用于純化有機化合物的高效液相色譜方法

專利名稱：用于純化有機化合物的高效液相色譜方法
技術領域：
本發明總的來說涉及化合物庫，例如，組合和/或引導產生(Leadgeneration)庫的純化和/或鑒別。
目前，由許多常用方法用于純化合成化合物。這些方法一般涉及從多種雜質中純化單一目標化合物。通常，化合物在多孔板或多管排列中合成，相關化合物的數量數以千計。很難以化合物合成的速度純化和鑒別庫中的化合物。
用于純化大量化合物的一個方法涉及色譜分析每個化合物的重復方法。它包括每個分子的合成、檢測和純化的周期過程。通常，研究純化化合物的適當純化方法需要花費大量時間。
研究出用于純化和/或鑒別化合物庫的迅速有效方法，是非常有價值的，其可以應用于大量的有機化合物。本發明提供了這種方法。
本發明公開了用于純化和/或鑒別化合物，特別是化合物庫，如組合和/或引導產生庫。本發明還公開了能夠用于該方法的純化裝置。
該方法基于這樣一個發現，即結構近似化合物，如組合和/或引導產生庫中的化合物通常其在薄層色譜(TLC)板上具有大致近似的保持系數(Rfs)，在高效液相(HPLC)柱上具有大致近似的保留時間。該方法應用這一發現確定純化近似化合物庫的最佳條件。
對于給定的填充柱、溶劑系統、和流速，多數化合物傾向于在分析和/或制備HPLC柱上在某一時間洗脫。同樣，多數化合物在TLC板上移動某一距離。一些化合物一點也不移動(Rf=0)，其它移動低Rf值(例如，0.05＜Rf＜0.2)，中等Rf值(例如，0.2＜Rf＜0.8)，或高Rf值(例如，Rf＞0.8)。可以很容易地測定一系列三個或更多的，優選四個或更多的Rfs區，或在分析HPLCs中，測定一系列的保留時間，其中庫中化合物的多數將洗脫出來(當在分析HPLCs中)，或移動(當在TLC中)，例如，在TLC板上低、中、高Rfs。這些區可以與進行制備或半制備HPLCs的制備或半制備方法相關。
對于給定的分析HPLC和/或TLC方案，可以鑒別一組制備HPLC條件，其中在一個區的化合物可以與其它區的化合物分離。因此，在化合物庫有代表性的樣品中，如果所有的或基本上所有的化合物存在同一區內，可以應用相同的HPLC方案純化該庫，其中可以很容易地與TLC和/或分析HPLC中的一個區相關。
本發明描述的方法涉及評價化合物庫中化合物有代表性的樣品，如組合或引導產設庫，通過TLC和/或分析HPLC，測定它們在TLC板上移動的區域，和/或在分析HPLC柱上洗脫時間。一旦鑒別出該區，使用相關的制備或半制備方法純化該庫。
通過給定分析HPLC柱、溶劑系統和流速，和/或TLC底板和溶劑系統，路線尋找庫中有代表性的樣品，可以制定出化合物庫中適合的純化條件。相關的制備或半制備HPLC方法可以用于純化化合物庫，而不必改變純化參數，這樣整個庫可以應用單一的方法。
適合的樣品數量典型為該庫的2-5％之間，依賴于庫中化合物的數量。由于人們尋找適合的純化路線，該方法在本文指“路線尋找”。
優選對化合物有代表性的樣品既進行TLC又進行HPLC分析。還優選對庫中的化合物樣品在純化整個庫前進行制備或半制備HPLC。它可以使人們證實適合純化整個庫的條件，例如，通過測定化合物有代表性樣品中的純度。并且，可以對庫中10-100％，優選50-100％化合物進行TLC分析，將TLC與有代表性的樣品進行比較。通過進行整個庫的TLC分析，和/或測定化合物有代表性樣品中的純度，可以保證庫中多數化合物可以進行足夠的純化。如果有代表性樣品的純度不夠，或庫中的TLC不足以與有代表性的樣品進行比較，可以使用可選的制備HPLC條件。
如果可能，有代表性的樣品應該包括庫中合成的大多數極性和非極性化合物，以助于確保該方法適合于整個庫。
本文描述的方法大大節約了化合物庫的純化和鑒別，可以提供化合物大于90％的純度。
化合物通常以組合庫的形式形成，其通常以多孔板或多管排列的形式。化合物合成、純化和評價的主要瓶頸在于確定化合物適合的純化條件。本文描述的方法詳細描述了如何純化結構相關化合物的整個庫。
