專利名稱：用于確定試樣檢測初始時間的電化學分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于測量生物液體中的分析物濃度的電化學設備；更具體地說，涉及確定該液體在設備的工作電極和參比電極之間產生電連接的時間的機理。
涉及對生物液體進行測試的各種藥物診斷方法，如對血液，尿液，或者唾液進行測試，以便確定在該液體中分析物的濃度。在這些分析物中最具吸引力的是葡萄糖，并且含有酶基組合物的干相試劑條帶廣泛地用于臨床實驗，醫師診所，醫院，和家庭中，以測試生物液體試樣中的葡萄糖濃度。實際上，試劑條帶已經成為許多國家的估計約1千6百萬糖尿病人每日所必須的。由于糖尿病可導致血液化學危險的反常現象，它可能導致失明，腎功能衰竭，以及其它嚴重的醫學后果。為了降低這些后果的危險性，許多患有糖尿病的人必須定期進行自我測試，以便據此來調節他們的葡萄糖濃度，例如，通過控制日常飲食和/或通過注入胰島素。一些患者必須每天測試他們血液中的葡萄糖濃度四次或更多次。
對于那些必須控制飲食以便控制攝入的糖量和/或控制胰島素注入量的糖尿病患者，以及那些必須在頻繁測試血液中葡萄糖濃度的指導下的患者而言，快速，廉價，并且準確的葡萄糖測量系統是特別重要的。
一種葡萄糖測量系統采用電化學方法，在干試劑條帶上測試血糖的氧化作用。該試劑通常包括酶，例如葡萄糖氧化酶或者葡萄糖脫氫酶，以及氧化還原介質，例如二茂鐵或者高鐵氰化物。此種測量系統公開在Nakamura等人的US4224125(1980年9月23日出版)；Higgins等人的US4545382(1985年10月8日出版)；以及Nankai等人的US5266179(1993年11月30日出版)中，現在結合入本文以供參考。
電化學葡萄糖計的特征在于，根據該系統是否涉及分別測量電荷，電流或電壓來決定采用電量計，電流計或電壓計，從而確定葡萄糖濃度。在每種情況下，重要的是確定血液試樣接觸試劑的時間點，因為必須在此后的精確的時間期間向條帶提供一電信號。
在Nankai等人的US5266179(1993年11月30日出版)中公開了一種測量血糖的電化學系統，其中試樣應用時間被定義為在施以恒定電壓的一對電極間產生電阻降的時間。
White等人的US5366609(1994年11月22日出版)中描述了與上述相同的原理，即監控電極之間的電阻降以確定向干葡萄糖試劑條帶提供血液的時間。在上述兩個專利中，向工作電極和參比電極間施以恒定電壓，以追蹤由于向干試劑條帶提供血液試樣而導致的電阻變化。
為了得到精確的結果，試樣檢測過程應在不擾亂分析物濃度的條件下進行，并且業已公開了許多種減少分析物微擾的技術。
Quade等人的德國專利DDR148387(1979年12月28日出版)中公開了一種電化學測量方法，使用一種新型的電子電路，可允許在恒電壓(施加恒定電壓)和恒電流(施加恒定電流)模式之間快速轉換，同時還可減少電子元件的數量。該電路的目的是減少測量前試樣的微擾。
Bartels等人的德國專利DDR208230(1981年11月2日出版)中公開了一種電化學測量方法，也試圖減少試樣的微擾。該測量設備包括一個電路，該電路中用二極管減少測量前的電流，而不使用額外的電流控制環路。而且，該電路以精確、快速的方式轉換為電壓模式。
Littlejohn等人的US4940945(1990年7月10日出版)中公開了一種可以測量血液試樣pH值的便攜式設備。該設備檢測室中試樣的方法是向位于試樣室外的填充電極和位于試樣室內的兩個電極之一通入恒電流。當阻抗下降至少兩個數量級時，該測量計識別出已經提供了足夠的試樣并發出嘟嘟聲。而后，切斷填充電極的電路，該電路中包括試樣室內的兩個電極，并且進行電壓測量。
本發明提供了一種測量生物液體試樣中分析物濃度的方法，該試樣提供給電化學診斷條帶，該類條帶包括并列設置的工作電極和參比電極。該方法包括(a)在工作電極和參比電極之間施加一預定的恒流源，(b)監控電極之間的電位差，(c)將試樣提供給條帶，(d)當電位差下降至低于預定的閾值電壓時進行記錄，以確定試樣檢測時間，(e)向試樣施加一預定的恒電壓，(f)在施加恒電壓后，在預定的時間測量電響應，
