摘要
一種質粒及其構建方法和在艾滋病毒載量測定上的應用,屬艾滋病防治領域。質粒為pSPgag737/JM109CGMCC NO.0486。構建方法是將HIV－1前病毒DNA進行Sal I/sacI雙酶切,與被同樣雙酶切的pSP64Poly(A)質粒發生粘性末端連接,得到含有HIV－lgag基因片斷的pSPgag737重組質粒,轉化至JM109感受態細胞,經酶切/PCR鑒定,得到陽性克隆子。體外轉錄陽性克隆子,獲得病毒載量定量測定的RNA外參照,將PCR技術與Kodak電泳圖譜分析系統相結合,建立了HIV感染者和艾滋病人血漿病毒載量的定量測定方法。本發明操作簡單,價格便宜,特異性好,靈敏度高,可重復性好,作為艾滋病的科學研究與防治的工具。
文檔編號G01N33/53GK1348102SQ0013160
公開日2002年5月8日 申請日期2000年10月11日 優先權日2000年10月11日
發明者賁昆龍, 夏雪山, 徐煥賓, 馮漢平 申請人:中國科學院昆明動物研究所