該方法的發明前提是結構近似化合物，如組合和/或引導產生庫中的化合物。通常其在薄層色譜(TLC)板和高效液相(HPLC)柱上具有大致近似的保留時間。對于給定的吸附劑、溶劑系統、和流速，多數化合物傾向于在板上移動某一距離。例如，一些化合物一點也不移動(Rf接近0)，其它移動低Rf值(例如，0.05＜Rf＜0.2)，中等Rf值(例如，0.2＜Rf＜0.8)，或高Rf值(例如，Rf＞0.8)。該方法應用這項發明確定純化近似化合物庫的最佳條件。
本方法的一個優點是在進行制備HPLC前只對有代表性的樣品進行分析HPLC。應用本文描述的方法，通過制備HPLC的純化，所有或基本上所有化合物的純度可以大于90％。定義本文中使用的術語“制備HPLC”及相關術語指能夠制備高(500或更多)微克、毫克或克大小的產品組分的HPLC系統。術語“制備”包括制備和半制備柱，但不包括分析柱，其提供納克或低微克級的組分。
本文中使用的術語“機械操作”當指轉換閥門時指不通過手工操作選擇閥門的不同位置，即通過計算機選擇。實際上機械操作可以為電(即螺線管控制閥門)，氣動(即空氣壓力控制閥門)，液壓(液體壓力控制閥門)，或其它等價的裝置。
本文中使用的術語“HPLC相容性檢測器”指適合用于HPLC系統的檢測器，當洗脫出化合物峰后，它可以提供可檢測的信號。例如，當一種化合物從組分中洗脫出來，可以產生信號的檢測器為HPLC相容的檢測器。其中組分的吸收度變化較寬，可能有必要使用多個檢測器。由于其不能檢測出非期望的峰，能夠檢測出所需組分的檢測器不是“不相容”的檢測器。
“廢液儲庫”指適合收集洗脫液的裝置，其不包括需要的化合物，例如，在需要的化合物洗脫前和洗脫后，在從柱流過或洗脫出的，用于再生柱的溶劑。適合的廢液儲庫包括燒瓶、瓶子或水壺。
HPLC裝置頂替色譜(一個HPLC的例子)基于樣品在固定相(SP)和流動相(MP)之間平衡的原則，改變SP的方向。樣品的單個組分像火車一樣互相替換，與SP親合更強的替換劑將組分的火車推出柱。氣相色譜、液相色譜和HPLC色譜是頂替色譜中最熟知的例子。
一個HPLC裝置典型包括至少下列部分一個柱，填充有適合的固定相，流動相，在壓力下使流動相通過柱的泵，和一個用于檢測從柱中洗脫出的化合物存在的檢測器。該裝置可以任選包括用于提供梯度洗脫的裝置，其中溶劑系統在純化過程中變化。
用于進行HPLC分離的常規方法和裝置是本領域公知技術，例如，如下列文獻所描述色譜雜志(J.Chromatography)，192∶222-227(1980)，液相色譜雜志(J.Liquid Chromatography)，4∶661-680(1981)，和色譜雜志(J.Chromatography)，249∶193-198(1982)。
適合的固定相為能從其中洗脫出所需化合的那些物質。優選的柱為反相柱，其可以為天然的(具有不同長度烷基鏈的硅膠)或合成的交聯聚合物(由苯乙烯和二乙烯基苯組成)。固定相粒徑的大小范圍在幾微米至幾百微米之間。最優選的固定相為C18柱。
適合的檢測裝置包括質譜和UV檢測器。本文描述的方法當檢測樣品時，使用這兩種檢測器。
本文描述的方法通常需要使用相對高的壓力(例如直到大約2000psi)，依賴于泵頭、柱大小、流動相和吸附劑顆粒的粒徑。該壓力可能超過標準制備HPLC的正常操作條件。該方法還通常要求使用流動相的流速(例如，超過30mL/min)超過標準制備HPLC的正常操作條件。
在一些實施方案中，甲醇/水用作流動相。甲醇/水溶劑系統比其它等價使用的系統乙腈/水(其更常用，但成本可能更高)粘度更大。增加的粘度傾向于產生高的柱壓，這可能需要使用高壓管，以及比正常內徑更寬的管。并且，使用相對小粒徑(例如，5微米或更小)的柱填充物可以增加柱壓，這進一步要求使用更寬的管。
純化方法該方法涉及通過TLC和/或分析HPLC測定TLC板移動到哪個區和/或分析HPLC柱洗脫到哪個區，評價結構近似的化合物庫中有代表性的化合物樣品。一旦鑒別該區后，使用相關的制備或半制備方法純化該庫。