(g)用測得的電響應計算分析物濃度。
測量提供給診斷條帶的生物液體試樣中分析物濃度的測量計，包括，電連接的下述裝置(a)向工作電極和參比電極之間施加預定電流的裝置，(b)監控電極之間電位差的裝置，(c)用于確定電位差低于指示試樣檢測的預定閾值電壓的裝置，(d)對試樣檢測作出響應，以便向試樣施加預定的恒電壓的裝置，(e)測量最終電響應的裝置，以及(f)通過使用測得的電響應計算分析物濃度的裝置。
本發明提供一種用于測量分析物濃度的電化學方法和設備，包括以高精度確定將試樣提供給電化學診斷條帶的反應區并橋接電極之間縫隙的時間。精確地確定試樣施加時間(更具體地說，試樣檢測時間；我們使用可替代的術語)允許對試樣進行更精確和更高精度的分析。
本發明確定試樣使用時間的方法，其優點在于，與施加恒電壓的現有技術相比，本發明施加恒定的小電流來檢測試樣減少試樣的微擾。使用后一種方式，施加試樣時將導致電流超過限定的閾值，則計時開始。由于取樣速率受限，該電流一般相當大，在傳感器感知以前就已經超過了閾值。當觀察到大電流時，觀察到介質中有相當大的微擾。這將導致不精確測量，特別是對于低分析物濃度。
現有技術施加恒電壓以檢測施加試樣的方法還有另一個缺點，即初始電流一般隨著分析物濃度的減少而下降。因此，更難以確定低分析物試樣的初始試樣檢測時間。根據相同的原因，如果電流閾值設定得太低，由于干擾可能導致錯誤地觸發。由于進一步的復雜原因，存在高濃度的血紅細胞也可導致初始電流的下降。
分析物濃度和血紅細胞濃度不影響本發明的方法。同樣地，干擾也不是主要問題，因為檢測的觸發器是電壓信號的大幅變化。
圖1描繪的是本發明試樣檢測方法中施加的電流-時間和測得的電壓-時間的圖。
圖2是本發明分析方法中施加的電壓-時間和最終電流響應-時間的圖。
圖3是本發明可替代的分析方法中施加的電壓-時間和電流響應-時間的圖。
圖4是本發明另一個可替代分析方法中電荷-時間的圖。
圖5描繪的是適合用在本發明分析方法中的電化學設備圖。
圖6是適合用于本發明的電路圖。
本發明涉及一種測量生物液體中分析物濃度的電化學方法。為了簡單起見，下面將重點描述測量全部血液試樣中的葡萄糖濃度；然而，本領域中的熟練人員能夠了解如何將該方法用于檢測在其它液體(如唾液，尿液，間質液體等)中的其它分析物(如膽固醇，酮體，酒精等)。
用于測量液體試樣中分析物濃度的電化學(電流)方法包括將試樣置于電化學池的反應區中，該電化學池具有兩個電極，其阻抗適合于進行電流測量。該分析物可直接與電極反應或與氧化還原劑反應生成可氧化(可還原)的物質，其生成量相應于分析物的濃度。該可氧化(可還原)物質的含量用電比學方法確定。此類分析方法必須精確限定試樣在反應區進行測試的時間點。這可允許在提供試樣后立刻施加電化學波形(即電壓)以及精確限定潛伏期或反應時間。相反，這可以提高分析的精確度和精密性，如下文所述。
本發明提供一種用于確定試試樣檢測時間的改進方法和設備。該方法包括向電化學診斷條帶的電極提供小的恒流源，并監測電極之間的電位差。由于在電極之間存在一干燥縫隙，因此開始時流過一可忽略的電流。當試樣提供給該條帶并填充該縫隙時，測量電壓快速下降，導致測試時間開始。以這種方式確認已經提供了試樣，并且該設備由恒電流模式轉換為恒電壓模式。在恒電壓模式中，測量作為時間的函數的電流或電荷，以便計算分析物濃度。該項技術減少了由于時間-初始電路造成的信號響應誤差，并因此允許低的檢測限制。電子組件簡單且成本低。
圖1描繪的是本發明試樣檢測方法中施加的電流和測得的電壓的圖。在零時間之前(即在試樣引入前)，在電極之間施加恒電流(例如此處為1μA)，但僅僅是可忽略的電流流動。更小的電流可減少微擾，并且優選地特別適用于低的分析物濃度。測得的電壓由電路的電源電壓決定－此處為5V。當將試樣引入池中時(在零時間點)，施加的電流可以在個電極之間流動，并且測得的電壓快速下降。當該電壓降至低于閾值電壓時，該設備從施加恒電流轉換為施加恒電壓。