可以測定一系列三個或更多區的TLC板的保留因子和/或分析HPLC的保留時間，使制備HPLC方案與每個區相關。該區可以為，例如，低、中和高TLC板的Rfs，其中低、中和高是任意的詞，其可以被定義為使它們符合于相關制備或半制備HPLC方案(將一個區的化合物與其它區的化合物分離)的任何適當的方式。對于給定的分析HPLC和/或TLC方案，可以確定一組HPLC條件，其中，一個區的化合物可以與其它區的化合物分離。
因此，如果TLC和/或分析HPLC表明化合物庫中所有的或基本上所有的(即，大于95％)化合物存在于同一區，它們可以應用一種相關的HPLC方案進行純化。
如在本文中所使用，有代表性的樣品通常小于庫的10％，更優選小于庫的5％，最優選在庫的2-5％之間。樣品中化合物的數量根據庫的多樣性(按照極性，和由此得到的HPLC柱保留時間或TLC板的保留因子)。如果可能，有代表性的樣品應該包括庫中合成的大多數極性和非極性化合物，以助于確保該方法適合于整個庫。
如在本文中所使用，區指保留時間或保留因子的范圍。例如，一些化合物一點也不移動(Rf接近0)，其它移動低Rf值(例如，0.05＜Rf＜0.2)，中等Rf值(例如，0.2＜Rf＜0.8)，或高Rf值(例如，Rf＞0.8)。應用TLC和應用保留因子的這些范圍，可以鑒別出三個區，低、中和高。該區可以與制備或半制備HPLC純化化合物的條件相關，其中化合物在TLC板上移動到特定的區，具有某一Rf值。應用這些有代表性的區，對一系列的化合物進行TLC和制備HPLC，結果如實施例1所描述。在TLC板上用于洗脫化合物的優選溶劑系統為80％甲醇/20％水(v/v)，在實施例1中使用該溶劑系統。
純化方案優選使用四個或更多的區。考慮到應用給定溶劑系統的TLC板的保留因子范圍，或應用給定填充柱和溶劑系統的分析HPLC柱上的保留時間范圍，本領域技術人員可以很容易地和主觀地測定一組區，并將這些區與有效制備HPLC條件相關，以純化落入某個特定區的所有化合物。
應用本文描述的方法，可以迅速地確定一組可廣泛應用該庫的條件。當與涉及庫在進行制備HPLC條件前對整個庫進行分析HPLC的傳統方法相比，它可以明顯加快純化該庫的時間。
對于給定的分析HPLC柱，溶劑系統和流速，和/或給定的TLC板和溶劑系統，通過路線尋找庫中有代表性的樣品，可以制定出用于純化化合物庫的適合條件。可以應用相關的制備或半制備HPLC方法，純化化合物庫，而不必改變純化參數，使在整個庫可以應用單一的方法。
優選對化合物有代表性的樣品既進行TLC又進行HPLC分析。還優選對庫中的化合物樣品在純化整個庫前進行制備或半制備HPLC。它可以使人們證實適合純化整個庫條件，例如，通過測定化合物有代表性樣品中的純度。并且，可以進行庫中10-100％，優選50-100％化合物的TLC分析，將TLC與有代表性的樣品進行比較。通過進行整個庫的TLC分析，和/或測定化合物有代表性樣品中的純度，可以保證庫中多數化合物可以進行足夠的純化。如果有代表性樣品的純度不夠，或庫中的TLC不足以與有代表性的樣品進行比較，可以使用可選的制備HPLC條件。
本文描述的方法大大節約了化合物庫的純化和鑒別，可以提供化合物大于90％的純度。
在一個實施方案中，該方法涉及進行下列步驟a)選擇化合物庫進行純化，b)對庫中有代表性的樣品進行TLC和/或分析HPLC，該樣品包括庫中小于10％的化合物，c)基于有代表性的樣品如何從分析HPLC柱洗脫(確定保留時間區)，和/或樣品如何在TLC板(確定保留因子區)移動，確定相關制備HPLC方法，和d)純化庫中所有或基本上所有的化合物。
其中相關制備HPLC方法的測定基于保留時間3個或更多區之間的相關(如果進行分析HPLC)，和/或保留因子3個或更多區之間的相關(如果進行TLC)，這樣如果有代表性的樣品中基本上所有的化合物落在特定區，可以使用相關的制備HPLC方案，純化落在區內的化合物。
分析HPLC和TLC都優選在步驟a中進行。有代表性的樣品在純化所有或基本上所有的庫前，優選通過制備HPLC進行純化。有代表性的樣品進行純化后，優選測定樣品中化合物的純度。它提供了用于檢查該方法迅速有效的方法，以保證有效工作。
測定純度后，可以任選對庫中10-100％，優選50-100％化合物進行TLC分析，在與步驟a中進行TLC相同或基本上相同的條件下進行。這證明了用于有代表性的樣品，并用于整個庫的條件。
通過檢查有代表性樣品的純度和對庫中大部分化合物進行TLC，可以證明該技術足可以純化化合物，該條件可廣泛用于整個庫。如果不能獲得期望的純度，和/或如果有代表性的樣品和10-100％庫的TLC顯示化合物移動到同一區，那么需要用可選的制備HPLC方案進行測定。在某些場合，可以對庫中的一部分應用不同的方案。
在所有或基本上所有的庫的制備HPLC中，通過應用紫外和/或MS檢測器測定樣品中所需化合物的存在(從制備HPLC洗脫出來)，優選對組分進行收集。
在一個實施方案中，化合物庫的純化通過a)通過TLC或分析HPLC測定化合物庫中的化合物或化合物中有代表性的樣品的Rf或保留時間，b)將Rf或保留時間與具有一組參數的一組制備HPLC條件相關，其中是與用于TLC或分析HPLC的條件相關，和c)對庫中的一個化合物或多個化合物進行制備或半制備HPLC，其中1)從制備或半制備HPLC柱中得到的洗脫液一部分通過紫外檢測器檢測，另一部分通過質譜檢測器檢測；2)丟棄洗脫液，直到紫外或質譜檢測器顯示洗脫出所需的化合物，3)通過質譜檢測器測定含有所需的化合物的樣品，
4)收集含有所需的化合物的樣品；5)用適當的溶劑洗柱，使從柱中除去任何雜質；6)再平衡柱，和7)對每個化合物重復必要的步驟，進行純化和/或鑒定。
該方法允許同時收集紫外吸收或質譜數據。通過質譜檢測器收集的組分具有幾種與之相關的風險，包括由于分子質量的計算錯誤損失期望的化合物，形成加合物，和損失在該使用條件下未離子化的化合物。另一方面，通過質譜檢測器收集組分的優點在于只收集少量組分。通過紫外和質譜檢測器合用收集組分，可以獲得通過質譜檢測器收集組分的有利方面，而避免其不利方面。但是，這樣做的困難是很難通過UV收集組分，和使用高流速梯度。為了保證可靠分離洗脫液至MS和組分收集器，在供液泵(在線稀釋泵，其在第二次分離前稀釋進入質譜檢測器的洗脫液)和探針之間的在線壓力，必須低于后柱進口和組分收集器之間的在線壓力。為了獲得滿意的壓力，可以改變標準HPLC裝置對管的要求，提供更寬的管以處理增加的流速，任選使用UV/DAD(二極管陣列檢測器)或其它適合進行組分收集的檢測器。
可以任選進行下列步驟。收集的化合物信息(即紫外吸收和MS信息)可以儲存在相關的數據庫中，數據庫中還優選包括關于化合物的其它信息(即合成條件、生物檢測信息、產量等)。可以進一步鑒別化合物，例如，通過1H NMR。為了更快地評價化合物的純度，HPLC可以包括兩個或更多的柱，其中的一個用于測定化合物的Log P值，而另一個清洗和再生。該步驟消除了色譜平衡等待時間。
可以應用該方法評價的化合物的類型應用本文描述的方法，可以測定能從HPLC柱洗脫的任何有機化合物的Log P值和純度。該化合物優選為一個化合物庫的一部分，更優選為引導產生的或組合化合物庫。應用該方法獲得的純度通常大于90％，優選大于95％。
術語“庫”指至少3個，優選為102-109，更優選為102-104化合物。優選這些化合物是在一個易于合成它們的單一溶液中或反應混合物中制備的多種化合物。庫中的每個化合物可以是分離的，或任選已被鑒定。
一般情況下，化合物具有一個核心結構，其中在至少一個位置，優選兩個或更多的位置上被多種不同的官能團進行修飾，以產生一個庫，例如，組合的或引導優化(lead optimizaton)的化合物庫。
典型的核心結構為直鏈的、支鏈的或環狀有機化合物，其包括至少3個碳原子，并且至少1個，優選至少2個部位能夠進行反應以改變結構，通常通過將其它分子加入到反應部位來進行。