圖2描繪的是試樣檢測后，作為時間的函數的施加電壓與測得電流的圖。試樣在時間t=0開始進行檢測，其后立刻向工作電極和反電極之間施加電壓。其結果是，在電極之間有電流流動。一旦體系建立起來，使用已知分析物濃度的試樣，在預定的時間后該電流作為分析物濃度的量度。預定時間的長短沒有嚴格限制。當液體為血液而分析物為葡萄糖時，一般至少為約3秒。該期間一般可提供足夠的時間以便使試劑溶解，并且減少易于測量的介質的用量。在高血細胞比容的情況下，所有物質都是相同的，需要較長的時間溶解。實際上，一般使用者感興趣的是越快越好地讀數。10秒的時間一般令人滿意，不必等更長的時間。當然，一旦確定了預定的時間，精確和精密的結果需要每次均使用相同的時間。在任何情況下，精確的電流確定依賴于精確的t=0的確定。
圖3描繪的是在可替代方法中，測得電流和施加電壓相對于時間的圖。在該方法中，第二個電壓脈沖在預定的時間之后施加給電極。一般地，該第二個脈沖在預定時間之后立即施加(以便減少總測量時間)，但也可允許延遲。再次，具有再現性的結果需要具有再現性的過程；因此，在該方法中，精確確定t=0點也是重要的。該第二個脈沖導致流過電極的電流中產生正峰，隨后是衰減的電流。在體系建立起來后，該分析物濃度可以單獨由衰減速率確定，也可與圖2中描繪的電流測量共同確定。一般地，在該第二個脈沖后，該電流呈周期性的指數衰減，開始為約1秒隨后持續至少幾秒鐘。
圖4描繪的是圖3的方法，其中測量的是電荷而不是電流。根據圖3，分析物濃度可以從在固定時間的總電荷和/或從施加該第二個電壓之后的衰減速率來確定。
圖5描繪的是適用于下述方法的“薄層”設備10。基片12為其上沉積有Pd涂層16的聚酯脂基體14，從而形成工作電極，沉積方法一般為濺射。由緩沖劑、介質和酶組成的干試劑沉積在電極一端18附近。間隔層20是具有限定出電化學池的剪切塊22的雙側粘合層。一般地，該間隔器的厚度小于約200μm。頂層24為其上沉積有Au層28的聚酯層26，從而形成參比電極，沉積方法一般也為濺射。
上述類型的設備可以用葡萄糖氧化酶(GOD)/高鐵氰化物體系，通過下述反應來確定葡萄糖濃度，其中GOD*為還原的酶。
反應1
反應2。
高鐵氰化物([Fe(CN)6]3-)作為介質，將GOD*還原為其催化態。只要還存在過量的介質，GOD和酶催化劑就將繼續氧化葡萄糖。亞鐵氰化物([Fe(CN)6]4-)是總反應的產物。理想地，開始時沒有亞鐵氰化物，但是實際上往往存在少量的亞鐵氰化物。該反應完成后，亞鐵氰化物的濃度(用電化學法測量)表明葡萄糖的初始濃度。總反應是反應1與反應2的和。
反應3GOD葡萄糖+2高鐵氰化物→葡萄糖酸+2亞鐵氰化物“葡萄糖”特指β-D-葡萄糖。
在PCT申請WO97/18465中詳細描述了該體系，在此處結合入本文以供參考。
圖6描繪的是適合用于本發明的電路的實施方案。開始，在位置1通過開關105向該條帶施以恒流源。該恒流源由操作放大器104，電壓基準102，以及電阻器101和103組成。該電流由電壓基準102和電阻器103的比值確定。電阻器101用于產生所需的偏流。操作放大器110和電阻器109用作電流-電壓轉換器。開始，在條帶上沒有試樣，點107和108之間的電阻非常大，并且流過條帶的電流可以忽略。在此條件下，操作放大器104輸出的電壓(V1)高。當將試樣提供給條帶時，其電阻顯著下降，并且由于恒電流流過條帶，V1下降。V1通過模擬-數字轉換器111輸入到微處理器112。微處理器112確認該電壓降作為試樣檢測的開始，開關105置于位置2以便使條帶與電流源斷開，并使其與電壓源106連接。在此種情青況下，計時電流測量可以通過測量操作放大器110的輸出電壓(V2)獲得。該電壓與流過條帶的電流成比例。
下面的實施例用于說明本發明，但是并不作為對本發明的任何限制。