殺蟲劑族的例子包括1-芳基吡唑、吡咯、吡咯烷酮和煙酸衍生物。然而，可以結合到適當結合部位的配位體化合物可以為，例如，甾類、激素、肽、蛋白質、低聚核苷酸、寡核糖核苷酸、酶等。
適合的核心結構包括，但不限于肽、蛋白質、低聚核苷酸、寡核糖核苷酸、低聚糖、生物堿、喹啉、異喹啉、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、嘧啶、四氫噻唑、咪唑并吡嗪酮、呃唑并吡啶、吡咯、吡咯烷、咪唑酮、guinolone、氨基酸、大環內酯物、penems、糖類、葉黃素、苯丙噻二嗪、anthracycline、二苯并環庚二烯、肌糖、卟啉、咕啉、和碳骨架存在的幾何體(例如，十二面體)。核心結構可以來源于天然存在的化合物，或者可以包括非天然修飾物(即，非天然存在的氨基酸和核苷)。
適合的核心結構修飾物包括1)氨基酸衍生物，其中包括，例如，天然的和合成的氨基酸殘基，其中包括所有天然存在的α氨基酸，具有衍生物的種類，天然存在的側鏈的變異體或類似物；N-取代的甘氨酸殘基；已知的在功能上類似氨基酸殘基的天然的和合成的種類，如抑制素、苯丁抑制素等。
2)核苷酸衍生物，其中包括天然的和合成的核苷酸，如腺苷、胸腺嘧啶，胍，尿苷，胞核嘧啶，它們的衍生物和嘌呤環的變異體和類似物，糖環，磷酸鍵和它們中的一些或全部的組合。核苷酸探針(2-25個核苷酸之間)和低聚核苷酸(超過25個核苷酸)包括所有各種可能的結構修飾；天然存在的核苷酸的同型和異型合成的排列和組合；含有合成的嘌呤或嘧啶類的衍生物和變異體，或它們的類似物；各種糖環類似物；多種可選的骨架類似物，包括但不限于磷酸二酯、硫逐磷酸酯、二硫逐磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸鹽、3’-硫醛乙縮醛(thioformacetal)，亞甲基(亞氨甲基)，3-N-氨基甲酸鹽，嗎啉代氨基甲酸鹽和肽核酸類似物。
3)碳水化合物的衍生物，其包括天然生理活性的碳水化合物；相關化合物，如葡萄糖、半乳糖、唾液酸、β-D-葡糖胺和nojorimycin，其均為葡萄糖苷酶抑制劑；偽糖，如5a-carba-2-D-吡喃半乳糖，已知其抑制肺炎克雷白桿菌的生長(n=1)；合成的碳水化合物殘基和它們的衍生物(n=1)，并且它們的所有的復合寡聚排列均發現于自然界中，包括高甘露糖低聚糖，已知的抗生素鏈霉素(n＞1)。
4)天然存在的或合成有機結構基序，術語“基序”被定義為具有或含有生物活性的特定結構的有機分子，如對酶活性部位具有互補結構的分子。該術語包括任何已知的藥物化合物的基本結構，包括藥效基團或它們的代謝物。該基本結構包括β-內酰胺，如青霉素，已知其抑制細菌細胞壁生物合成；二苯并氮卓，已知其與CNS受體結合，用作抗抑郁藥；多聚乙酰大環內酯物，已知其與細菌核糖體酶結合。這些結構基序已知具有特異性的所需的與配體受體結合的性能。
5)報告元件，如能夠光放大的天然或合成的染料或殘基，其具有可反應基團，可以在合成中結合到氨磺酰亞胺結構或反應程式中，可以通過這些基團附著，而干擾或影響基團的指示功能。優選的反應基團為氨，硫，羥基，羧酸，羧酸酯，特別是甲基酯，酰基氯，異氰酸鹽，烷基鹵化物，芳基鹵化物，和環氧乙烷基團。
6)含有可聚合基團的有機部分，如雙鍵，或能夠進行聚合或共聚的其它官能團。適合的基團包括乙烯基，環氧乙烷基，羧酸，酰基氯，酯，酰胺，二氫唑酮，內酯和內酰胺，還可以使用那些被定義為R和R’的其它有機部分。
7)大分子成分，如通過上面歸納的各種反應基團可以附著到氨磺酰亞胺結構上的大分子表面或結構，其結合方式使這種相連的種類與配體-受體分子的接合不產生負面影響，并且該連接的功能團的相互作用活性由該大分子確定或限制。大分子成分的例子包括多孔的和非多孔的無機成分，例如，二氧化硅，氧化鋁，氧化鋯，二氧化鈦等，其通常用于不同方面，如普通或反相色譜分離，水純化，用于著色的顏料等；多孔的和非多孔的有機大分子成分，包括合成成分，如苯乙烯丁二烯苯小珠，各種甲基丙烯酸酯小珠，PVA小珠等，其通常用于蛋白質純化，水軟化，和多種其它的應用；天然成分如天然的和功能化的纖維素，如，例如，瓊脂糖和殼質，由尼龍制成的薄片和中空纖維膜，聚醚砜，或任何上面提到的材料。這些大分子的分子量范圍可以直到大約2000道爾頓。
適合的化學修飾物還包括化學鍵合到適當的有機部分，放射性部分，氫原子，含有適當的親電子基團的有機部分，如醛，酯，烷基鹵化物，酮，腈，環氧化物等；適合的親核基團，如羥基，氨，羧酸鹽，酰胺，負碳離子，尿素等；或其中一個下面定義的其它結構成分。另外，化學修飾物可以以環、雙環或三環系統的形式；或連接到上述分子式定義的化合物重復單元末端的結構；或可以分別連接到其它部分上。
這種修飾可以相同或不同，每個可以含有一個或更多的碳、氮、硫、氧原子，任何無機元素，或它們的組合。例如，核心結構可以用氰基、氮、鹵素、氧、羥基、烷氧基、硫、直鏈或支鏈烷基、碳環芳基，和它們的取代或雜環衍生物。修飾可以是在不同的相鄰的分子核中，對于它們附著的碳原子具有選擇的立體化學排列。
化合物可以邏輯化的方式在多管排列(array)或多孔板，以化學化合物排列的形式合成。優選地，化合物都具有中心核結構，具有各種修飾，其可以進行結構-活性關系的鑒別，用其確定用于特定應用的最佳化合物。
排列的安排方式應可加快合成、純化和評價，以從測試獲得最大的信息內容，并便于迅速評價這些數據。
排列可以從邏輯排列的化合物的亞排列來建立。可以制備這樣一種亞排列，這種亞排列包括結構相關的單個化學化合物的可空間尋址的組，這些化合物具有共同的結構和可變的修飾。當結構中多個位置被修飾時，亞排列特別有用，在給定亞排列中的任何兩個化合物之間的變化可以包括，例如，結構中0個或1個改變。
這些亞排列和排列可以被組織形成更高次序的排列，其包括多組排列，可以被作為更高次序的排列評價，以提供關于感興趣的共同核結構的最佳結構特征的信息。
這種亞排列的安排方式應可通過直接比較化合物自動產生有關已知的片段在所期望的應用中所具有的效果的信息，以及對物理和反應性質的影響的信息。按照簡單群組理論(simple set theory)，對于任何數量的獨立可變結構多樣性元素(independently variable structural diversityelements)n，存在n個邏輯高階排列，這樣通過從適當排列的亞排列中相關地址的測試數據的比較，可以以類似的方式獲得每個n結構多樣性元素變化的效果的關系信息。
通過篩選核分子的所有可能合成變化，最佳候選者的選擇與選擇化合物的“合理”基礎相比，更應該說是數據收集方法的函數。可以迅速優化期望的物理和化學性質，即結合親和性與生物活性，直接在特定的排列或亞排列內與結構的改變相關。
因為已知每個化合物在多管架的空間地址，可以測試排列以產生完全的相關結構信息，因此一個正結果提供(1)關于在任何給定空間地址的化合物的信息；(2)在一組系統結構同種物上同時并列這一信息；(3)在存在正結果的負結果中提取相關結構信息的能力。
純化優選通過計算機控制進行，其中多管排列中每個管或多孔板中每個孔的位置儲存在計算機中，要合成的化合物的身份被儲存在計算機中的“記憶圖”中，或儲存在將化合物的數據與管或孔的位置相關的其它的裝置中。或者，可以人工進行純化，優選在多管架或多孔盤內進行，信息儲存在計算機中。可以純化和/或鑒別管中的化合物。
參照下列非限定性的實施例，可以進一步理解本發明。實施例1分析方法一系列的化合物通過C18TLC板進行評價，應用80/20v/v的甲醇/水溶劑系統。發現化合物具有四個保留因子范圍(Rfs)，Rf=0，0.05＜Rf＜0.2，0.2＜Rf＜0.8，或Rf＞0.8。
那些Rf=0的化合物應用內徑為0.46mm的5微米50mm C18反相HPLC柱進行洗脫。化合物通過兩個溶劑系統(溶劑A水/乙腈98/1.5(v/v)，和溶劑B100％甲醇)的不同梯度進行洗脫。