實施例建立圖6中的電路，其中條帶S為如圖5所示類型的薄層電化學葡萄糖條帶，并具有Pd和Au電極。該Pd電極用緩沖劑，葡萄糖脫氫酶(PQQ)以及高鐵氰化物涂覆。向該干葡萄糖條帶的工作電極和反/參比電極之間施加恒定的、小(-1μA)而無干擾的電流。由于該條帶是干燥的，工作電極和反/參比電極之間的電阻基本上是無限大。當全部血液試樣均施加給該池后，觀察到電壓下降。閾值為約50～500mV時為開始時間(優選的是閾值為約300mV)。當試樣檢測后，該設備由施加恒電流轉換為施加恒電壓。由該試樣測得作為時間函數的電流值，從而計算葡萄糖濃度。
本領域的熟練人員應能理解，上述描述和實施例用于說明本發明，但是并不限制本發明。可以對現有的描述進行改進，而不超出本發明的精神和范圍。
權利要求
1.一種測量在生物液體中的分析物濃度的方法，該生物液體提供給電化學診斷條帶，該類型的條帶包括并列設置的工作電和參比電極，該方法包括(a)在工作電極和參比電極之間施加一預定的恒流源，(b)監控電極之間的電位差，(c)將試樣提供給條帶，(d)當電位差低于預定的閾值電壓時進行記錄，以確定試樣檢測時間，(e)向試樣施加一預定的恒電壓，(f)在施加恒電壓后，在預定的時間測量電響應，以及(g)用測得的電響應計算分析物濃度。
2.根據權利要求1的方法，其中測得的該電響應為在預定的時間流過該試樣的電流。
3.根據權利要求1的方法，其中測得的該電響應為從試樣檢測時間開始到預定時間流過該試樣的電荷。
4.根據權利要求1的方法，還包括在預定時間后施加第二預定電壓，并且在施加該第二預定電壓后測量第二電響應。
5.根據權利要求4的方法，其中該第二電響應為流過試樣的電流的衰減速率。
6.根據權利要求4的方法，其中該第二電響應為施加第二電壓后，在預定衰減期間，流過試樣的電荷。
7.一種測量在生物液體試樣中的分析物濃度的測量計，該生物液體提供給工作電極和參比電極之間的診斷條帶，該測量計包括電連接的下述裝置(a)向工作電極和參比電極之間施加預定電流的裝置，(b)監控電極之間電位差的裝置，(c)用于檢測電位差低于指示試樣檢測的預定閾值電壓的裝置，(d)對試樣檢測作出響應，以便向該試樣施加預定的恒電壓的裝置，(e)測量最終電響應的裝置，以及(f)通過使用測得的電響應計算分析物濃度的裝置。
8.根據權利要求7的測量計，其中測量最終電響應的裝置為安培計。
9.根據權利要求7的測量計，其中測量最終電響應的裝置為庫侖計。
10.根據權利要求7的測量計，還包括向該試樣施加第二預定電壓的裝置，以及測量第二最終電響應的裝置。
11.根據權利要求10的測量計，其中測量第二最終電響應的裝置為安培計。
12.根據權利要求10的測量計，其中測量第二最終電響應的裝置為庫侖計。
13.一種測量在生物液體中的分析物濃度的方法，該生物液體提供給電化學診斷條帶，該類型的條帶包括并列設置的工作電極和參比電極，包括(a)在工作電極和參比電極之間施加一預定的恒流源，(b)監控電極之間的電位差，(c)將試樣提供給條帶，(d)當電位差低于預定的閾值電壓時進行記錄，以確定試樣檢測時間，(e)向試樣施加一預定的恒電壓，(f)在第一預定時間后，向試樣施加第二預定電壓，(g)在第一預定時間后，在預定的時間測量電響應，以及(h)用測得的電響應計算分析物濃度。
14.根據權利要求13的方法，其中測得的該電響應為流過試樣的電流的衰減速率。
15.根據權利要求13的方法，其中測得的該電響應為施加第二預定電壓后，在預定時間期間，流過試樣的電荷。
全文摘要
一種電化學分析方法,包括:以高精度確定試樣橋接電化學池電極之間縫隙的時間。該方法涉及向縫隙施加恒定的小電流,同時監測電極之間的電位差。試樣開始檢測后施加一恒電壓,并且在一定的時間內監測流過試樣的電流和/或電荷。由測得的電流或電荷,計算感興趣的分析物濃度。
文檔編號G01N27/416GK1284652SQ00122720
公開日2001年2月21日 申請日期2000年6月15日 優先權日1999年6月15日
發明者T·J·奧哈拉, M·特奧多爾蔡克, M·Z·克爾馬尼 申請人:生命掃描有限公司