Rf在0.2和0.8之間的化合物用如下的方案Ⅰ或Ⅱ進行洗脫。Rf在0.05和0.2之間的化合物用如下的方案Ⅱ或Ⅲ進行洗脫。Rf大于0.8的化合物用如下的方案Ⅰ或Ⅳ進行洗脫。方案如下表所列。
表1方案Ⅰ(分析)
表2方案Ⅱ(分析)
表3方案Ⅲ(分析)
表4方案Ⅳ(分析)
分析柱的四個方案可以按比例放大至制備HPLC柱(內徑50×20，吸附劑粒徑為5微米或更少)的四個方案，如下表5-8所示。
表5方案Ⅰ(制備)
表6方案Ⅱ(制備)
表7方案Ⅲ(制備)
表8方案Ⅳ(制備)
在該實施例中，自動注射器為具有819注射閥動器的Gilson215液體處理器。組分收集器為Gilson215液體處理器。梯度泵為具有50SC泵頭的兩個Gilson306型泵。稀釋泵為具有1.5SC泵頭的Gilson307型泵。平衡為具有50SC泵頭的可編程HPLC Gilson305型泵。混合器為806型等軸Gilson811C動力混合器。壓力調節器為Gilson806型壓力調節器。使用的HPLC檢測器為Gilson170型二極管陣列檢測器(micromass的MS檢測器平臺LC型)。MS檢測器包括一個四倍質量分析器，其具有空氣壓力電離(API)源，可以用于空氣化學電離(APCI)和Megaflow電噴射(electrospary)電離探針。質譜檢測器配備有一個旋轉泵和轉換器。開關閥門為兩個Gilson配對閥門和一個10port Rheodyne開關閥門。分流器為一個由LC填充的1/1000 ACURATE和Upchurch分流器。數據收集系統為Digital CELEB GL-2計算機，監測器和Hewlett Packard Jet6P打印機，其包括在Windows NT V.4.0下工作的micromass Masslynx NT3.1B6，Openlynx VersionTM，FaractionLynxTM和Gilson的Upipoint v.1.64軟件。
自動制備-HPLC/UV/MS的裝配如

圖1所示。
系統的管尺寸如下從混合器到注射器，從注射器到柱，從柱到UV二極管陣列檢測器，和從UV到分流箱為Green Peek，Upchurch Scientific，INC0.03”ID。從制備泵到分流箱為Green Peek，Upchurch Scientific，INC0.01”ID。從分流箱到Upchurch分流器為Green Peek，Upchurch Scientific，INC0.07”ID。從Upchurch分流器到水儲庫為Green Peek，Upchurch Scientific，INC0.01”ID。從分流器到組分收集器為0.04”ID(Tubing Accurate/FC目錄編號PE-1000FC)。
在下面描述的純化方法中，管尺寸允許使用30mL/min的流速和相對小的吸附劑粒徑(5微米或更少)。傳統HPLCs通常使用更小尺寸的管，這樣獲得這樣高的流速就特別困難，因此，進行純化方法就特別困難。
圖1顯示了在HPLC運行中樣品分離的路徑。注射后，從梯度泵的溶劑分離柱A的成分，而柱B通過再平衡泵進行再平衡。10port Rheodyne開關閥門控制該過程。分離的組分進入二極管陣列檢測器，然后進入分流箱。在分流箱中，以1/1000的比例分離。只有一部分進入MS，其余進入廢液儲庫，通過UV或MS檢測到所需的化合物后，組分收集器開始收集樣品。進入到MS的部分通過稀釋泵稀釋，電噴射(electrospary)(ESP)電離探針流速為1.5mL/min。然后，稀釋液通過二次分流器(Upchurch分流器)再次進行分流，只有大約300μL進入ESP探針，其余運送至廢液中。二次分流器不需要空氣壓力化學電離(APCI)探針。應用Unipoint軟件控制梯度泵。
MS發現峰的延遲時間，峰到達組分收集器的延遲時間，以及UV檢測器與MS之間的延遲時間，應用香豆素作為標準物進行測定，應用甲醇/水(50/50)流動相，如表9所示。
表9 在延遲時間測定前，質譜檢測器用PEG200至PEG1000校準質量標度。質譜檢測器用不同流速的兩個探針進行轉換。
大量的化合物應用本文描述的方法通過HPLC柱。化合物的分子量范圍在100-650g/mol之間，樣品量在0.1-200mg之間，注射體積范圍在50-2000微升之間。
下面的實施例說明了高效率純化方法的應用。實施例2一個小化合物庫的純化選擇一個專利化合物庫，應用80/20甲醇/水作為洗脫劑，得到5個化合物的TLC圖譜，TLC圖譜如圖2所示。
計算TLC的Rfs大約為0.11，與預先限定的HPLC方法(實施例1中的方法Ⅱ或Ⅲ)進行相關。分別評價方法Ⅱ和Ⅲ，測定哪一種可提供更好的分離。色譜圖表明方法Ⅱ能更好地從雜質中純化化合物。
在制備HPLC柱上純化所需的化合物，注射體積為2mL，濃度為150mg化合物/2mL DMF。化合物在制備HPLC柱上的保留時間在3-3.5分之間。
在化合物中有代表性的樣品純化后，對整個庫進行TLC。TLC表明所有所需的化合物洗脫大致相同的Rf值(大約0.01)。
將制備HPLC方法應用到庫中的所有450個化合物，獲得的平均純度為91％，平均產量為28mg。大于85％的化合物的純度大于95％。
本領域技術人員應用常規的實驗，可以發現或確定許多與本文描述的本發明具體實施方案相等價的方法。這些等價的方法包括在下面權利要求的范圍內。
權利要求
1．一種用于純化和/或鑒別一種或多種有機化合物的方法，包括以下步驟a)選擇待純化的化合物庫，b)對庫中有代表性的樣品進行TLC和/或分析HPLC，該樣品包括庫中小于10％的化合物，c)基于有代表性的樣品如何從分析HPLC柱洗脫和/或樣品如何在TLC板移動，確定相關制備HPLC方法，和d)純化庫中所有或基本上所有的化合物。其中，如果進行分析HPLC，相關制備HPLC方法的測定是基于保留時間的3個或更多區之間的相互關系，和/或如果進行TLC，基于保留因子的3個或更多區之間的相互關系，這樣，如果有代表性的樣品中基本上所有的化合物落在特定區，可以使用相關的制備HPLC方案來純化落在區內的化合物。
2．按照權利要求1的方法，其中分析HPLC和TLC都在步驟a中進行。
3．按照權利要求1的方法，其中在所有或基本上所有的庫被純化前，通過制備HPLC純化有代表性的樣品。
4．按照權利要求3的方法，其中有代表性的樣品純化后，測定樣品中化合物的純度。
5．按照權利要求4的方法，其中測定純度后，在與步驟a中進行的TLC相同或基本上相同的條件下，對10-100％的庫進行TLC。
6．按照權利要求5的方法，其中將有代表性樣品的TLC與10-100％的庫的TLC進行比較。
7．按照權利要求5的方法，其中50-100％的庫通過TLC進行分析。
8．按照權利要求6的方法，其中如果有代表性樣品的TLC和10-100％的庫的TLC表明化合物移動到同一區，則通過制備HPLC對整個庫進行純化。
9．按照權利要求6的方法，其中如果有代表性樣品的TLC和10-100％的庫的TLC表明化合物沒有移動到同一區，則通過應用可選方法的制備HPLC對整個庫進行純化。
10．按照權利要求1的方法，其中有代表性樣品占整個庫的2-5％之間。
11．按照權利要求1的方法，其中在庫中所有或基本上所有的化合物進行制備HPLC中，通過應用UV和/或MS檢測器，測定到從制備HPLC柱洗脫出的樣品中存在所需化合物，開始收集樣品。
12．按照權利要求1的方法，其中所有或基本上所有通過制備HPLC純化的化合物的純度大于90％。
13．按照權利要求12的方法，其中在進行制備HPLC前，如果不能全部，只對有代表性的樣品進行分析HPLC。
全文摘要
本發明公開了一種純化和/或鑒別大量相關化合物的HPLC方法,例如,被制備用于組合庫的化合物。化合物的純化在半制備或制備規模,能夠在很少的操作下迅速制備組合庫,并優選純度大于大約90%。
文檔編號G01N30/04GK1287109SQ00121538
公開日2001年3月14日 申請日期2000年8月10日 優先權日1999年8月10日
發明者亞萊·阿茲米·阿貝迪 申請人:安萬特作物科學公司